2.14: Análisis de la curva de crecimiento bacteriano y sus aplicaciones ambientales

1. colección de alícuotas de cultivo bacteriano

1. Un día antes de la colección de puntos de tiempo de crecimiento, sembrar 20 mL de medio de caldo (TSB) de soya tripticasa en un matraz de 50 mL con e. coli.
2. Incubar durante una noche a 27 º C. Este período de incubación relativamente largo resulta en una población de fase estacionaria del tipo salvaje de e. coli de aproximadamente 10⁹ UFC/mL.
3. Al día siguiente, utilice 100 μl de la cultura preparada para inocular 250 mL de TSB (en un matraz de 500 mL). Mezclar bien.  Sacar una alícuota de 5 mL y refrigere inmediatamente a 4 ° C. Esto es T = 0 o punto del tiempo T₀ y debe contener aproximadamente 4 x 10⁵ UFC/mL.
4. Colocar el matraz de la restante e. coli (245 mL) en un 37 º C agitando la incubadora. Retirar alícuotas de 5 mL de cultura cada hora, hasta 8 h. almacenar cada alícuota a 4 ° C. Designar estas alícuotas T₁ a T₈.

2. serie dilución

1. Extraer alícuotas de e. coli el refrigerador y el lugar en el hielo para el transporte. No todas las culturas en hielo hasta su uso.
2. Establecer una serie de tubos de dilución para obtener varias diluciones de cada cultura de e. coli (figura 3). Los tubos del microfuge son convenientes para esta función. Cada tubo de dilución debe tener 900 μl de líquido de dilución (solución salina estéril). Se necesita una serie de diluciones para cada cultivo de e. coli (T₀ al T₈); etiquetar cada tubo según la tabla 2.
   
   Figura 3. Diagrama esquemático mostrando el procedimiento para la e. colide la galjanoplastia.
3. Comienzan las diluciones añadiendo 100 μl de e. coli del tubo con la etiqueta T₀ (la inicial cultura de e. coli ) al tubo A, que es la dilución 10^-1 T₀. Vórtice el tubo durante 5 s.
4. Posteriormente, añada 100 μl del tubo al siguiente tubo de solución salina, tubo B, que es la dilución 10^-2 T₀. Seguir con la serie de la dilución necesaria para cada alícuota de punto de tiempo. Recuerde vortex cada antes del tubo de transferencia. También es importante utilizar una punta de pipeta nueva para cada transferencia.

Tabla 2. Serie de diluciones requerida para cada cultivo de e. coli .

3. galjanoplastia

1. Tres diluciones de cada alícuota de punto de tiempo de cultura de e. coli serán plateadas, según tabla 3. Etiqueta de las placas con el punto del tiempo (T₁ a T₈), el factor de dilución y el volumen a añadir. Usar las placas por triplicado para cada dilución.
2. Añadir 100 μl de cada dilución en la placa transfiriendo la cantidad al centro de la placa de agar (figura 3). Inmediatamente extendió la alícuota utilizando una llama esterilizado "L" en forma de varilla de vidrio. Si la alícuota no se difunde inmediatamente, sorbs en situ en la placa, dando lugar a crecimiento excesivo bacteriano en el lugar de la inoculación inicial.
3. Repita la chapa para cada serie de dilución tiempo puntos T₁ a T₈. No olvide esterilizar la varilla entre las placas y sobre todo entre diferentes diluciones.
4. Una vez que las placas se han secado durante unos minutos, invertir y colocar en incubadora de 37 ° C durante la noche. Invertir las placas impedir la condensación caigan sobre la placa de agar. Después de incubación durante la noche, las placas deben guardarse en el refrigerador.

^* Diluciones más bajas tienen en cuenta poblaciones inferiores debido a la fase de muerte.

Tabla 3. Protocolo para cultivos de e. coli de la galjanoplastia.

