포유류 세포에서 인트로닉 마이크로RNA 성숙을 분석하기 위한 리포터 분석
Summary
우리는 네 개의 플라스미드를 가진 시험관 내에서 세포에서 사용되는 인트로닉 마이크로RNA 생물발생 리포터 어세이를 개발하였다: 하나는 인트로닉 miRNA를 가지고 있고, 하나는 표적을 가지고 있고, 다른 하나는 조절 단백질을 과발현하기 위해, 다른 하나는 레닐라 루시페라제이다. miRNA를 처리하고, 표적 서열에 결합함으로써 루시퍼라제 발현을 조절할 수 있었다.
Abstract
마이크로RNA(miRNAs)는 진핵생물에 널리 퍼져 있는 짧은 RNA 분자이다. 대부분의 miRNA는 인트론으로부터 전사되며, 이들의 성숙은 핵에서 상이한 RNA 결합 단백질을 포함한다. 성숙한 miRNA는 종종 유전자 침묵을 매개하며, 이것은 전사 후 사건을 이해하는 데 중요한 도구가되었습니다. 그 외에도, 그것은 유전자 치료를위한 유망한 방법론으로 탐구 될 수 있습니다. 그러나, 현재 포유동물 세포 배양물에서 miRNA 발현을 평가하기 위한 직접적인 방법이 부족하다. 여기에서는 표적 서열과의 상호작용의 확인을 통해 miRNA 생물발생 및 성숙을 결정하는 데 도움이 되는 효율적이고 간단한 방법을 설명한다. 또한, 이 시스템은 일차 miRNA(pri-miRNA) 전사를 고효율 및 저비용으로 제어할 수 있는 독시사이클린-유도성 프로모터를 사용하여 그의 내인성 활성으로부터 외인성 miRNA의 성숙을 분리할 수 있게 한다. 이 도구는 또한 별도의 플라스미드에서 RNA 결합 단백질로 조절을 허용한다. 다양한 상이한 miRNAs 및 이들의 각각의 표적과의 그의 용도 이외에도, 이들은 형질감염에 적합할 수 있는 한, 상이한 세포주에 적응될 수 있다.
Introduction
전구체 mRNA 스플라이싱은 진핵생물1에서 유전자 발현 조절을 위한 중요한 과정이다. 성숙한 RNA에서 인트론의 제거와 엑손의 연합은 100개 이상의 단백질 2,3과 함께 5개의 snRNA(U1, U2, U4, U5 및 U6)로 구성된 2메가달톤 리보뉴클레오단백질 복합체인 스플라이시오좀에 의해 촉매된다. 스플라이싱 반응은 공동-전사적으로 발생하고, 스플라이세오좀은 엑손-인트론 경계 및 인트론4 내에서 보존된 스플라이스 부위의 인식에 의해 유도되는 각각의 새로운 인트론에서 조립된다. 다른 인트론은 스플라이 케오솜 복합체와 그 구성 요소의 놀라운 보존에도 불구하고 다른 접합 속도를 가질 수 있습니다. 스플라이스 부위 보존의 차이 외에도, 인트론 및 엑손에 분포된 조절 서열은 RNA 결합 단백질(RBP)을 안내하고 스플라이싱 5,6을 자극하거나 억제할 수 있다. HuR은 유비쿼터스하게 발현된 RBP이며, mRNA 안정성을 조절하는데 중요한 인자이다7. 우리 그룹의 이전 결과는 HuR이 miRNA를 포함하는 인트론에 결합 할 수 있음을 보여 주었고,이 단백질이 miRNA 처리 및 성숙을 촉진하는 중요한 요소가 될 수 있음을 나타내며 대체 접합 이소폼 6,8,9의 생성으로 이어졌습니다.
많은 마이크로RNA(miRNAs)는 인트로닉 서열로부터 코딩된다. 일부는 인트론의 일부인 반면, 다른 일부는 “미르트론”으로 알려져 있으며 전체 인트론10,11에 의해 형성됩니다. miRNAs는 길이 12에서 18 내지 24 뉴클레오티드 범위의 짧은 비코딩 RNA이다. 이들의 성숙 서열은 mRNAs에서 표적 서열과 부분적 또는 전체 상보성을 보여주며, 따라서 번역 및/또는 mRNA 붕괴율에 영향을 미친다. miRNA와 표적의 조합은 세포를 다른 결과로 이끈다. 몇몇 miRNA는 세포를 프로- 또는 항-종양 표현형(13)으로 구동시킬 수 있다. 종양원성 miRNA는 일반적으로 억제 특성을 유발하는 mRNA를 표적으로 하여, 증가된 세포 증식, 이동 및 침윤(14)을 유도한다. 한편, 종양-억제 miRNA는 증가된 세포 증식과 관련된 종양원성 mRNA 또는 mRNA를 표적으로 할 수 있다.
miRNA의 처리 및 성숙은 또한 그들의 기원에 의존한다. 대부분의 인트로닉 miRNA는 마이크로프로세서의 참여로 처리되며, 리보뉴클레아제 드로샤 및 단백질 보조인자(12)에 의해 형성된다. Mirtrons는 Drosha15와 독립적으로 스플라이 커오좀의 활성으로 처리됩니다. 인트론 내에서 발견되는 miRNA의 높은 빈도를 고려할 때, 우리는 스플라이싱과 관련된 RNA 결합 단백질이 또한 이러한 miRNA의 처리 및 성숙을 촉진 할 수 있다고 가정했습니다. 특히, RBP hnRNP A2/B1은 이미 마이크로프로세서 및 miRNA 생물발생(16)과 연관되었다.
