Extracción Soxhlet de biomarcadores lípidos de sedimento

Soxhlet Extraction of Lipid Biomarkers from Sediment

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Soxhlet Extraction of Lipid Biomarkers from Sediment

3.8: An Overview of bGDGT Biomarker Analysis for Paleoclimatology

3.12: Extraction of Biomarkers from Sediments – Accelerated Solvent Extraction

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08:04 min

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February 27, 2015

Overview

Fuente: Laboratorio de Jeff Salacup – Universidad de Massachusetts Amherst

Cada laboratorio necesita normas que seguir el rendimiento, la exactitud, y precisión de sus instrumentos en el tiempo para asegurar una medición realizada hoy es lo mismo que una medición realizada al año de ahora en adelante (figura 1). Porque normas deben probar el funcionamiento de los instrumentos durante un largo período de tiempo, a menudo se requieren grandes volúmenes de las normas. Muchos estándares químicos pueden adquirirse empresas científicas por menor, como Sigma-Aldrich y Fisher. Sin embargo, algunos compuestos que ocurren en la naturaleza y que son relevantes para estudios paleoclimáticos aún no han sido aislados y purificados para la compra. Por lo tanto, estos compuestos deben ser extraídos de las muestras naturales y debido a los grandes volúmenes de estándares requeridos, grandes volúmenes de sedimento que se extrae. La extracción acelerada de disolvente (Dionex) y sonicación extracciones no son apropiadas para la extracción de tales volúmenes grandes del sedimento. En estas circunstancias, se utiliza una extracción de Soxhlet.

Figura 1. Esquema que representa cómo química estándar rastrea el rendimiento de un instrumento a través del tiempo. La línea discontinua representa una relación de 1:1 entre los aceptados y medida (en el instrumento) valor de una variable. Cada estrella es una medida semanal de calidad química. Estrellas verdes representan las normas que sean precisas. Estrellas rojas reflejan aquellos que no son exactos lo que indica que el instrumento requiere mantenimiento correctivo.

Principles

La extracción Soxhlet es probablemente la más vieja forma de extracción de materia orgánica. Evidencias arqueológicas de Mesopotamia pone el uso de un dispositivo Soxhlet-similar que utiliza agua caliente a ~ 3.500 BC^1,2. Soxhlets moderno utilizar condensadores de vidrio soplado sofisticado y solventes orgánicos en este método de extracción “continua” (figura 2). Solvente es refundir de un matraz de fondo redondo hacia arriba en un condensador con una bobina recirculación de agua fría. Cuando el solvente gaseoso entra en contacto con la bobina, se condensa en una cámara con un dedal de fibra de vidrio con la muestra. Esta cámara se encuentra con un recirculador y alcanzado un volumen determinado (generalmente un volumen lo suficientemente grande como para sumergir toda la muestra), la cámara se enjuaga nuevamente el matraz de fondo redondo por medio de un sifón incorporado, donde el extracto lipídico se acumula mientras que el solvente se convierte en parte del siguiente ciclo. Por lo tanto, la extracción de “continua” del término. Extracción Soxhlet es de uso frecuente para la extracción de más grandes (> g 10) muestras.

Figura 2. Un aparato de soxhlet.

La extracción Soxhlet es un método de aislamiento de compuestos, tales como los lípidos, de una gran cantidad de material sólido con un relativamente pequeño volumen de disolvente.

Muchos de los compuestos correspondientes a los estudios paleoclimáticos no están disponibles para la compra de compañías científicas por menor. Normas de estos compuestos por lo tanto deben estar preparadas de muestras naturales.

Se necesitan grandes cantidades de estándar para evaluar el rendimiento de un instrumento en el tiempo. Para obtener una cantidad adecuada de un biomarcador para la preparación estándar, se debe extraer un gran volumen de sedimentos.

El extractor de Soxhlet, inventado en el 1870 por Franz von Soxhlet, permite automatizado, extracción por lotes de un sólido, aumentando la eficiencia global mientras que usa una pequeña cantidad de disolvente.

Este video es parte de una serie de extracción, purificación y análisis de los sedimentos. Se ilustrará la extracción Soxhlet de biomarcadores lípidos de sedimentos marinos para el uso en paleothermometry y presentarán algunas otras aplicaciones de extracción de Soxhlet en química y Ciencias de la tierra.