4. recuento de colonias y calcular el tiempo de generación malo

1. Examinar las placas para la uniformidad de las colonias y la falta de contaminación.
2. Para cada punto del tiempo (T₀ al T₈), escoge una dilución que contenga entre 30 y 300 colonias y cuenta por triplicado.
3. El factor de dilución, back-calcular el número de células por mL del cultivo original en tiempo puntos T₀ al T₈. Por ejemplo, si el número de colonias resultantes de la dilución 10^-4 es de 30, 28 y 32:
   Significa el número de colonias = 30 colonias
   Estos surgieron de 0,1 mL de una dilución de 10^-4
   Número de colonias por mL = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. Diagrama log₁₀ UFC/mL frente al tiempo (en horas).
5. De la gráfica, determinar la fase exponencial de crecimiento. 2 puntos de tiempo dentro de la fase de crecimiento exponencial y los correspondientes números de celular en cada momento, calcular el tiempo de generación malo.

La medición de la tasa de crecimiento de las bacterias es una técnica microbiológica fundamental y tiene un uso generalizado en la investigación básica, así como en aplicaciones agrícolas e industriales.

Las bacterias se encuentran entre las formas de vida más abundantes de la Tierra, estando presentes en todos los ecosistemas, incluido el cuerpo humano. Ciertas especies bacterianas también son genéticamente muy manejables y se han aprovechado como modelos de investigación o para producir productos naturales o sintéticos a escala industrial. Sin embargo, no todas las especies bacterianas se pueden cultivar en el laboratorio. Para aquellos que pueden, una característica importante es la tasa de multiplicación, o "cinética de crecimiento".

La medición de la tasa de crecimiento de un cultivo bacteriano puede informar a los científicos sobre sus funciones fisiológicas y metabólicas, y también es útil para obtener un número preciso de células de las bacterias para aplicaciones posteriores.

Este video presentará los principios detrás del análisis de la tasa de crecimiento bacteriano, demostrará un protocolo para caracterizar la tasa de crecimiento con una "curva de crecimiento" y, finalmente, explorará varias aplicaciones de la ciencia ambiental para medir la cinética del crecimiento bacteriano.

Las bacterias generalmente se reproducen asexualmente, multiplicándose por fisión binaria simple donde una célula parental se divide en dos células hijas idénticas. En condiciones de crecimiento favorables, donde los nutrientes están disponibles en abundancia y los parámetros ambientales, como la temperatura, son propicios para el crecimiento, la tasa de multiplicación supera con creces la tasa de mortalidad. Esto se traduce en un crecimiento exponencial.

Al medir la cantidad de bacterias en un cultivo en función del tiempo, se puede obtener una curva de crecimiento. El cultivo de bacterias en un cultivo líquido en condiciones óptimas produce una curva de crecimiento con una forma característica que se puede dividir en varias fases. La curva comienza con una "fase de retraso", cuando el crecimiento es lento mientras las bacterias se aclimatan a las condiciones de cultivo. La siguiente es la "fase logarítmica" o "exponencial", cuando las bacterias experimentan un crecimiento exponencial. El crecimiento finalmente se detiene una vez que los nutrientes se agotan y los productos de desecho se acumulan, lo que resulta en una "fase estacionaria". Finalmente, una vez que la tasa de multiplicación es superada por la tasa de muerte celular, el cultivo entra en la "fase de muerte".

Para construir una curva de crecimiento, los números de bacterias en un matraz de cultivo líquido se cuentan en diferentes puntos de tiempo durante un cierto período de cultivo. Los recuentos bacterianos se pueden obtener mediante varios métodos diferentes. Un enfoque común es medir la densidad óptica, o "OD", 600, que es la absorbancia de luz de la solución bacteriana a una longitud de onda de 600 nm.

Otro método es determinar las "UFC", o unidades formadoras de colonias, por mililitro de cultivo. Debido a la naturaleza clonal del crecimiento bacteriano, una bacteria en un cultivo puede teóricamente expandirse en una colonia observable en una placa de agar. Al sembrar una serie de diluciones de un cultivo bacteriano para alcanzar una concentración bacteriana en la que se pueden observar colonias individuales y discretas, un método llamado "siembra de dilución en serie", el recuento de colonias se puede utilizar para calcular la concentración bacteriana en términos de UFC por mL.

