Análisis de muestras ambientales mediante RT-PCR del ARN

La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa, o RT-PCR, permite la detección de virus de ARN y la expresión génica microbiana en el medio ambiente.

A diferencia de los organismos celulares, desde los humanos hasta las bacterias, que utilizan el ADN como material genético, algunos virus tienen genomas hechos de ARN, incluidos muchos virus patógenos como la gripe, el ébola y el VIH. Si bien algunos virus pueden detectarse observando el fenotipo patógeno que se desarrolla cuando se usa para infectar células en cultivos celulares, la mayoría no tiene métodos de caracterización basados en cultivos. La RT-PCR se puede utilizar para detectar la presencia de estos virus en el entorno con alta sensibilidad.

Al mismo tiempo, los organismos con genomas basados en el ADN "expresan" la información genética codificada en sus genomas de ADN "transcribiéndolos" en ARN mensajero o "m", que luego puede ser "traducido" en proteínas para realizar funciones enzimáticas o estructurales en las células. A medida que los microbios responden y se adaptan a los cambios en el medio ambiente activando o desactivando varias vías genéticas, la RT-PCR se puede utilizar para monitorear tales alteraciones en la expresión génica para servir como posibles evaluadores del ecosistema.

Este video repasará los principios detrás de la RT-PCR, describirá un procedimiento generalizado para realizar esta técnica y, por último, examinará algunas de las formas en que este método se está aplicando en la microbiología ambiental en la actualidad.

Este procedimiento consta de dos partes clave: la extracción del ARN de muestras biológicas, seguida de su transcripción inversa en ADN.

El aislamiento del ARN consiste en lisar las células de la muestra mediante la adición de un detergente que descompone los lípidos y las proteínas, seguido de una disrupción mecánica. La extracción de ARN de los virus generalmente requiere la adición de proteinasas, que son enzimas que digieren proteínas, para descomponer las cápsidas de los virus, las cubiertas de proteínas resistentes que forman la partícula viral. Por otro lado, al obtener ARN de organismos celulares, es posible que sea necesario tratar el lisado con enzimas degradadoras de ADN, o ADNasas, para evitar que los resultados posteriores se confundan por la presencia del ADN químicamente similar.

El ARN se puede purificar a partir de lisados de una de dos maneras. En un método, conocido como extracción ácida de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio, el lisado se mezcla con una mezcla orgánica-acuosa que luego se centrifuga para separar las fases. Las proteínas se dividirán en la fase orgánica, los restos celulares lisados en la interfase turbia y los ácidos nucleicos en la fase acuosa. A continuación, se puede recoger la fase acuosa superior y el ARN se precipita mediante la adición de alcohol como el isopropanol, que disminuye la solubilidad del ácido nucleico en agua.

En el aislamiento de ARN basado en columna, el lisado se mezcla con alcohol y luego pasa a través de una columna de filtración en gel con una resina cargada negativamente, como la sílice. El lisado se prepara para que los iones cargados positivamente en el tampón formen "puentes de sal" que permitan que la columna vertebral de fosfato cargada negativamente de los ácidos nucleicos se una a la resina. A continuación, se lavan todos los demás contaminantes. Los ácidos nucleicos se "eluyen" de la columna utilizando un tampón bajo en sal o agua. Debido a que el ARN monocatenario tiene menos cargas negativas que el ADN bicatenario, se puede eluir preferentemente utilizando tampones de concentraciones específicas.

Una vez aislado, el ARN se transforma en el ADN químicamente más estable. Los científicos han aprovechado una enzima codificada naturalmente por retrovirus como el VIH. Esta enzima se conoce como transcriptasa inversa o "RT".

RT sintetiza ADN complementario o "c" a partir de un corto tramo de nucleótidos conocido como cebador. Este cebador puede tener diferentes secuencias, dependiendo del propósito del experimento. Por ejemplo, el cebador puede diseñarse para tener una secuencia específica, con el fin de detectar genes u organismos específicos. Una vez sintetizado, este ADNc de "primera cadena" puede amplificarse mediante PCR regular.

Ahora que conocemos los principios de la RT-PCR, veamos un protocolo para realizar esta técnica en muestras de ARN recogidas del medio ambiente.

Para comenzar el procedimiento, busque un lugar de recolección de muestras utilizando coordenadas GPS o a la vista. Elija puntos aleatorios dentro de un área para obtener un estudio general de los hábitats microbianos.

Para recolectar la muestra sólida, empuje y gire una barrena manual en el suelo molido a la profundidad predeterminada. Cuando se levanta la barrena, se puede encontrar tierra dentro del tallo hueco de la barrena.

Este suelo se raspa directamente en una bolsa de recolección de suelo y la bolsa está etiquetada con el lugar, nombre, fecha, hora de recolección y cualquier otra información necesaria.

Transfiera la tierra al laboratorio y pase la tierra por un tamiz de 2 mm para eliminar la grava y la roca. Analice una muestra del suelo para determinar el contenido de humedad, lo que puede ser informativo sobre el nivel de actividad microbiana en el suelo. Para hacer esto, consulte el video de esta colección "Determinación del contenido de humedad del suelo".