Un conjunto típico utiliza un matraz, un condensador de agua fría y el aparato Soxhlet sí mismo. El sólido se extrae se coloca en un dedal en la cámara central del aparato. La extracción es ayudada por la adición de la energía en forma de calor, conocido como reflujo. El vapor del solvente se levanta a través del camino de destilación en el aparato Soxhlet en el condensador. Sobre la condensación, el solvente recoge en la cámara de disolución de la materia orgánica en el dedal. Como se llena la cámara, el sifón se llena así. Cuando el sifón está lleno, la solución fluye hacia el matraz. La solución nunca supera el nivel la parte superior del dedal, así ningún sólido entra en el frasco.

El extracto lipídico continuamente se acumula en el frasco, mientras que el solvente se convierte en parte del siguiente ciclo de extracción. Así, el ciclo se puede repetir indefinidamente sin pérdida de disolvente.

La conservación del solvente, la naturaleza continua de la extracción y la capacidad para acomodar tamaños de muestra grandes hace extracción Soxhlet ideal para aislar los compuestos orgánicos de porciones grandes de material insoluble.

Ahora que usted entiende los principios de extracción Soxhlet, Let ‘ s go mediante un procedimiento de extracción Soxhlet de biomarcadores lípidos de sedimento.

Para este experimento, se utiliza una muestra de exceso sedimentos marinos de una expedición de perforación. La muestra liofilizada, machacada y homogeneizada. Para más instrucciones, consulte el vídeo de la colección en extracción por sonicación.

Para prepararse para la extracción, primero hacer una solución de 9:1 del diclorometano metanol. Esta solución se utilizará como el solvente de extracción y para lavar los instrumentos de cristalería de laboratorio.

Para eliminar contaminantes orgánicos, quema el matraz de fondo redondo, aparato Soxhlet, dedal de fibra de vidrio y pesa latas de 6 h a 550 ° C. Lavar la solución de un matraz de fondo redondo el DCM-metanol. Una vez que esté listo para configurar la extracción, enjuague una espátula de laboratorio chips hirviendo y cinco a diez con la solución de DCM-metanol.

Para comenzar a construir el conjunto de extracción, creó un manto de calefacción en una campana de humos. Obtener un condensador, un soporte para el matraz de fondo redondo, así como el aparato de Soxhlet.

Tara una combustión peso de estaño. Con la espátula solventes enjuagados, transferir aproximadamente 50 g de muestra a la bandeja de pesaje y registrar la masa. Cargar el material en el tambor de fibra de vidrio quemado.

A continuación, completar la combustión y matraz de lavado un poco más de la mitad de la solución de DCM-metanol. Agregar los chips hirviendo lavados y colocar el matraz en el manto de calefacción.

Luego, coloque el extremo abierto del dedal de muestra arriba en la cámara del aparato Soxhlet. Conecte el aparato al matraz de fondo redondo y sujete el aparato en lugar.

Fije el condensador en la parte superior del aparato Soxhlet. Conecte la línea de agua fría para el puerto inferior del condensador con una manguera abrazadera o zip de lazo. Conecte la línea de salida al puerto superior del condensador y llevarlo hacia el desagüe.

Encienda el agua en el condensador y verificar la trayectoria del flujo. Luego, encienda el calefacción manto y calentar el disolvente a reflujo.

Como el solvente comienza la condensación, asegúrese de que el condensado gotea a la cámara y que el extracto se absorbe en el matraz de fondo redondo. El solvente debe permanecer en ebullición baja a lo largo de la extracción.

Monitor el proceso de extracción y el flujo de agua del condensador hasta que la extracción es completa. A continuación, detener la extracción apagando el manto de calefacción. Una vez que el extracto se ha enfriado, retire el condensador y el aparato de Soxhlet. Finalmente, el matraz de fondo redondo que contiene el extracto lípido total del sello y almacenar para su posterior procesamiento.

Extracción Soxhlet es de uso frecuente para el análisis químico de una muestra sólida y puede utilizarse también para la purificación y preparación de los reactivos.

Extracción de Soxhlet se puede utilizar para detectar la presencia de compuestos bifenilos policlorados, o PCB, en el medio ambiente. Se midió la eficiencia de transferencia de PCB de peces presa para los peces depredadores para obtener más información acerca de los riesgos de salud a los seres humanos y vida silvestre de comer contaminados peces. Extracción Soxhlet de tejido de peces permite preparación de muestras para cromatografía de gases y espectrometría de masas.

Los compuestos que se introduce en el medio ambiente en grandes cantidades son analizadas para la presencia de PCBs. Biochar es un subproducto de la pirólisis de materia orgánica que importa cuando se añade al suelo, puede mejorar la calidad del suelo y tomar los contaminantes. Validación de métodos de producción de biochar para uso generalizado incluye extracción Soxhlet para probar para la presencia de PCBs por cromatografía de gases.