Ahora que comprende cómo se puede analizar el crecimiento bacteriano, repasemos un protocolo para realizar análisis de curvas de crecimiento en cultivos puros de un modelo bacteriano bien establecido, Escherichia coli, utilizando el método de recubrimiento de dilución en serie.

Un día antes de la recolección del punto de tiempo, inocule 20 mL de caldo de soya tripticasa preesterilizado, o TSB, medio en un matraz de 50 mL con una sola colonia de E. coli.

Incubar el cultivo durante la noche a los 37 ? C con temblor. En el caso de E. coli, esto daría como resultado una población en fase estacionaria de aproximadamente 109 UFC/mL.

Al día siguiente, inocular 100 ? L del cultivo nocturno en 250 mL de TSB en un matraz de 500 mL. Homogeneizar. Esto produce un cultivo diluido de aproximadamente 4 x 105 UFC/mL. Almacene 5 mL de este cultivo diluido en un tubo de cultivo. Esta es la alícuota desde el punto de tiempo 0, o T0. Refrigere inmediatamente a 4 ?C.

Incube el volumen restante del cultivo a 37 ? C con temblor. A partir de entonces, cada hora durante un máximo de 8 h, recoja alícuotas de 5 ml del cultivo. Designe estas muestras T1 a T8 y almacene todas ellas a 4 ? C hasta su uso.

El día del experimento, retire las alícuotas de los puntos de tiempo de E. coli del refrigerador y manténgalas en hielo. Utilice tubos de microfuga estériles, cada uno con 900 ? L de solución salina estéril, para establecer una serie de dilución para cada alícuota de acuerdo con la tabla siguiente.

Mezcle bien el cultivo T0 mediante un vórtice suave, luego agregue 100 ? L al tubo A de su serie de dilución, haciendo una dilución 1 en 10 o 10-1. Tubo de vórtice A para mezclar, y con una punta de pipeta nueva, agregue 100 ? L del tubo A al tubo B, haciendo la dilución 1 en 100 o 10-2.

Repita el proceso para cada alícuota de cultivo y realice la serie de dilución adecuada de acuerdo con la Tabla 2. Una vez que se haya realizado la serie de dilución para todas las muestras de punto de tiempo, tenga el número adecuado de placas estériles de agar de soja tripticasa preparadas para la siembra bacteriana.

3 diluciones de cada cultivo de punto de tiempo se platearán por triplicado de acuerdo con la siguiente tabla. Etiquete las placas en consecuencia. A continuación, pipeta 100 ? L de cada cultivo adecuadamente diluido en el centro de la placa de agar respectiva. Esterilice con llama una varilla de vidrio en forma de "L", enfríe tocando la varilla con el agar lejos del inóculo e inmediatamente extienda el líquido sobre la superficie del agar. Tenga en cuenta que un retraso en la propagación podría resultar en un crecimiento excesivo de bacterias en el lugar de la inoculación.

Continúe enchapando cada serie de dilución para los cultivos de 9 puntos de tiempo, esterilizando con llama la varilla de esparcimiento de vidrio entre cada serie de dilución.

Una vez que las placas se hayan dejado secar durante unos minutos, inviértalas y colóquelas en el 37 ? C incubadora durante la noche. Después de este período de crecimiento, las placas pueden almacenarse a 4 ?C.

Después de la incubación nocturna de las placas de dilución, examínelas para detectar contaminación y uniformidad de colonias. Para cada cultivo de punto de tiempo, elija una dilución para la cual haya entre 30 y 300 colonias por placa. Cuente el número de colonias en cada una de las placas triplicadas para esa dilución.

