Vi presenterar en metod speciellt skräddarsydd för att avbilda hela hjärnan hos vuxna Drosophila under beteende och som svar på stimuli. Huvudet är placerat för att ge optisk åtkomst till hela hjärnan, medan flugan kan flytta benen och antennerna, spetsen på proboscisen och ögonen kan ta emot sensoriska stimuli.
Vi presenterar en metod som utvecklats specifikt för att avbilda hela Drosophila hjärnan under pågående beteende såsom promenader. Huvudfixering och dissekering är optimerade för att minimera deras inverkan på beteendet. Detta uppnås först genom att använda en hållare som minimerar rörelsehinder. Baksidan av flughuvudet är limmat på denna hållare i en vinkel som ger optisk åtkomst till hela hjärnan samtidigt som flugans förmåga att gå, grooma, lukta, smaka och se bibehålls. Baksidan av huvudet dissekeras för att ta bort vävnader i den optiska vägen och muskler som ansvarar för huvudrörelser. Flughjärnan kan därefter avbildas för att registrera hjärnaktivitet, till exempel med hjälp av kalcium- eller spänningsindikatorer, under specifika beteenden som promenader eller grooming, och som svar på olika stimuli. När den utmanande dissekeringen, som kräver betydande övning, har bemästrats, tillåter denna teknik att registrera rika datauppsättningar som relaterar hela hjärnaktivitet till beteende- och stimulanssvar.
Imaging hjärnaktivitet med olika tekniker har fördjupat förståelsen av hjärnans funktion. Hos människor har hjärnavbildningstekniker viktiga begränsningar: medan funktionell magnetisk resonanstomografi (fMRI) erbjuder spatio-temporal upplösning långt under en enda neuronupplösning, tillåter snabba tekniker som elektroencefalografi (EEG) endast indirekt och partiell åtkomst till hjärnan1. I tillräckligt stora djurmodeller som gnagare tillåter registrering av fluorescerande aktivitetssensorer (t.ex. GCaMP) med hjälp av huvudmonterade mikroskop att observera hjärnaktivitet medan djuret rör sig i sin miljö2. Ändå ger dessa tekniker för närvarande endast tillgång till en liten del av hjärnan. Huvud-fixerade djur kan avbildas mer omfattande, men täckningen är fortfarande partiell (t.ex. cortexytan3). Det är bara hos små djur, som zebrafisklarverna, C. elegans och Drosophila som hela hjärnan kan avbildas med temporal och rumslig upplösning på nivån eller nära enstaka nervceller4.
D. melanogaster är särskilt lovande eftersom den länge har använts som en genetisk modellorganism5 och kraftfulla genetiska verktyg har utvecklats6. Kompletterat med det nya storskaliga anatomiska nätverket som härrör från elektronmikroskopi7,kan flugan ge unika möjligheter att studera komplex hjärndynamik som genereras på ett storskaligt nätverk8. Även om nagelband inte är transparent, och måste därför tas bort för att avbilda hjärnan, har in vivo funktionell avbildning blivit allt vanligare sedan den första studien 20029 och flera protokoll har redan publicerats. Men dessa metoder innebär att antingen separera flughuvudet från kroppen10, kraftigt begränsa flugans rörelser och / eller svar på stimuli11,12,13,14,15, eller endast tillåta en liten del av hjärnan som ska avbildas9,16,25,26,27,17,18,19,20,21,22,23,24. För att komplettera dessa ändå kraftfulla tillvägagångssätt utvecklade vi nyligen en förberedelse för att avbilda hela hjärnan under beteende och svar på olika stimuli28.
Här bygger vi vidare på denna studie för att presentera en metod som är speciellt utvecklad för att avbilda hela hjärnan medan flugan utför semi-naturalistiskt beteende (dvs. promenader och grooming) och svarar på sensoriska stimuli. Detta uppnås genom att använda en observationshållare utformad för att ge tillgång till hela hjärnan från den rygg-bakre sidan, samtidigt som antennerna och proboscisen är intakta och tillåter flugan att flytta benen för att gå (t.ex. på en luftdämpad boll). Steg för dissekering av bakhuvudet har förfinats för hastighet, reproducerbarhet och för att minimera deras inverkan på flugans livskraft och rörlighet.
Drosophila är ett av de sällsynta vuxna djuren där hela hjärnan kan avbildas under komplexa beteenden. Här presenterar vi en metod för att förbereda flugan och exponera hela hjärnan för bild pågående hela hjärnaktiviteten. Flera viktiga punkter bör noteras.
Att dissekera ett litet djur som D. melanogaster är utmanande. Metoden kräver alltså mycket övning och tålamod för att behärska den. Efter träningen tar dock proceduren mindre än 30 minuter och ger reproducerbara resultat.
Metoden vi presenterade har ytterligare begränsningar. För det första leder lutning av flughuvudet från sin naturliga position till att sträcka nacken som kan vara skadlig för bindväv, nerver eller muskler. För det andra, även om den ventrala subesofaguszonen (SEZ) är optiskt tillgänglig, är den under den halvtransparenta matstrupen, vilket minskar intensiteten och upplösningen i detta område. Slutligen, även om hållaren är utom räckhåll i de flesta riktningar, inser flugan fortfarande ibland sin närvaro och trycker på den för att försöka fly.
Trots dessa begränsningar kommer de omfattande data som erhålls från hel hjärnbildande under beteende och svar på stimuli att göra det möjligt att dechiffrera hjärnans funktion på nivån för hela nätverket när djuret interagerar med och navigerar komplexa, naturalistiska miljöer.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Heidi Miller-Mommerskamp för teknisk hjälp och Iveth Melissa Guatibonza Arevalo för hjälpsamma kommentarer om manuskriptet. De första versionerna av protokollet utvecklades i Ralph Greenspans laboratorium. Detta arbete stöddes av den tyska forskningsstiftelsen (DFG), särskilt genom ett bidrag FOR2705 (TP3) till IGK, och av Simons foundation (Aimon – 414701) och Kavli Institute for Brain and Mind (bidragsnummer #2017-954) som SA fick.
#5 forceps | FST by DUMONT | 11252-30 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long |
#55 forceps | FST by DUMONT | 11255-20 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long |
30x oculars | yegren | WF30-9-30-H | WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle |
AHOME/UV flashlight | Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd | B07V2W9543 (ASIN) | 365 nm |
Fotoplast Gel/UV Glue | Dreve Otoplastik GmbH | 44791 | GHS07, GHS08 |
Gloss Finish Transparent Tape | 3M Scotch | ||
KIMTECH Science/Precision wipes | Kimberly-Clark Professional | 7552 | 11 x 21 cm |
KL 1500 LCD/Microscope light | Schott | ||
Leica MS5 Microscope | Leica | WF30X/9 | |
Nail Lacqueur | Opi Products Inc., N. Hollywood | 6306585338 | black |
Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose | Sigma Aldrich | ||
Scalpel | Werner Dorsch GmbH | 78 621; B07SXCXWFS (ASIN) | soft handle |
Vacuum grease | Dow corning | 0020080 /100 gr | Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g |