Un ensayo reportero para analizar la maduración intrónica de microARN en células de mamíferos

El empalme de ARNm precursor es un proceso importante para la regulación de la expresión génica en eucariotas¹. La eliminación de intrones y la unión de exones en ARN maduro es catalizada por el espliceosoma, un complejo ribonucleoproteico de 2 megadaltones compuesto por 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 y U6) junto con más de 100 proteínas ^2,3. La reacción de empalme ocurre co-transcripcionalmente, y el espliceosoma se ensambla en cada nuevo intrón guiado por el reconocimiento de los sitios de empalme conservados en los límites exón-intrón y dentro del intrón⁴. Diferentes intrones pueden tener diferentes velocidades de empalme a pesar de la notable conservación del complejo de espliceosoma y sus componentes. Además de las diferencias en la conservación del sitio de empalme, las secuencias reguladoras distribuidas en intrones y exones pueden guiar las proteínas de unión al ARN (RBP) y estimular o reprimir el empalme ^5,6. HuR es una RBP expresada ubicuamente y es un factor importante para controlar la estabilidad del ARNm⁷. Resultados previos de nuestro grupo mostraron que HuR puede unirse a intrones que contienen miRNAs, lo que indica que esta proteína podría ser un factor importante para facilitar el procesamiento y la maduración de miRNA, lo que también conduce a la generación de isoformas de empalme alternativas ^6,8,9.

Muchos microARN (miARN) se codifican a partir de secuencias intrónicas. Mientras que algunos son parte del intrón, otros se conocen como "mirtrones" y están formados por todo el intrón^10,11. Los miRNAs son ARN cortos no codificantes, que van de 18 a 24 nucleótidos de longitud¹². Su secuencia madura muestra complementariedad parcial o total con las secuencias diana en los ARNm, lo que afecta a las tasas de traducción y/o decaimiento del ARNm. Las combinaciones de miARN y dianas conducen a la célula a diferentes resultados. Varios miRNAs pueden conducir células a fenotipos pro o antitumorales¹³. Los miARN oncogénicos generalmente se dirigen a ARNm que desencadenan una característica supresora que conduce a un aumento de la proliferación, migración e invasión celular¹⁴. Por otro lado, los miARN supresores de tumores podrían dirigirse a ARNm oncogénicos o ARNm relacionados con el aumento de la proliferación celular.

El procesamiento y la maduración de los miRNAs también dependen de su origen. La mayoría de los miRNAs intrónicos son procesados con la participación del microprocesador, formado por la ribonucleasa Drosha y los cofactores proteicos¹². Los mirtrones se procesan con la actividad del espliceosoma independientemente de Drosha¹⁵. Teniendo en cuenta la alta frecuencia de miARN que se encuentran dentro de los intrones, planteamos la hipótesis de que las proteínas de unión al ARN involucradas con el empalme también podrían facilitar el procesamiento y la maduración de estos miARN. En particular, el RBP hnRNP A2/B1 ya se ha asociado con el microprocesador y la biogénesis del miARN¹⁶.

Hemos informado previamente que varias proteínas de unión a ARN, como hnRNPs y HuR, están asociadas con miRNAs intrónicos por espectrometría de masas¹⁷. La asociación de HuR (ELAVL1) con miRNAs del cluster intrónico miR-17-92 fue confirmada mediante inmunoprecipitación y análisis in silico ⁹. miR-17-92 es un grupo de miARN intrónico compuesto por seis miARN con mayor expresión en diferentes cánceres^18,19. Este grupo también se conoce como "oncomiR-1" y está compuesto por miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b y miR-92 a. miR-19 a y miR-19b se encuentran entre los miRNAs más oncogénicos de este grupo 19. El aumento de la expresión de HuR estimula la síntesis de miR-19a y miR-19b ⁹. Dado que las regiones intrónicas que flanquean este grupo están asociadas con HuR, desarrollamos un método para investigar si esta proteína podría regular la expresión y maduración de miR-19a y miR-19b. Una predicción importante de nuestra hipótesis fue que, como proteína reguladora, HuR podría facilitar la biogénesis de miRNA, dando lugar a alteraciones fenotípicas. Una posibilidad era que los miRNAs fueran procesados por la estimulación de HuR pero no fueran maduros y funcionales y, por lo tanto, los efectos de la proteína no impactaran directamente en el fenotipo. Por lo tanto, desarrollamos un ensayo de splicing reporter para investigar si un RBP como HuR podría afectar la biogénesis y la maduración de un miRNA intrónico. Al confirmar el procesamiento y la maduración del miARN, nuestro ensayo muestra la interacción con la secuencia objetivo y la generación de un miARN maduro y funcional. En nuestro ensayo, acoplamos la expresión de un grupo de miARN intrónico con un plásmido luciferasa para verificar la unión al objetivo de miARN en células cultivadas.