Extracción Soxhlet también puede utilizarse para purificar un sólido por la extracción de compuestos no deseados. Ácidos grasos de cadena larga fueron removidos selectivamente de pieles de tomate por extracción gradual a la cutícula de tomate libre de cera. Se realizó la extracción gradual con varios solventes de diferentes polaridades en la sucesión. Esto no sólo proporciona la eliminación de la cera integral de la piel del tomate, sino que permitió el aislamiento de partes de cera individual basado en las características de solubilidad, así.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a extracción Soxhlet de biomarcadores lípidos de sedimentos archivo geológico. Ahora debe estar familiarizado con los principios de extracción de Soxhlet, el procedimiento de Soxhlet extracción de una muestra de sedimento y algunos ejemplos de cómo puede utilizarse la extracción Soxhlet con fines analíticos.

¡Gracias por ver!

Procedure

1. configuración y preparación de materiales

Recoge una muestra de sedimentos marinos congelados, liofilizados, triturada y homogeneizada. Una muestra como ésta contiene muchos de los compuestos necesarios para las normas.
1. Las normas se hacen a menudo de los sedimentos que se dejan después de una expedición de perforación o de análisis. Por ejemplo, en este experimento, se extrae el sedimento que se obtiene de la ‘parche de barro’, ubicada al sur de Cape Cod. Este sedimento se toma como parte de una expedición de perforación pero no se utilizará para responder preguntas científicas. Por lo tanto, podemos usarlo para hacer un estándar.
2. Coloque un trozo de ~ 100 g de sedimento en el congelador durante la noche se congela a través de.
3. El sedimento está totalmente congelado, una vez en el congelamiento del secador (disponible de muchos minoristas de equipos científicos como Fisher) y espere hasta que el condensador alcanza el valor deseado (a menudo ~-30 ° C).
4. Cargar la muestra de sedimento en la congelación de la secadora y cierre la purga para empezar a tirar de un vacío en la muestra.
5. Dependiendo de la cantidad de agua en el sedimento y el tamaño de la muestra, puede tomar varios días para la muestra a secar.
6. Una vez seca la muestra, apagar la congelación, secadora y retire la muestra.
7. Colocar la muestra en un solvente mortero lavado y molido a un polvo con un mortero. Para ello toda muestra y conservar en un tarro de cristal en el congelador hasta que esté listo para extraer.
Dependiendo del tamaño de la muestra, utilizar los frascos con volúmenes que van de 4-60 mL. Para este experimento, utilizar frascos de vidrio de borosilicato (40 mL) y casquillos seguros solvente. Quema los frascos, pipetas de vidrio de borosilicato y pesaje latas a 550 ° C por 6 h antes de eliminar los posibles contaminantes orgánicos.
Obtener diclorometano y metanol (ambos son comunes en los laboratorios de geoquímica orgánicos más), utilizar individualmente para limpiar instrumentos de laboratorio y cristalería antes de usar. Una mezcla de diclorometano (DCM) en metanol (MeOH; 9:1) se utiliza en muchos laboratorios para extraer eficientemente biomarcadores con un amplio rango de polaridades. Disolventes deben estar libres de contaminantes orgánicos.
Adquirir un aparato de soxhlet a utilizar en este experimento (éstos pueden adquirirse de Fisher Scientific u otro minorista de ciencia), a continuación, lavado y combustión a 550 ° C por 6 h antes de su uso.
Obtener cartuchos de fibra de vidrio (pueden comprarse en Whatman) y combustión a 550 ° C por 6 h antes de su uso.

2. preparación de muestra

Coloque una combustión peso de lata en la escala de laboratorio y Tara.
Enjuague el espátula de laboratorio con solvente, luego utilizar para transferir una masa adecuada de muestra en la bandeja de pesaje y registrar la masa.
1. La masa de la muestra varía en función de su contenido de materia orgánica. Materia orgánica relativamente magro material (barro marino) puede requerir varios gramos, mientras que el material rico de materia orgánica (tejido foliar) puede requerir mucho menos.
Transferir todo el material en la bandeja de pesaje en un dedal de fibra de vidrio quemado.

