Enumeración de las algas mediante metodología cultivable
Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Bradley Schmitz
Las algas son un grupo muy h…
- Pesar una muestra de 10 g de suelo que ha sido recogida húmeda del campo, o había agua agregado a él para que permanezca húmedo durante 2-3 días. Tenga en cuenta que el suelo debe ser húmedo pero no saturado.
- Preparar una serie de diluciones 10 veces mediante la adición de 10 g de suelo en 95 mL de solución de Bristol modificado (figura 1). Para crear solución de Bristol modificado, disolver las siguientes en 1.000 mL de agua: 0.25 g de NaNO3, 0,025 g CaCl2, 0,075 g de MgSO–4 · 7H2O, 0,075 g de K2HPO4, 0,018 g KH2PO4, 0,025 g NaCl y 0,5 mg FECLAS3.
- Seguir con la serie de la dilución por la adición de 1 mL de suspensión A 9 mL de la solución y más diluciones secuenciales de Bristol.
- Inocular los 5 tubos de replicar cada que contiene 9 mL de solución de Bristol modificado con 1 mL de las diluciones 10-2 a 10-6 (tabla 1).
- Incubar los tubos cerrados hasta por 4 semanas en un área expuesta a la luz solar.
- Observar los tubos para el crecimiento de las algas una vez cada 7 días. Tubos con crecimiento de las algas aparecen verdes.
Figura 1. Cómo hacer una serie de diluciones 10 veces.
| Tubo | Dilución |
| B | 10-2 |
| C | 10-3 |
| D | 10-4 |
| E | 10-5 |
| F | 10-6 |
Tabla 1. Tubos y diluciones.
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Las algas son organismos fotosintéticos que viven en una variedad de ambientes. Las algas que habitan en el suelo pueden cultivarse en el laboratorio y enumerarse su concentración mediante cálculos sencillos.
Las algas son un grupo muy heterogéneo de organismos que tienen un rasgo común, a saber, la posesión de pigmentos fotosintéticos, comúnmente clorofila. La gran mayoría de las algas son microscópicas, sin embargo, la definición exacta del grupo es controvertida, y también incluye las algas marinas, que suelen ser macroscópicas.
En el medio ambiente, las algas pueden causar problemas en las aguas superficiales, como lagos o embalses, formando floraciones de algas que agotan los nutrientes del agua, bloqueando la luz que pasa más allá de la superficie del agua y liberando toxinas. La capacidad de enumerar las algas en muestras permite a los científicos evaluar la salud de un ecosistema y el riesgo potencial de crecimiento excesivo de algas.
Las poblaciones de algas en los suelos ocurren frecuentemente a alrededor de diez mil células por gramo. Estos números suelen ser más bajos que las concentraciones correspondientes de bacterias, hongos o actinomicetos, ya que las algas requieren luz solar para la fotosíntesis, que no puede penetrar muy por debajo de la superficie del suelo.
Este video ilustrará cómo cultivar algas del suelo en el laboratorio y cómo enumerar la concentración de algas en la muestra de suelo inicial.
Las algas tienen efectos beneficiosos sobre los ecosistemas. Las algas verdeazuladas, o cianobacterias, tienen la capacidad de fijar el gas nitrógeno de la atmósfera, lo que las hace útiles para aumentar el nitrógeno del suelo en ambientes semiáridos y también como una herramienta potencial para la producción de biocombustibles.
Otras algas son eucariotas y van desde unicelulares hasta organismos pluricelulares complejos, como las algas marinas. Entre ellos se encuentran las algas verdes, los euglenoides, los dinoflagelados y las diatomeas, las algas pardas y las algas rojas.
Las algas son fototróficas y obtienen energía a partir de la fotosíntesis y carbono para la biomasa a partir de dióxido de carbono. Como resultado, se pueden cultivar en medios que consisten completamente en nutrientes inorgánicos, sin un sustrato de carbono orgánico agregado. Esta falta de sustrato orgánico impide el crecimiento de bacterias heterótrofas, que dependen del carbono orgánico externo para su crecimiento.