En la figura 1 se muestra una descripción general del protocolo descrito aquí.

1. Construcción de plásmidos

1. pCAGGS-Cre: Este plásmido fue proporcionado por el Dr. E. Makeyev²¹.
2. pRD-miR-17-92:
   1. Amplíe el pre-miR-17-92 por PCR utilizando 0,5 μM de cada cebador específico (Tabla de materiales), 150 ng de ADNc, 1 mM dNTPs, 1x tampón Taq PCR y 5 U de ADN polimerasa Taq de alta fidelidad. Realice una reacción de PCR de control sin plantilla (use agua en lugar de ADNc) para verificar la contaminación del ADN.
   2. Ligue el producto de PCR en pRD-RIPE (amablemente proporcionado por el Dr. E. Makeyev, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur)²¹ dentro del intrón entre los sitios de restricción EcoRI y EcoRV utilizando ADN ligasa, creando pRD-miR-17-92. Confirme la integridad de la secuencia mediante la secuenciación de Sanger.
3. pmiRGLO-RAP-IB
   1. Diseñe cebadores delanteros e inversos flanqueados por sitios de restricción XhoI / XbaI y con un sitio de restricción NotI en el interior. Mezclar cantidades equimolares de cebadores directos e inversos e incubar la mezcla a 90 °C durante 5 min, luego transferir a 37 °C durante 15 min. Como controles, use cebadores con secuencias de objetivos codificadas (Tabla de materiales).
   2. Dividir los fragmentos recocidos usando enzimas de restricción XhoI/XbaI y ligarlos aguas abajo de la secuencia luc2 en pmiR-GLO, generando construcciones reporteras pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) y pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled). Confirmar la ligadura con escote NoI.
      NOTA: Asegúrese de que los voladizos creados después del recocido de cebador sean complementarios al vector después de la reacción de escisión.
4. pFLAG-HuR
   1. Para generar un plásmido de sobreexpresión de HuR, amplíe la secuencia de HuR con cebadores específicos. Mezcle 300 ng de ADNc, 0,5 μM de cada cebador específico, 1 mM de mezcla de dNTPs, 1x tampón de PCR y 5 U de ADN polimerasa Taq de alta fidelidad.
   2. Ligate el producto de PCR en pGEM-T y confirma la integridad de la secuencia de ADN mediante secuenciación de Sanger. Elimine el fragmento HuR de pGEM-T y subclónelo en el vector de expresión de mamíferos pFLAG-CMV-3 para generar el vector pFLAG-HuR.

2. Cultivo celular

NOTA: La línea celular HeLa-Cre fue un regalo del Dr. E. Makeyev²¹, y la célula de cáncer papilar de tiroides (BCPAP) fue amablemente proporcionada por el Dr. Massimo Santoro (Universidad "Federico II", Nápoles, Italia). Las células HeLa, las células papilares de cáncer de tiroides (BCPAP) y HEK-293T se utilizaron para sobreexpresar HuR.