3. extracción

Transferencia de ~ 400 mL de la mezcla de DCM:MeOH (9:1) al matraz de fondo redondo (el frasco debe ser más de la mitad) y poner en el manto de calefacción. Añadir varias (5-10) aclarado solvente hirviendo fichas.
Colocar el dedal de la muestra, abierto, en la pieza central del aparato Soxhlet.
Coloque la pieza central en la parte superior del matraz de fondo redondo y asegúrelos con una abrazadera de cristalería.
Instale el condensador en la parte superior la pieza central de la Soxhlet y asegúrelos con una abrazadera de cristalería.
Coloque una de las líneas de agua frías del condensador a la tubería de agua fría en la campana mediante una abrazadera. La otra ruta hacia el drenaje.
Abra el agua para asegurar el drenaje y la circulación adecuada.
Encienda el manto de calefacción y regulación de la temperatura hasta que hierva ligeramente el solvente en el matraz de fondo redondo.
Controlar la extracción de un par de veces durante la siguiente hora.
1. Compruebe que correctamente se ajusta a hervir baja la temperatura, el solvente es condensación en el condensador goteando en el pedazo de centro, el pedazo de centro es llenado y vaciado correctamente y el agua está drenando correctamente en el desagüe de la campana.
Controlar la extracción en lo próximo 36 h.
1. Asegurar correctamente se ajusta la temperatura a ebullición bajo, el solvente es condensación en el condensador y goteando en el pedazo de centro, el pedazo de centro es llenado y vaciado correctamente, el agua está drenando correctamente en el desagüe de la campana y sigue siendo el nivel de disolvente en el matraz de fondo redondo completo alrededor de la mitad.
Después de 36 h, detener la extracción apagando el manto de calefacción.
Etiqueta el frasco “TLE”.

Results

Al final de la extracción, se produce un extracto total de lípidos (TLE) para la muestra. El matraz contiene la materia orgánica extraíble de la muestra de sedimento. Ahora se puede analizar este TLE, y sus componentes químicos identifican y cuantificaron.

Applications and Summary

El extracto de lodo marino contiene compuestos llamados alkenones, que se utilizan en Paleoceanografía. Alkenones son cadenas largas alquil-las cetonas producidas por ciertas clases de Haptophyta algas que viven en el océano superficial iluminada por el sol³ (figura 3). Los dos alkenones más comunes son 37 átomos de carbono de largo y tienen dos o tres enlaces dobles en ellos. Las algas calcáreas ajustan la relación de estos dos alkenones en sus celdas según la temperatura del agua que viven. La relación de los dos alkenones define la U^k’relación₃₇ :

Ecuación 1) U^k’₃₇ = (C_37:2) / (C_37:2 + C_37:3) ^4,5

Cultura^6,7 y base superior sedimentos⁸ calibración estudios condujeron al desarrollo de la U^k’₃₇ índice como un proxy cuantitativo de SST. En este trabajo utilizamos:

Ecuación 2) U^k’₃₇= 0.034(SST) + 0.039; ±1.4 ° C de 0 a 28 ° C [basada en cultivo⁷]

Alkenones se conservan en los sedimentos datan del Eoceno (hace 56 millones de años)⁹. Conocer la distribución de alkenones en un núcleo de sedimento a través del tiempo refiere a información sobre la evolución de la temperatura superficial del mar en ese lugar. Sin embargo, es necesario en primer lugar asegúrese de que el instrumento con exactitud y precisión mide la relación de los dos alkenones, y es por eso que las normas son necesarias.

Figura 3. Alkenones con 2 (C37:2) y (C37:3) 3 dobles enlaces (izquierda) son producidos por algunas algas Haptophyta que viven en el océano superficial iluminada por el sol (derecha). (Foto cortesía de Tim I. Eglinton, Institución Oceanográfica de Woods Hole)

References

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Transcript

Soxhlet extraction is a method of isolating compounds, such as lipids, from a large amount of solid material with a relatively small volume of solvent.

Many of the compounds relevant to paleoclimatic studies are not available to purchase from retail scientific companies. Standards of these compounds must therefore be prepared from natural samples.

Large quantities of standard are needed to assess the performance of an instrument over time. To obtain a suitable amount of a biomarker for standard preparation, a large volume of sediment must be extracted.

The Soxhlet extractor, invented in the 1870’s by Franz von Soxhlet, allows automated, batch extraction from a solid, increasing the overall efficiency while using a small amount of solvent.

This video is part of a series on lipid extraction, purification, and analysis from sediments. It will illustrate Soxhlet extraction of lipid biomarkers from marine sediment for use in paleothermometry and will introduce a few other applications of Soxhlet extraction in Earth science and chemistry.