Para cultivar algas para la enumeración, las muestras de suelo se diluyen en serie diez veces a 10-6 g de suelo por ml y se cultivan en medios de crecimiento. Se realizan varias réplicas para cada dilución. Luego se incuban en un área bien iluminada durante un máximo de 4 semanas para permitir el crecimiento de algas.
La presencia de algas en cualquier dilución está determinada por un signo positivo de crecimiento en el medio, que normalmente aparecerá como una baba verde. Finalmente, se consultan tablas de NMP desarrolladas empíricamente y diseñadas para el crecimiento de algas, lo que permite al usuario determinar la concentración original de algas en función del crecimiento en réplicas de dilución. El método MPN se basa en la dilución en serie de las muestras de modo que las algas se diluyan hasta la extinción, lo que significa que en alguna dilución no se produce el crecimiento de algas.
Ahora que estamos familiarizados con los conceptos detrás del cultivo y la enumeración de algas a partir de muestras, echemos un vistazo a cómo se lleva a cabo esto en el laboratorio.
Para comenzar el experimento, primero pesa 10 gramos de tierra húmeda que se haya recogido húmeda del campo o que se haya rehidratado y haya permanecido húmeda durante 2 a 3 días. El suelo debe, pero no está saturado.
A continuación, prepare una serie de diluciones diez veces añadiendo primero los 10 gramos de tierra a 95 ml de solución de Bristol modificada, o MBS. Etiquete esto como suspensión A.
Después de agitar vigorosamente, continúe la serie de dilución agregando 1 mL de suspensión A a 9 mL de MBS en un tubo de ensayo. Continúe esta serie de dilución de diez veces otras 4 veces para obtener diluciones de hasta 10-6 g por ml.
A continuación, inocule 5 tubos replicados, cada uno de los cuales contiene 9 mL de MBS con 1 mL de cada una de las diluciones 10-1 a 10-5. Esto da como resultado 5 tubos de réplica para cada dilución de 10-2 a 10-6. Tapa los tubos sin apretar.
Finalmente, incube los tubos durante 4 semanas completas en un área expuesta a la luz solar. Observe los tubos para el crecimiento de algas una vez cada 7 días. Los tubos que exhiben crecimiento de algas aparecerán verdes.
El análisis del número más probable, o MPN, es un método matemático comúnmente utilizado para enumerar microorganismos cultivados a partir de la dilución de un sustrato inicial concentrado. Teniendo en cuenta los factores de dilución de las soluciones y el número de tubos que muestran signos positivos de crecimiento en cada dilución, se puede calcular el número más probable de organismos por gramo de muestra de suelo original utilizando una tabla de NMP y una fórmula simple.
Para calcular el NMP, a la dilución más alta con el mayor número de tubos replicados positivos se le asigna la etiqueta de p1, en este caso, las réplicas del tubo C. Por el contrario, algunos de los tubos de D & E son negativos y no muestran signos de crecimiento de algas.
El número de tubos en las siguientes dos diluciones más altas que muestran un crecimiento positivo se etiqueta como p2 y p3. Aquí, p2 = D y p3 = E.
El valor de p1 se puede encontrar mirando hacia abajo en la primera columna de la tabla MPN. Lo mismo debe hacerse con la columna p2. Finalmente, el valor de p3, en la parte superior, se usa para intersectar los dos definidos por p1 y p2, para dar un valor del número más probable de organismos por mL.
A continuación, para calcular la concentración de organismos por gramo en la muestra de suelo original, este valor se divide por la concentración de suelo en la dilución a la que se asignó p2. La siguiente ecuación se utiliza para definir el número real de organismos por gramo de suelo.
La enumeración de algas y el análisis de NMP tienen una amplia gama de aplicaciones, algunas de las cuales se exploran aquí.
Este método de cultivo de enumeración de algas se puede utilizar en una variedad de entornos. Se puede aplicar a ríos o lagos para determinar los niveles de algas y evaluar los riesgos de floraciones de algas nocivas. Alternativamente, se puede utilizar para evaluar la limpieza y la seguridad de las aguas utilizadas más directamente por los seres humanos, incluidas las piscinas, las fuentes de agua u otras fuentes de agua potable. Idealmente, en muestras de agua potable y piscinas, no hay algas presentes.