1. Mantener las células en DMEM/glucosa alta suplementada con suero bovino fetal al 10%, piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 200 mM y 1x penicilina-estreptomicina (100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina) en placas de Petri de 100 mm, a menos que se indique lo contrario. Incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificada en atmósfera controlada (5%_CO2).
2. Incubar las células adherentes con tripsina/EDTA (mezcla de solución al 0,5%) a 37 °C durante 3-5 min. Déjelos separarse de la placa (el período de incubación puede variar según el tipo de célula).
3. Realice las transfecciones con un reactivo de transfección a base de lípidos siguiendo las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que los cultivos celulares sean aproximadamente 70% confluentes. Use cantidades similares de ADN para todas las combinaciones de transfección, como se describe a continuación, agregando los ADN apropiados. Realizar experimentos de transfección en réplicas.
   1. Mezclar 200 ng de ADN y 1,25 μL de reactivo de transfección en 100 μL del medio de cultivo. Agregue la mezcla de transfección a las células. Incubar las células con las mezclas de transfección durante 4 h a 37 °C. Luego, reemplace el medio con un medio que contenga 10% de FBS e incube durante otras 24 h antes de agregar los antibióticos para la selección.

3. Sobreexpresión de HuR

1. Transfecte pFLAG-HuR y vacíe pFLAG en HeLa. Seleccionar células aumentando la concentración de genética (G418) (1 μg/mL) de 100 μg/mL a 1000 μg/mL, generando líneas celulares estables.
2. Confirme la sobreexpresión con PCR cuantitativa utilizando cebadores específicos para el ARNm de HuR, como se describe en el paso 7.

4. Aislamiento total de ARN

1. Use celdas recién recolectadas. Tripsinizar al 70% de cultivos celulares confluentes (para este ensayo, se utilizaron células HeLa-Cre), como se describe en el paso 2.2.
2. Recoger el pellet celular por centrifugación durante 5 min a 500 x g a 4 °C y lavarlo con 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato); Repita la centrifugación.
3. Resuspender el pellet celular en 1 ml de 1x PBS y transferirlo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C.
5. Pese el pellet de celda seca y ajuste los volúmenes y el tamaño de los tubos en consecuencia. 1 mg de células produce aproximadamente 1 μg de ARN total.
6. En una campana, agregue 500-1,000 μL de fenol / cloroformo al pellet celular (idealmente 750 μL por 0.25 g de células) y homogeneícelo pipeteando hacia arriba y hacia abajo y mezclándolo con el vórtice.
7. Incubar la mezcla durante 5 min a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C) para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteínas.
8. Centrifugar la muestra a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
9. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añada 200 μL de cloroformo por 1 ml de fenol:cloroformo utilizado. Tapa los tubos de muestra de forma segura.
10. Mezclar vigorosamente durante 15 s (a mano o brevemente vórtice a una velocidad más baja) e incubar a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C) durante 2 min a 3 min.
11. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
12. Compruebe la presencia de una fase inferior de fenol-cloroformo rojo, una fase intermedia y una fase acuosa superior incolora. El ARN permanece en la fase acuosa superior. En una campana, recoger la fase acuosa, evitando entrar en contacto con la fase intermedia, y transferir a un tubo nuevo.
13. Precipitar ARN mezclando la fase acuosa con 400 μL de isopropanol de grado molecular (relación 1:1 a fenol/cloroformo utilizado) y 2 μL de glucógeno en cada tubo (ayudará a visualizar la presencia del pellet).
14. Mezclar vigorosamente a mano u homogeneizar con la punta durante ~10 s. Incubar durante 15 min o durante la noche a -20 °C.
15. Centrifugar la muestra a 12.000 g durante 20 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
16. Lave el pellet de ARN agregando 3 volúmenes de etanol al 100% (aproximadamente 1 ml, diluido con agua DEPC) y mezcle la muestra mediante vórtice hasta que el pellet se libere y flote desde el fondo.
17. Centrifugar a 7.500 x g durante 5 min a 4 °C.
18. Lave el pellet de ARN 1x agregando 1 ml de etanol al 75% y mezcle la muestra por vórtice hasta que el pellet se libere y flote desde el fondo. Repita la centrifugación como se describe en el paso 4.17.
19. Realice un centrifugado adicional de 5 s para recoger el líquido residual del lado del tubo y eliminar cualquier líquido residual con una pipeta sin alterar el pellet.
20. Seque brevemente al aire el pellet de ARN abriendo la tapa del tubo a temperatura ambiente durante 3-5 minutos y disuelva el pellet de ARN en 20-50 μL de agua tratada con DEPC libre de RNasa. Incubar el ARN durante 10 min a 55-60 °C para facilitar la resuspensión del pellet.