A typical assembly uses a round-bottomed flask, a cold water condenser, and the Soxhlet apparatus itself. The solid to be extracted is placed in a thimble in the central chamber of the apparatus. The extraction is aided by the addition of energy in the form of heat, known as refluxing. The solvent vapor rises through the distillation path in the Soxhlet apparatus to the condenser. Upon condensing, the solvent collects in the chamber, dissolving some of the organic material in the thimble. As the chamber fills, the siphon fills as well. When the siphon is full, the solution flows back into the flask. The solution level never exceeds the top of the thimble, so no solid enters the flask.

The lipid extract continually collects in the flask, whereas the solvent becomes part of the next extraction cycle. Thus, the cycle can repeat indefinitely without loss of solvent.

The conservation of the solvent, the continuous nature of the extraction, and the ability to accommodate large sample sizes makes Soxhlet extraction ideal for isolating organic compounds from large portions of insoluble material.

Now that you understand the principles of Soxhlet extraction, let’s go through a procedure for Soxhlet extraction of lipid biomarkers from sediment.

For this experiment, a sample of excess marine sediment from a coring expedition is used. The sample will be freeze-dried, crushed, and homogenized. For more instruction, please reference this collection’s video on Extraction by Sonication.

To prepare for the extraction, first make a 9:1 solution of dichloromethane to methanol. This solution will be used as the extraction solvent and to wash the glassware and laboratory instruments.

To remove organic contaminants, combust the round-bottomed flask, Soxhlet apparatus, glass fiber thimble, and weighing tins for 6 h at 550 °C. Wash a round-bottomed flask the DCM-methanol solution. Once ready to set up the extraction, rinse a laboratory spatula and five to ten boiling chips with the DCM-methanol solution.

To begin constructing the extraction assembly, set up a heating mantle in a fume hood. Obtain a condenser, a support stand to secure the round bottom flask, and the Soxhlet apparatus.

Tare a combusted weighing tin. With the solvent-rinsed spatula, transfer approximately 50 g of sample to the weighing tin and record the mass. Load the material into the combusted glass fiber thimble.

Next, fill the combusted and rinsed round-bottomed flask slightly more than half full of the DCM-methanol solution. Add the washed boiling chips and place the round-bottomed flask in the heating mantle.

Then, place the sample thimble open end up in the chamber of the Soxhlet apparatus. Connect the apparatus to the round-bottomed flask and clamp the apparatus in place.

Secure the condenser to the top of the Soxhlet apparatus. Connect the cold water line to the lower port of the condenser with a hose clamp or zip tie. Connect the outlet line to the upper port of the condenser and route it to the drain.

Turn on the water to the condenser and verify the flow path. Then, turn on the heating mantle and heat the solvent to reflux.

As the solvent begins condensing, ensure that the condensate is dripping into the chamber and that the extract is siphoned into the round-bottomed flask. The solvent should stay at a low boil throughout the extraction.

Monitor the extraction process and the condenser water flow until the extraction is complete. Then, stop the extraction by turning off the heating mantle. Once the extract has cooled, remove the condenser and Soxhlet apparatus. Finally, seal the round-bottomed flask containing the total lipid extract and store for further processing.

Soxhlet extraction is often used for chemical analysis of a solid sample, and can also be used for reagent preparation and purification.

Soxhlet extraction can be used to detect the presence of polychlorinated biphenyl compounds, or PCBs, in the environment. The transfer efficiency of PCBs from prey fish to predator fish was measured to gain more information about the health risks to humans and wildlife from eating contaminated fish. Soxhlet extraction of fish tissue allows preparation of samples for gas chromatography and mass spectrometry.

Compounds to be introduced to the environment in large quantities are analyzed for the presence of PCBs. Biochar is a byproduct of pyrolysis of organic matter that, when added to soil, may improve soil quality and take up pollutants. Validation of biochar production methods for widespread use includes Soxhlet extraction to test for the presence of PCBs by gas chromatography.

Soxhlet extraction can also be used to purify a solid by extraction of unwanted compounds. Long-chain fatty acids were selectively removed from tomato skins by stepwise extraction to yield the wax-free tomato cuticle. The stepwise extraction was performed with multiple solvents of varying polarities in succession. This not only provided comprehensive wax removal from the tomato skin, but allowed isolation of individual wax moieties based on solubility characteristics as well.

You’ve just watched JoVE’s introduction to Soxhlet extraction of lipid biomarkers from geological archive sediments. You should now be familiar with the principles behind Soxhlet extraction, the procedure for Soxhlet extraction of a sediment sample, and some examples of how Soxhlet extraction may be used for analytical purposes.

Thanks for watching!

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