El análisis de NMP para la enumeración también se puede aplicar a otros microorganismos no algales. Por ejemplo, la calidad del agua puede evaluarse utilizando organismos indicadores como los coliformes o E. coli. Aquí, las muestras se pueden cultivar con medios que contienen productos químicos que se alteran para producir color o fluorescencia en presencia de los organismos indicadores. Al realizar múltiples réplicas pequeñas de este experimento en células individuales, con muestras diluidas a una concentración conocida, se puede hacer referencia a la proporción de células positivas en una tabla de NMP para el organismo indicador específico, y determinar la concentración inicial en las muestras.
Las algas también se pueden cultivar para aplicaciones comerciales. Por ejemplo, algunos tipos de biofertilizantes utilizan algas verdeazuladas, que pueden actuar como simbiontes con las plantas, ayudando a su fijación y absorción de nitrógeno, que es particularmente útil para ayudar al crecimiento de los cultivos en áreas con suelos pobres. Del mismo modo, las algas pueden cultivarse para obtener biocombustibles o como fuente de alimentos ricos en nutrientes para el ganado.
Acabas de ver la introducción de JoVE al cultivo y la enumeración de algas. Ahora debería comprender cómo diluir muestras de suelo para el crecimiento de algas, cómo cultivar algas en el laboratorio y cómo enumerar la concentración de algas de sus muestras iniciales. ¡Gracias por mirar!
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Q1: What are algae and what makes them unique among microorganisms?
Algae are a heterogeneous group of photosynthetic organisms unified by possession of photosynthetic pigments, commonly chlorophyll. Most algae are microscopic, though the group includes macroscopic seaweeds. Unlike heterotrophic bacteria, algae are phototrophic, obtaining energy from photosynthesis and carbon from carbon dioxide, allowing growth in inorganic media without organic substrates.
Q2: Why are algal populations in soil typically lower than bacterial populations?
Algal populations in soils average around ten thousand cells per gram, lower than bacteria, fungi, or actinomycetes because algae require sunlight for photosynthesis. Sunlight cannot penetrate far below the soil surface, limiting algal growth to shallow depths where light is available for photosynthetic activity.
Q3: How does the serial dilution process work in algal enumeration?
Soil samples are serially diluted tenfold to 10-6 g soil per mL and cultured in growth media with multiple replicates at each dilution. Tubes are incubated in well-lit areas for up to four weeks. The serial dilution dilutes algae to extinction, meaning at some dilution, no algal growth occurs, enabling accurate enumeration using MPN analysis.
Q4: What does a positive result look like when culturing algae in the laboratory?
Algal growth appears as a green slime in the culture medium, resulting from photosynthetic activity. This visible green coloration indicates the presence of algae in that particular dilution and serves as the primary indicator for determining which tubes show positive growth during MPN analysis.
Q5: How is the Most Probable Number calculated from dilution results?
The highest dilution with the most positive replicate tubes is labeled p1, followed by p2 and p3 from higher dilutions. Values are located in an MPN table using p1 and p2 columns, then intersected with p3 across the top to obtain organisms per mL. This value is divided by soil concentration in the p2 dilution to calculate organisms per gram of original soil.
Q6: What are the practical applications of algal enumeration in environmental monitoring?
Algal enumeration assesses algal levels in rivers and lakes to evaluate risks of harmful algal blooms. It also monitors cleanliness and safety of human-use waters including swimming pools and drinking water sources, where ideally no algae should be present. The MPN method can similarly assess water quality using indicator organisms like coliforms or E. coli.
Q7: What beneficial roles do algae play in soil and agriculture?
Blue-green algae, or cyanobacteria, fix nitrogen gas from the atmosphere, increasing soil nitrogen in semi-arid environments. Some algae serve as biofertilizers, acting as symbionts with plants to enhance nitrogen uptake, particularly useful in areas with poor soil. Algae are also cultivated for biofuels and as nutrient-rich livestock feed.