5. Determinación de la concentración y calidad total de ARN

1. Determinar la concentración de ARN midiendo la absorbancia a 260 nm y 280 nm utilizando un espectrofotómetro. Obtenga datos espectrales completos antes de utilizar las muestras en aplicaciones posteriores.
2. Controle la calidad del ARN resolviendo 800-1000 ng en un gel de agarosa al 1,5% utilizando tampón TBE 0,5X (45 mM de base Tris, 45 mM de ácido bórico, 1 mM de EDTA). El ARN total se separa en dos bandas que se refieren a los ARNr 28S y 18S.
   1. Haga todos los reactivos y lave todo el equipo utilizado para hacer funcionar el gel con agua tratada con DEPC. El agua tratada con DEPC se prepara en la campana agregando 1 ml de dietilpirocarbonato a 1000 ml de agua ultrapura. Incubar durante ~2 h a temperatura ambiente o a 37 °C y en autoclave. Guarde este producto a temperatura ambiente hasta por 10 meses.
      NOTA: La electroforesis de los ARN totales de mamíferos conduce a la separación de los ARNr 28S y 18S en una proporción de aproximadamente 2:1. Las bandas deben estar intactas y visibles como dos bandas afiladas. El ARN degradado dará lugar a bandas borrosas.

6. Transcripción inversa

1. Establezca la reacción de transcripción inversa utilizando 1 μg de ARN total.
2. Realizar la transcripción inversa (RT) utilizando la enzima transcriptasa inversa (consulte la Tabla de materiales) y cebadores decámeros aleatorios de 50 ng/μL.
   1. Mezclar ARN, cebadores aleatorios y 1 mM de mezcla de dNTP (10 mM) en 10 μL. Incubar a 65 °C durante 5 min y en hielo durante 1 min. Agregue los siguientes reactivos: 1x tampón RT, 5 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 40 U de inhibidor de RNasa y 200 U de transcriptasa inversa.
   2. Incubar durante 10 min a 25 °C y durante 1 h a 50 °C (las temperaturas pueden cambiar si se utilizan diferentes enzimas). Terminar la reacción incubando a 85 °C durante 5 min. Los ADNc se pueden almacenar a -20 °C.

7. PCR cuantitativa

1. Para ensamblar la reacción en un volumen final de 15 μL, mezcle 3 μL de ADNc (100 ng / μL), 3.2 pmol de cada cebador, 6 μL de mezcla maestra que contenga los dNTP y la enzima, y 2.8 μL de agua ultrapura.
   NOTA: Utilice cebadores para genes constitutivos endógenos como controles (genes de limpieza) para normalizar los niveles de expresión de ARNm y miARN de HuR. β-Actina y snRNA U6 (RNU6B) son opciones disponibles para la normalización de ARNm y miRNAs, respectivamente, pero otros genes también pueden ser adecuados dependiendo del caso.
2. Cuantificar los niveles de expresión utilizando el método delta-delta Ct (2-ΔΔCt)²⁰.