Utilizando el número medio de colonias para cada dilución y el factor de dilución, calcule la concentración de bacterias en el cultivo original en cada punto de tiempo en UFC/mL. Por ejemplo, si hay un promedio de 30 colonias del conjunto de placas por triplicado obtenidas de 0,1 mL de la dilución 10-4, o 1 en 10.000, entonces habría 30 divididas por 0,1 mL multiplicadas por 10.000, o 3 millones de UFC/mL.

Usando la concentración bacteriana calculada para cada punto de tiempo, trace un gráfico del logaritmo de base 10 de las concentraciones bacterianas, en UFC/mL, frente al tiempo en horas. A partir del gráfico, identifique la fase logarítmica de crecimiento del cultivo bacteriano original y elija dos de los puntos de tiempo dentro de la fase logarítmica, designando el primero de estos puntos de tiempo como t = 0. Calcula el tiempo medio de generación utilizando la ecuación X igual a 2 elevado a n multiplicado por X0, donde X es la concentración bacteriana en el tiempo t, X0 es la concentración inicial en t = 0 y n es el número de generaciones que han transcurrido entre los dos puntos temporales.

Por ejemplo, supongamos que X0 es 1.000 UFC/mL, y en t = 6 h, la concentración es 16.000 UFC/mL. Usando la ecuación, obtenemos que han ocurrido 4 generaciones en 6 h, lo que da un tiempo de generación de 6 dividido por 4 o 1,5 h por generación.

La medición de la cinética de crecimiento bacteriano es fundamental para muchas aplicaciones con fines de investigación, agricultura o bioingeniería.

Uno de los usos para conocer la tasa de crecimiento bacteriano es permitir que se obtenga una cantidad precisa de un cultivo bacteriano para inocular otro cultivo o medio. Por ejemplo, ciertos cultivos, como las legumbres, deben cultivarse con bacterias simbióticas conocidas como rizobios que colonizan las raíces de las plantas para formar nódulos y "fijar" nitrógeno, convirtiendo el nitrógeno atmosférico en amoníaco que puede ser utilizado por la planta. Para aplicaciones agrícolas, se agrega una cantidad conocida de rizobios a un medio de carbono a base de turba, que luego se usa para inocular semillas de leguminosas para establecer la simbiosis planta-bacteria.

El análisis de crecimiento también se puede utilizar para identificar especies bacterianas que pueden degradar los desechos industriales y posiblemente generar subproductos valiosos. En este ejemplo, los investigadores investigaron cómo los medios de crecimiento suplementados con licor negro, un producto de desecho de la pulpa de madera y la producción de papel, afectaban el crecimiento de un aislado microbiano ambiental.

Las bacterias no solo demostraron un mayor crecimiento con el licor negro, sino que también mostraron un patrón de crecimiento "difásico", lo que indica la presencia de más de una fuente de carbono en el licor negro que las bacterias pueden metabolizar. A continuación, se podrían extraer los componentes individuales del licor negro para un análisis de crecimiento más detallado.

Por último, las mediciones de la tasa de crecimiento también son útiles para caracterizar las bacterias que han sido modificadas para fines industriales particulares, por ejemplo, para la remediación de la contaminación por petróleo. Aquí, los científicos crearon cepas bacterianas modificadas genéticamente que contienen enzimas para degradar los componentes de hidrocarburos del petróleo. Se realizó un análisis de crecimiento, por ejemplo, para verificar que las bacterias modificadas tienen una tasa de crecimiento mayor que las bacterias normales en presencia de los hidrocarburos tóxicos, lo que indica una mejor tolerancia que permitirá a las bacterias modificadas realizar su función de limpieza de la contaminación.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre el análisis de las tasas de crecimiento bacteriano con curvas de crecimiento. Ahora debe comprender las diferentes fases de crecimiento de los cultivos bacterianos, cómo realizar un experimento para obtener una curva de crecimiento utilizando la recolección de puntos de tiempo y el recubrimiento de dilución en serie, y cómo se puede aplicar el análisis de crecimiento a fines industriales y de investigación. Como siempre, ¡gracias por mirar!