Análisis de la curva de crecimiento bacteriano y sus aplicaciones ambientales

1. colección de alícuotas de cultivo bacteriano

1. Un día antes de la colección de puntos de tiempo de crecimiento, sembrar 20 mL de medio de caldo (TSB) de soya tripticasa en un matraz de 50 mL con e. coli.
2. Incubar durante una noche a 27 º C. Este período de incubación relativamente largo resulta en una población de fase estacionaria del tipo salvaje de e. coli de aproximadamente 10⁹ UFC/mL.
3. Al día siguiente, utilice 100 μl de la cultura preparada para inocular 250 mL de TSB (en un matraz de 500 mL). Mezclar bien.  Sacar una alícuota de 5 mL y refrigere inmediatamente a 4 ° C. Esto es T = 0 o punto del tiempo T₀ y debe contener aproximadamente 4 x 10⁵ UFC/mL.
4. Colocar el matraz de la restante e. coli (245 mL) en un 37 º C agitando la incubadora. Retirar alícuotas de 5 mL de cultura cada hora, hasta 8 h. almacenar cada alícuota a 4 ° C. Designar estas alícuotas T₁ a T₈.

2. serie dilución

1. Extraer alícuotas de e. coli el refrigerador y el lugar en el hielo para el transporte. No todas las culturas en hielo hasta su uso.
2. Establecer una serie de tubos de dilución para obtener varias diluciones de cada cultura de e. coli (figura 3). Los tubos del microfuge son convenientes para esta función. Cada tubo de dilución debe tener 900 μl de líquido de dilución (solución salina estéril). Se necesita una serie de diluciones para cada cultivo de e. coli (T₀ al T₈); etiquetar cada tubo según la tabla 2.
   
   Figura 3. Diagrama esquemático mostrando el procedimiento para la e. colide la galjanoplastia.
3. Comienzan las diluciones añadiendo 100 μl de e. coli del tubo con la etiqueta T₀ (la inicial cultura de e. coli ) al tubo A, que es la dilución 10^-1 T₀. Vórtice el tubo durante 5 s.
4. Posteriormente, añada 100 μl del tubo al siguiente tubo de solución salina, tubo B, que es la dilución 10^-2 T₀. Seguir con la serie de la dilución necesaria para cada alícuota de punto de tiempo. Recuerde vortex cada antes del tubo de transferencia. También es importante utilizar una punta de pipeta nueva para cada transferencia.

Cultura de e. coli	Las diluciones necesitan y tubo #
	A	B	C	D	E	F	G
T0	10-1	10-2
T1	10-1	10-2
T2	10-1	10-2	10-3
T3	10-1	10-2	10-3	10-4
T4	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5
T5	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T6	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
T7	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T8	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6

Tabla 2. Serie de diluciones requerida para cada cultivo de e. coli .

3. galjanoplastia

1. Tres diluciones de cada alícuota de punto de tiempo de cultura de e. coli serán plateadas, según tabla 3. Etiqueta de las placas con el punto del tiempo (T₁ a T₈), el factor de dilución y el volumen a añadir. Usar las placas por triplicado para cada dilución.
2. Añadir 100 μl de cada dilución en la placa transfiriendo la cantidad al centro de la placa de agar (figura 3). Inmediatamente extendió la alícuota utilizando una llama esterilizado "L" en forma de varilla de vidrio. Si la alícuota no se difunde inmediatamente, sorbs en situ en la placa, dando lugar a crecimiento excesivo bacteriano en el lugar de la inoculación inicial.
3. Repita la chapa para cada serie de dilución tiempo puntos T₁ a T₈. No olvide esterilizar la varilla entre las placas y sobre todo entre diferentes diluciones.
4. Una vez que las placas se han secado durante unos minutos, invertir y colocar en incubadora de 37 ° C durante la noche. Invertir las placas impedir la condensación caigan sobre la placa de agar. Después de incubación durante la noche, las placas deben guardarse en el refrigerador.

E. coli cultura	Diluciones a platear
T0	10-1	10-2	10-3
T1	10-1	10-2	10-3
T2	10-2	10-3	10-4
T3	10-3	10-4	10-5
T4	10-4	10-5	10-6
T5	10-5	10-6	10-7
T6	10-6	10-7	10-8
T7 *	10-5	10-6	10-7
T8 *	10-4	10-5	10-6

^* Diluciones más bajas tienen en cuenta poblaciones inferiores debido a la fase de muerte.

Tabla 3. Protocolo para cultivos de e. coli de la galjanoplastia.

4. recuento de colonias y calcular el tiempo de generación malo

1. Examinar las placas para la uniformidad de las colonias y la falta de contaminación.
2. Para cada punto del tiempo (T₀ al T₈), escoge una dilución que contenga entre 30 y 300 colonias y cuenta por triplicado.
3. El factor de dilución, back-calcular el número de células por mL del cultivo original en tiempo puntos T₀ al T₈. Por ejemplo, si el número de colonias resultantes de la dilución 10^-4 es de 30, 28 y 32:
   Significa el número de colonias = 30 colonias
   Estos surgieron de 0,1 mL de una dilución de 10^-4
   Número de colonias por mL = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. Diagrama log₁₀ UFC/mL frente al tiempo (en horas).
5. De la gráfica, determinar la fase exponencial de crecimiento. 2 puntos de tiempo dentro de la fase de crecimiento exponencial y los correspondientes números de celular en cada momento, calcular el tiempo de generación malo.