Cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC)

1. que la fase móvil

1. Para preparar la fase móvil, agregar 400 mL de acetonitrilo a aproximadamente 1,5 L de agua purificada de la DI.
2. Cuidadosamente añadir 2,4 mL de ácido acético glacial a esta solución.
3. Diluir la solución hasta un volumen total de 2.0 L en un matraz aforado con agua purificada de la DI. La solución resultante debe tener un pH entre 2.8 a 3.2.
4. Ajustar el pH a 4.2 agregando hidróxido de sodio 40%, mediante goteo con el uso de un medidor de pH digital calibrado. Agregue muy lentamente una vez que el pH llegue a 4.0. Esto debe tomar alrededor de 50 gotas para llevar a cabo.
5. Filtrar la fase móvil a través de un filtro de membrana de Nylon 66 de 0.47 μm bajo vacío para desgasificar la solución y eliminar sólidos que podrían conectar la columna cromatográfica. Es importante la fase móvil para evitar que una burbuja, que podría causar un vacío en la fase estacionaria en la entrada de la columna o su forma de trabajo en la célula del detector, causando inestabilidad con la absorbancia de UV de desgasificación.

2. crear las soluciones de componentes

Los tres componentes que deben hacerse son cafeína (0,8 mg/mL), benzoato de potasio (1,4 mg/mL) y aspartamo (éster metílico de L-aspartil-L-fenilalanina) (6,0 mg/mL). Estas concentraciones, una vez diluidas de la misma manera, ponen los estándares en los niveles encontrados en las muestras de soda.

1. Añadir 0,40 g de cafeína a un matraz aforado de 500 mL y diluir hasta la marca de 500 mL con agua desionizada.
2. Añadir a un matraz aforado de 500 mL 0,70 g de benzoato y luego diluir a la marca de 500 mL con agua desionizada.
3. Añadir 0,60 g de aspartamo a un matraz aforado de 100 mL y diluir hasta la marca de 100 mL con agua desionizada. Colocar esta solución en un refrigerador para evitar la descomposición durante el almacenamiento.

3. para las soluciones estándar 7

Los tres componentes todos tienen diferentes coeficientes de distribución, que afecta a cómo cada uno interactúa con los dos de las fases. Cuanto mayor sea el coeficiente de distribución, cuanto más tiempo que pasa el componente en la fase estacionaria, dando por resultado la retención más veces para alcanzar el detector.

1. Siguiendo la tabla en el cuadro 1, pipetear la cantidad adecuada de cada componente en un matraz aforado de 50 mL.
2. Diluir cada una de las soluciones stock para la marca de 50 mL en matraces aforados con fase móvil.
3. Verter cada solución estándar en etiquetado pequeños viales en una gradilla de muestras.
4. Almacene los racks de muestras en un refrigerador, junto con las soluciones restantes en los matraces aforados de 50 mL.

4. comprobación de la configuración inicial del sistema HPLC

1. Confirman que la línea de residuos en un contenedor de residuos y no es el reciclaje en la fase móvil.
2. Verificar que el caudal de la fase móvil se establece en 0, 5 mL/min. Esto es lo suficientemente alto como para permitir que todos los picos eluir dentro de 5 min y frenar lo suficiente para permitir la buena resolución.
3. Verificar que la presión mínima y máxima y el caudal se establecen en los valores correctos en el panel frontal del sistema solvente (la bomba).
   1. Presión mínima: 250 psi (esto es para apagar la bomba, si se produce una fuga).
   2. Presión máxima: 4.000 psi (esto es para proteger la bomba de última hora, si la forma de un estorbo).
4. Pulsa el "cero" en el panel frontal del detector para el espacio en blanco (el blanco es la fase móvil pura).
5. Enjuague una jeringa de 100 μl con agua desionizada, luego con varios volúmenes de una de las normas de trabajo para ser analizado y llene la jeringa con la solución. Empezar con las 3 muestras del solo-componente, que permite identificar el pico de cada componente de interés.

5. manualmente inyectar la muestra y recolección de datos

1. Con el mango del inyector en la posición de carga, lentamente inyectar 100 μl de solución a través del puerto de tabique.
2. Verificar que el programa de recolección de datos está configurado para recopilar datos para 300 s, que permite suficiente tiempo para que todos los 3 picos a fin de eluir a través del detector.
3. Cuando esté listo para iniciar la prueba, gire la manija del inyector a la posición de inyectar (que inyecta la muestra en la fase móvil) y haga clic en "Iniciar prueba" en el programa de recolección de datos de computadora inmediatamente. Normas 1-3, sólo uno de los tres picos secuenciales aparecen en la pantalla durante la ejecución (figura 1).
4. Una vez 300 s han pasado, la recolección de datos envía un mensaje para guardar el archivo de datos. Guardar los datos bajo un nombre de archivo adecuada (p. ej., enfermedades de transmisión sexual #1).
5. Nota el tiempo en segundos para el pico de cada ensayo, que se utiliza en la identificación de ese componente.
6. Retire la jeringa del septo y repita el proceso para cada una de las restantes normas de trabajo, utilizando el mismo tiempo por el cromatograma como determinado a partir de la primera carrera.

Figura 1. El cromatograma de los 3 componentes. De izquierda a derecha, son cafeína, aspartamo y benzoato.

6. las muestras de refrescos de dieta

Coke Zero, Diet Coke y Pepsi de dieta son las "incógnitas". Se han quedado de envases abiertos durante la noche para deshacerse de la carbonatación, como burbujas no son buenas para el sistema HPLC. Esto suficientemente se deshace de los gases en las muestras.

1. Dibujar aproximadamente 2 mL de la soda de dieta en una jeringa de plástico.
2. Coloque la punta del filtro a la jeringa a través de Luer-Lok girando en su lugar.
3. Empujar el líquido en la jeringa a través del filtro y en un frasco pequeño de vidrio. Esto elimina las partículas no deseadas que potencialmente podrían obstruir la columna de la separación.
4. Diluir cada muestra con una cantidad igual de agua DI, por lo que son en el 50% de pureza.
5. Inyectar 100 μl de la muestra en el bucle de muestra y realizar ensayos con los mismos parámetros en cuanto a las normas.

7. cálculos

1. De las concentraciones de las soluciones de componente, calcular la concentración de todos los componentes en las normas, basadas en las diluciones que se realizaron para las 7 muestras.
2. Determinar las áreas de picos en los cromatogramas de cada estándar y muestras desconocidas por el método triangular, que es igual a horas punta de altura el ancho a la altura de ½ (figura 2). Después de determinar que pico corresponde a cada componente basado en el tiempo que tarda cada componente mostrar sus respectivos picos, entrar en estas áreas de pico en una hoja de cálculo de computadora.
3. Crear curvas de calibración de área de pico frente a concentración (mg/L) en las normas para los tres componentes.
4. Determinar que los mínimos de la cuadrados aptos para cada curva de calibración.
5. Calcular la concentración de cada componente en los refrescos de dieta de las áreas de pico que se muestra en los ensayos de HPLC de las muestras. Recuerde que el refresco de dieta se diluyó por un factor de 2 antes de inyectar en el sistema HPLC.
6. Calcular la cantidad, en mg/L, de cada componente de los refrescos de dieta.
7. Basándose en los resultados, calcular los miligramos de cada componente en una lata de 12 onzas de soda. Asumir 12 oz = 354,9 mL.

Figura 2. Un ejemplo básico de una curva pico alto y ancho, que se multiplicará (altura del pico veces ancho de altura ½).