Análisis de muestras ambientales mediante RT-PCR del ARN

1. muestra Colección: Muestra de suelo

1. Encuentre una muestra ubicación vía GPS, coordenadas o vista.
2. Para el muestreo al azar, escoger puntos al azar dentro de un área para obtener un censo general de los hábitats microbianos. Recoge muestras de puntos a lo largo de una línea recta, por ejemplo, junto a un cauce de transectos. Muestras de cuadrícula se toman sistemáticamente de puntos a intervalos regulares y son útiles para las comunidades microbianas de la cartografía en una zona desconocida o variable.
3. De muestreo dentro de un 3-6 pulgadas (7.5-15 cm) profundidad proporciona acceso a la actividad microbiana más abundante que está cerca, pero no dentro de la rizosfera (región estrecha de suelo afectado directamente por las raíces de la planta y sus microorganismos asociados).
4. Para recolectar la muestra de suelo, empuje y gire un taladro de mano en el suelo a la profundidad predeterminada.
5. Levantar la barrena. El suelo se encuentra dentro del tallo hueco de la barrena.
6. Raspar el suelo en la parte inferior de la barrena en una bolsa de recolección de suelo. Asegúrese de no tocar o contaminar el suelo.
7. Etiquetar la bolsa con ubicación, nombre, fecha y hora.
8. En el laboratorio, pasa del suelo a través de un tamiz de 2 mm para eliminar cualquier grava y roca.
9. Analizar una porción del suelo para contenido de humedad del suelo. Para más detalles de este paso, consulte JoVE Ciencias de la educación video sobre humedad del suelo.

2. muestra Colección: Muestra de agua

1. Encontrar la ubicación de la muestra vía GPS, coordenadas o vista.
2. Recoger el agua en una botella de almacenamiento. Registrar el volumen de agua recolectada; Si los microbios en la muestra se analizan cuantitativamente, entonces la concentración microbiana se puede determinar basándose en el volumen recogido.
3. Inmediatamente probar el agua para los parámetros requeridos para el experimento (temperatura, pH, conductividad, salinidad, nitrógeno y fósforo contenido, etc.) utilizando las sondas electrónicas adecuadas.
4. Coloque la botella que contiene la muestra de agua en una hielera con hielo. Transferencia de la hielera al laboratorio.

3. extracción de RNA

1. Para recoger y concentrar los microorganismos de la muestra ambiental, refiera por favor a la enseñanza de las Ciencias JoVE video de extracción de ácidos nucleicos de comunidad.
2. Extracto de RNA de virus utilizando un kit de extracción comercial según las instrucciones del fabricante.
3. Brevemente, primero se mezclan las muestras con tampón de lisis con etanol, después añadir las muestras en las columnas de la vuelta.
4. Centrifugue las columnas a aproximadamente 12.000 x g, flujo de descarte. Añadir tampón de lavado a las columnas y centrifugue de nuevo.
5. Añadir agua libre de ARNasa a las columnas y centrifugue durante 30 s para eluir el RNA en los tubos del microfuge de baja adherencia de 1,5 mL estéril.

4. Invierta la transcripción - PCR

1. Recuperar los siguientes reactivos en el congelador de-20 ° C: dNTP, concentrado (por ejemplo, 10 x) inversa buffer de transcripción, cartillas (en este ejemplo, primers al azar). Descongelar estos en hielo o a temperatura ambiente dentro de una campana limpia y mantenerse en hielo descongelado. También recuperar la transcriptasa reversa y un inhibidor de RNasa y mantener en hielo.
2. Calcular los volúmenes de reactivo necesarios para hacer una "mezcla maestra" que combina todos los reactivos constantes entre cada reacción (ver tabla 1 para una reacción de la muestra). Preparar suficiente mezcla maestra para cada muestra, así como un control positivo (con una plantilla de transcripción conocido) y negativas (p. ej., sin transcriptasa inversa, con agua como plantilla, etc.) reacciones de control. Incluyen un 10% adicional en el volumen.
3. Montar la mezcla principal en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL baja adherencia. Esto minimiza el atascamiento de las moléculas de reactivo para paredes de los tubos de plástico.
4. Cuando los reactivos son descongelados, añadir volúmenes calculados para el tubo de microcentrífuga. Suavemente el vortex y centrifugar cada tubo antes de la adición. Asegúrese de cambiar las puntas de pipeta entre adición de cada reactivo para evitar la contaminación.
5. Después de todos los reactivos se han añadido, vortex y centrifugar la mezcla principal para asegurar una mezcla homogénea. Vuelva a colocar los reactivos en almacenamiento a-20 ° C.
6. Preparar y etiquetar el tubo 8 tiras PCR, que designa un tubo para cada muestra o control de la reacción.
7. Parte alícuota de un volumen igual de la master mix a cada tubo. Luego, añadir componentes de reacción específicos, tales como los extractos de RNA.
8. Coloque la tapa de la tira firmemente en la franja de PCR y centrifugar en una minicentrifuge con un adaptador de tubo tira para asegurar todo el líquido se recoge en la parte inferior de cada tubo (figura 2).
9. Tira de lugar PCR en termociclador. Presione hacia abajo para que los tubos estén asegurados.
10. Establecer el termociclador para ejecutar el programa apropiado para el RT se utiliza (ver tabla 2 para un protocolo de muestra). Cuando el programa es completo, los tubos contienen productos de cDNA, que luego pueden ser sometidos a la amplificación de la polimerización en cadena. Para obtener más información, consulte los videos de JoVE Ciencias de la educación en PCR y PCR cuantitativa. Tienda cDNA a-20 ° C hasta su uso.

Figura 2. Tira de 8-tubo tapada que contiene extracto y mezcla principal.

Reactivo de	Volumen por 1 reacción (μL)
10 x Buffer de RT	2.0
25 x dNTPs	0,8
10 x cartilla al azar	2.0
Multiscribe	1.0
Inhibidor de Rnasa	1.0
Grado molecular H2O	3.2
Volumen total	10

Tabla 1. RT amo mezcla los ingredientes.

Paso 1	Paso 2	Paso 3	Paso 4
25 ° C, 10 min.	37 ° C, 120 min	85 ° C, 5 min.	4 ° C, ∞

Tabla 2. RT reacción termociclador programa.