8. El ensayo del reportero

1. Células utilizadas para el ensayo
   1. Transfectar los plásmidos en células HeLa-Cre de la siguiente manera. Transfecto con pTK-Renilla (40 ng), luego pRD-miR-17-92, generando HeLa-Cre-miR-17-92, y seleccionando con 1 μg/mL de puromicina.
   2. Transfecto HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla con pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR o pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR, por separado. Seleccione el uso de penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL). Estas transfecciones generan Luc-RAP-1-B y Luc-scrambled.
   3. Transfecte las celdas con pFLAG-HuR o pFLAG vacío (paso 3).
   4. Proceder al cultivo celular, como se detalla en el paso 2.2., con HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-codificado, HeLa-Cre miR-17-92-HuR y HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc hasta aproximadamente el 80% de la confluencia. Inducir con 1 μL de doxiciclina (1 μg/ml) durante 30 min a 37 °C. Además, mantenga todas las células sin doxiciclina como controles, durante el mismo período.
      NOTA: La concentración final de doxiciclina depende de la línea celular de elección. Un exceso de doxiciclina puede ser tóxico para las células de mamíferos.
2. Ensayo luminiscente
   1. Para cuantificar y comparar diferentes intensidades de luminiscencia, utilice el kit de ensayo Dual-luciferase reporter. Descongele las soluciones de ensayo de luciferasa y déjelas a temperatura ambiente antes de comenzar el ensayo.
   2. Prepare la mezcla Stop y Glo (tubos de tapa azul) mezclando 200 μL del sustrato en 10 ml de tampón II del ensayo de luciferasa. Prepare la mezcla LAR II (tubos de tapa verde) mezclando 10 ml de Luciferase Assay Buffer II en el vial ámbar de Luciferase Assay Substrate II y agite bien.
   3. Transfiera las soluciones a tubos centrífugos de 15 ml previamente identificados y protegidos de la luz.
      NOTA: Como alternativa, las soluciones pueden prepararse previamente en alícuotas de 1-2 ml y congelarse a −80 °C protegidas de la luz en papel de aluminio.
   4. Realizar las lecturas de luminiscencia utilizando un equipo como Synergy; medida expresada luciferasa como unidades de luz relativa (RLU).
   5. Exporte los resultados a una hoja de cálculo para su posterior análisis estadístico.
   6. Realizar la normalización de la actividad luciérnaga-luciferasa mediante el control Renilla (luciferasa/Renilla) y trazarla como unidades de luz relativa (RLU) en un gráfico. Repita esto para grupos con y sin inducción de doxiciclina.
   7. Calcular la media y el error estándar de la media (SEM). Realice una prueba t de Student o un ANOVA bidireccional seguido de la prueba posterior de Tukey para permitir la comparación grupal. Estos análisis están disponibles en un paquete como GraphPad Prism. Las diferencias en los valores de p < 0,05 se consideran significativas.

Nuestra hipótesis inicial era que HuR podría facilitar la biogénesis intrónica de miARN al unirse a su secuencia de pre-miARN. Por lo tanto, la conexión de la expresión de HuR y la biogénesis del grupo miR-17-92 podría apuntar a un nuevo mecanismo que rige la maduración de estos miRNAs. La sobreexpresión de HuR tras la transfección de pFLAG-HuR se confirmó en tres líneas celulares diferentes: HeLa, BCPAP y HEK-293T (Figura 2). Como controles, se utilizaron células no transfectadas y células transfectadas con vectores pFLAG vacíos. Es importante destacar que observamos que la sobreexpresión de HuR en estas células estimula la expresión de miR-19a (Resultados de la Tabla Suplementaria 1 reportados en Gatti da Silva et al.9).

Para confirmar que los miRNAs inducidos eran genuinamente funcionales, se diseñó un sistema informador in vitro , como se describe aquí. El intrón artificial en pRD-RIPE separa dos regiones codificantes de eGFP. Este casete está bajo el control de un elemento sensible a la tetraciclina (TRE). La expresión de eGFP está, por lo tanto, controlada por la presencia del antibiótico doxiciclina (DOX) en el medio celular (Figura 3).

Una búsqueda in silico utilizando miRbase y TargetScan reveló posibles objetivos de ARNm para miR-19 a y miR-19 b (componentes del grupo miR-17-92). Como objetivo potencial para ambos miRNAs, se eligió la secuencia 5' TTTGCACA 3', encontrada en la región RAP-IB 3' UTR (Tabla Suplementaria 2). RAP-IB es un miembro GTPasa de la familia de proteínas asociadas a Ras (RAS). Los miRNAs inducidos se procesaron correctamente y fueron funcionales en nuestro ensayo, ya que se hibridaron a la secuencia diana clonada junto a la luciferasa (ver Figura 3, objetivo pmiR-GLO). Por lo tanto, bloqueó la traducción de luciferasa, lo que se reflejó en una actividad reducida de la luciferasa (Figura 3). Como control para este ensayo, codificamos la secuencia objetivo, reemplazándola por 5' GGGTAAA 3' en plásmido codificado de Luc (las secuencias objetivo y codificadas están subrayadas en las secuencias oligos en la Tabla de materiales).