우리는 이전에 hnRNP 및 HuR과 같은 여러 RNA 결합 단백질이 질량 분광법17에 의해 인트로닉 miRNA와 관련이 있다고보고했습니다. miR-17-92 인트로닉 클러스터로부터의 miRNAs와의 HuR’s (ELAVL1) 연관성은 면역침전 및 실리코 분석9를 사용하여 확인하였다. miR-17-92는 상이한 암18,19에서 증가된 발현을 갖는 6개의 miRNA로 구성된 인트로닉 miRNA 클러스터이다. 이 클러스터는 또한 “oncomiR-1″로 알려져 있으며, miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b 및 miR-92a로 구성된다. HuR의 증가된 발현은 miR-19a 및 miR-19b 합성 9를 자극한다. 이 클러스터를 둘러싸고 있는 인트로닉 영역이 HuR과 연관되어 있기 때문에, 우리는 이 단백질이 miR-19a 및 miR-19b 발현 및 성숙을 조절할 수 있는지 조사하는 방법을 개발했다. 우리의 가설에 대한 한 가지 중요한 예측은 조절 단백질로서 HuR이 miRNA 생물발생을 촉진하여 표현형 변화를 일으킬 수 있다는 것입니다. 한 가지 가능성은 miRNA가 HuR의 자극에 의해 처리되었지만 성숙하고 기능적이지 않으므로 단백질의 효과가 표현형에 직접적인 영향을 미치지 않는다는 것입니다. 따라서 우리는 HuR과 같은 RBP가 인트로닉 miRNA의 생물 발생 및 성숙에 영향을 줄 수 있는지 여부를 조사하기 위해 접합 리포터 분석을 개발했습니다. miRNA 처리 및 성숙을 확인함으로써, 우리의 분석은 표적 서열과의 상호작용 및 성숙하고 기능적인 miRNA의 생성을 보여준다. 우리의 분석에서, 우리는 배양 된 세포에서 miRNA 표적 결합을 확인하기 위해 인트로닉 miRNA 클러스터의 발현을 루시퍼라제 플라스미드와 결합시킵니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pre-mRNA 스플라이싱은 유전자 발현 조절을 위한 중요한 과정이며, 그의 조절은 세포 표현형 변형(22,23)에 강한 효과를 촉발시킬 수 있다. miRNA의 70 % 이상이 인간의 인트론에서 전사되며, 우리는 조절 단백질24,25를 접합함으로써 처리 및 성숙이 촉진 될 수 있다고 가정했습니다. 우리는 배양된 세포에서 인트로닉…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 HeLa-Cre 세포와 pRD-RIPE 및 pCAGGS-Cre 플라스미드에 대한 E. Makeyev (싱가포르 난양 기술 대학)에게 감사하고 있습니다. Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes 및 Anselmo Moriscot의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Recombinant DNA | |||
| pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pFLAG-HuR | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-RAP-IB | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-scrambled | Generated during this work | ||
| pRD-miR-17-92 | Generated during this work | ||
| pRD-RIPE-donor | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pTK-Renilla | Promega | E2241 | |
| Antibodies | |||
| anti-B-actin | Sigma Aldrich | A5316 | |
| anti-HuR | Cell Signaling | mAb 12582 | |
| IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG | Li-Cor Biosciences | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG | Li-Cor Biosciences | 929-70020 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HeLa-Cre | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| HeLa-Cre miR17-92 | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-scrambled | Generated during this work | ||
| Chemicals and Peptides | |||
| DMEM/high-glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800-017 | |
| Doxycycline | BioBasic | MB719150 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | ER0271 | |
| EcoRV | Thermo Fisher Scientific | ER0301 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | E859-EG | |
| L-glutamine | Life Technologies | ||
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| pFLAG-CMV™-3 Expression Vector | Sigma Aldrich | E6783 | |
| pGEM-T | Promega | A3600 | |
| Platinum Taq DNA polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10966-030 | |
| pmiR-GLO | Promega | E1330 | |
| Puromycin | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNAse OUT | Thermo Fisher Scientific | 752899 | |
| SuperScript IV kit | Thermo Fisher Scientific | 18091050 | |
| Trizol-LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | |
| trypsin/EDTA 10X | Life Technologies | 15400-054 | |
| XbaI | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
| XhoI | Promega | R616A | |
| Oligonucleotides | |||
| forward RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT |
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| reverse RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
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| forward scrambled pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT |
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| reverse scrambled pmiRGLO | Exxtend | CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
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| forward HuR pFLAG | Exxtend | GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC |
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| reverse HuR pFLAG | Exxtend | GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG |
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| forward pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG |
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| reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG |
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| forward snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC | |
| reverse snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG | |
| forward B-Actin qPCR | Exxtend | ACCTTCTACAATGAGCTGCG | |
| reverse B-Actin qPCR | Exxtend | CCTGGATAGCAACGTACATGG | |
| forward HuR qPCR | Exxtend | ATCCTCTGGCAGATGTTTGG | |
| reverse HuR qPCR | Exxtend | CATCGCGGCTTCTTCATAGT | |
| forward pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG |
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| reverse pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG |
|
| Software and Algorithms | |||
| Prism 8 for Mac OS X | Graphpad | https://www.graphpad.com | |
| ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij |
Referencias
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