Para la recolección de muestras de agua, elija un sitio de interés similar a la recolección de suelo y recoja el agua en una botella de plástico estéril de paredes gruesas. Toma nota del volumen de agua recolectada. Analice el agua inmediatamente para determinar parámetros como la temperatura, el pH y la salinidad, que pueden proporcionar información importante sobre los niveles microbianos esperados en la muestra. Luego, coloque el frasco en la hielera y transfiéralo al laboratorio.

Los microorganismos, como los virus, se recogen y concentran a partir de la muestra ambiental.

El ARN se puede extraer de los virus recolectados mediante el método de columna de centrifugación utilizando kits comerciales de extracción de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tampón de lisis, suplementado con etanol, se mezcla primero con la muestra. Coloque el número adecuado de columnas de centrifugado en los tubos de recolección, luego aplique las muestras en la matriz de columnas. Centrifugar las columnas a aproximadamente 12.000 x g durante 1-2 minutos para permitir que los ácidos nucleicos se unan a la columna y desechar el flujo de líquido.

Agregue tampón de lavado a las columnas y vuelva a centrifugar. Coloque las columnas en tubos de microfuga nuevos y estériles de 1,5 ml de baja adherencia. Luego, agregue agua que esté libre de ARNasas, que son enzimas que degradan el ARN, a las columnas y centrifugue durante 30 s para eluir el ARN. El ARN eluido se puede almacenar a -80 ? C hasta su uso.

Antes del experimento, se deben diseñar cebadores adecuados para detectar las secuencias de interés, que pueden servir como marcadores de la presencia de microorganismos específicos.

Saque los reactivos RT almacenados a -20 ? C y descongele los reactivos congelados en hielo (o a temperatura ambiente). Estos incluyen nucleótidos, tampón de transcripción inversa y cebadores. Una vez descongelados, mantenga los reactivos en hielo; la enzima transcriptasa inversa y el inhibidor de la RNasa siempre deben mantenerse en hielo.

Mientras se descongelan los reactivos, calcule los volúmenes y concentraciones de los componentes de la reacción. Una vez que se descongelen los reactivos, agite suavemente y gire cada tubo para asegurarse de que el contenido esté bien mezclado.

Trabajando en una campana de flujo laminar para evitar la contaminación, ensamble los componentes en una mezcla maestra para agregarlos a cada tubo de PCR. Al ensamblar la mezcla maestra en un tubo Eppendorf, asegúrese de cambiar las puntas de pipeta entre cada reactivo para evitar la contaminación. Después de que se hayan agregado todos los reactivos al tubo Eppendorf, haga un vórtice suave y gire hacia abajo el tubo de mezcla maestra para asegurar una mezcla homogénea.

Etiquete un juego de tubos de PCR, asegurándose de incluir controles. Alícuota un volumen igual de la mezcla maestra en cada tubo. A continuación, añada componentes específicos de la reacción, como los extractos de ARN o el agua para el control de negativos.

Una vez que se hayan agregado todos los componentes, coloque los tubos en un termociclador y configure el programa de transcripción inversa para que se ejecute. A continuación, el ADNc puede someterse a una amplificación por PCR. Para obtener una descripción detallada de este paso, consulte el video de esta colección sobre PCR.

Una vez finalizada la PCR, parte del producto de la PCR puede separarse y visualizarse en un gel de agarosa. Por ejemplo, aquí se utilizó un cebador específico de un gen para detectar la presencia de un virus de ARN. Las bandas del tamaño esperado se obtienen de la reacción RT-PCR, pero no de los controles negativos, lo que indica la presencia de este virus en la muestra de agua que se está analizando.

La identificación de microorganismos basados en ARN mediante RT-PCR permite analizar la salud ecológica, los riesgos medioambientales y la conservación de la biodiversidad.

El uso de microorganismos para limpiar hidrocarburos y solventes de suelos y aguas contaminadas representa una alternativa de remediación ecosostenible. La comprensión de la expresión génica microbiana nativa puede resaltar vías microbianas específicas que descomponen los contaminantes en estas condiciones. La RT-PCR se utiliza a menudo para amplificar el ARNm de dichas muestras ambientales.

Las medidas de salud pública a menudo requieren una vigilancia rápida de las fuentes virales de infección en el medio ambiente. La gripe aviar, por ejemplo, es altamente infecciosa y puede propagarse rápidamente a las aves de corral, el ganado e incluso a los humanos. En este ejemplo en particular, los investigadores buscaron la amenaza de la influenza aviar propagada por aves silvestres.

Utilizando una configuración y un aparato portátiles de RT-PCR, examinaron una variedad de aves silvestres, incluso en áreas remotas, para detectar infecciones temprano y prevenir la transmisión.

Por último, la RT-PCR puede utilizarse para caracterizar los "bioplaguicidas" que se están desarrollando para atacar plagas como el francotirador de alas vidriosas, Homalodisca vitripennis, el huésped de una enfermedad que daña gravemente las vides en América del Norte. Se está desarrollando un nuevo virus de ARN monocatenario como agente para infectar a este insecto. Utilizando una combinación de cultivo celular de Homalodisca y confirmación de la carga viral por RT-PCR, estos autores pudieron propagar una alta concentración de virus para su uso como agente de control biológico.

Acabas de ver la introducción de JoVE al análisis de organismos ambientales basados en ARN mediante RT-PCR. Ahora debe comprender la teoría detrás del protocolo, cómo aplicar la técnica a su investigación y algunas de las formas en que se utiliza en el campo hoy en día. ¡Gracias por mirar!