En condiciones regulares y sin inducción del plásmido pRD-miR-17-92, miR-19a y/o miR-19b endógenos encontraron el objetivo en pmiR-GLO, lo que condujo a una actividad reducida de la luciferasa (datos no mostrados). Después de la suplementación con DOX, se observó una reducción leve y no estadísticamente significativa en la actividad de la luciferasa en células con una secuencia objetivo codificada. Esto podría deberse a la presencia de secuencias diana para otros miARN en esta secuencia. Se observó una fuerte reducción en la actividad de la luciferasa con RAP-IB 3'UTR tras el aumento de la expresión de miR-19 a y miR-19 b de pRD-miR-17-92en comparación con las células HeLa-Cre(ver Figura 4, comparar barras naranjas y negras). La transfección de pFLAG-HuR en estas células por sí sola no cambió la actividad de la luciferasa (ver Figura 4, comparar barras grises y negras). Sin embargo, la sobreexpresión de HuR junto con la suplementación con doxiciclina, estimulando la expresión del grupo miR-17-92, redujo aún más la actividad de la luciferasa (ver Figura 4, comparar barras grises y rojas). Esto indica una regulación positiva de HuR sobre miR-19 a y miR-19 b, junto con el correcto procesamiento y maduración de estos miRNAs, que fueron capaces de encontrar con éxito sus objetivos (HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc) (ver Figura 4).

El uso de este sistema reportero confirmó que HuR induce la expresión y maduración adecuada de miR-19 a y miR-19b en células HeLa.

Figura 1: Una descripción general conceptual del protocolo descrito aquí. Los plásmidos que contienen miARN, secuencia diana, proteína reguladora y pTK-Renilla se transfectaron en células cultivadas. Después de la selección de antibióticos, estas células se utilizaron para inducir la expresión de miARN (con doxiciclina), con la posterior cuantificación de la actividad de la luciferasa, y para el análisis de ARN para confirmar la sobreexpresión de HuR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Confirmación de la sobreexpresión de FLAG-HuR en células (A) HeLa, (B) BCPAP y (C) HEK293T mediante qPCR. Se utilizó como control la transfección con pFLAG vacío (barras blancas). Se utilizó β-actina para normalizar los valores de Ct. El eje y representa el cambio de pliegue de la expresión calculado después de la normalización. Las barras de error representan errores estándar calculados a partir de tres mediciones independientes. **P <0,005, ****P < 0,0005 (figura adaptada de Gatti da Silva et al.9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Sistema informador de miRNA intrónico. (A) Representación esquemática del plásmido pRD-RIPE que generó pRD-miR-17-92. pre-miR-17-92 se insertó dentro del intrón y estaba bajo el control de un promotor inducible por dox; a la derecha, el plásmido pmiR-GLO con secuencia diana RAP-IB 3'UTR (pmiRGLO-RAP-IB); el control tenía la secuencia de destino codificada (pmiRGLO-scrambled). (B) Detalle de la secuencia de pmiRGLO-RAP-IB, centrándose en la secuencia objetivo complementaria a miR-19 a y miR-19b. La actividad de la luciferasa se reduce tras la interacción del miARN y el objetivo (figura adaptada de Gatti da Silva et al.9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Las células HeLa-Cre fueron co-transfectadas con plásmidos reporteros pTK-Renilla, pmiRGLO-RAP-IB, pmiRGLO-scrambled, pRD-miR-17-92 y pFLAG-HuR. Actividad de la luciferasa en células HeLa-Cre no transfectadas (negro), HeLa-Cre miR-17-92-revuelto (blanco), HeLa-Cre-HuR (gris), HeLa-Cre miR-17-92-luc (naranja) y HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc (rojo). La actividad de la luciferasa se cuantificó como se describe en el protocolo como la actividad relativa de la luciferasa de luciérnaga a la renilla luciferasa (observada con pTK-Renilla) y se normalizó después de la adición de doxiciclina. Se muestra como "unidades de luz relativa" (RLU) en el eje y. **P < 0,005; P < 0,0005 (figura adaptada de Gatti da Silva et al.9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cuadro complementario 1: Valores de Ct bruto observados para qPCR para analizar la expresión de miR-19. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Cuadro complementario 2: Secuencia RAP-IB 3'UTR y secuencia objetivo miR-19. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Los autores no tienen conflictos de intereses.