$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
La saponificación es una técnica comúnmente utilizada para eliminar los ésteres metílicos de ácidos grasos de una mezcla orgánica compleja.
Las muestras orgánicas complejas a menudo se analizan mediante cromatografía de gases, que se utiliza para determinar las concentraciones relativas de componentes individuales.
Sin embargo, los compuestos que son similares en tamaño y estructura no pueden ser distinguidos por el instrumento, sesgando los resultados. Por lo tanto, los compuestos no deseados que producen señales superpuestas deben eliminarse para obtener resultados precisos.
Este video cubre el uso de la saponificación para purificar alquenonas para la paleoclimatología. Es el primero de una serie que detalla la purificación de muestras complejas de biomarcadores. Cubrirá el procedimiento, así como algunos otros usos de la técnica.
Se ha demostrado que las alquilcetonas poliinsaturadas de cadena larga, llamadas alquenonas, proporcionan información útil sobre la temperatura de la superficie del mar en el pasado.
Sin embargo, los organismos que producen alquenonas a menudo crean ésteres metílicos de ácidos grasos que son similares en tamaño y estructura química, llamados alquenoatos. Debido a estas similitudes, los alquenoatos deben eliminarse antes de que se pueda obtener un análisis preciso.
La saponificación es una técnica común utilizada para prevenir la coelución de estas moléculas. La saponificación utiliza agua para dividir el enlace molecular de un éster. Una base se adhiere al carbono en el corazón del alkenoato. Esta reacción de adición crea un intermediario inestable y el alcóxido es expulsado.
El hidrógeno del ácido recién formado se mueve al alcóxido expulsado, y el anión carboxilato resultante forma un enlace iónico con el catión de la base. El resultado es una sal de alcohol y un ácido graso. La adición de un ácido fuerte regenerará el ácido carboxílico. En este punto, el alkenoato ofensivo se ha convertido en una forma que ya no coeluye con la alquenona de interés.
Ahora que comprende cómo se puede usar la saponificación para purificar una mezcla orgánica, está listo para comenzar el procedimiento.
En primer lugar, adquiera un extracto lipídico total seco, o TLE, que se obtuvo mediante un método de extracción con disolventes. A continuación, prepare las soluciones de saponificación como se describe en el protocolo de texto. Asegúrese de que todos los componentes sean puros y estén libres de hidrocarburos. Una vez que las soluciones estén preparadas, agregue el TLE seco a un vial de vidrio de borosilicato de 60 ml. Agregue 2 mL de 2 hidróxido de potasio normal y selle el vial. A continuación, caliente el vial a 60 ? C durante 2,5 h para escindir el enlace éster. Una vez finalizado, deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente. Una vez que la muestra se haya enfriado, agregue 2 mL de solución de cloruro de sodio al 5% al vial. Tape el vial y agite brevemente. Agregue ácido clorhídrico 6 N gota a gota hasta alcanzar un pH de 2, usando papel de pH para probar. La adición de este ácido protonará el anión carboxilato para formar el producto final: el ácido carboxílico estable.
Ahora que la solución acidificada está libre de ésteres, agregue 5 mL de hexano. Tape y agite enérgicamente durante 5 segundos para extraer los compuestos orgánicos del agua. Deje reposar la solución hasta que las fases orgánica y acuosa se separen por completo. Las sales, los iones y el ácido clorhídrico sin reaccionar permanecerán en la fase acuosa, mientras que los compuestos orgánicos se separarán en el hexano. Una vez que las fases se hayan separado por completo, retire aproximadamente el 75% del hexano con una pipeta y dispense en otro vial de 40 ml. Repita este proceso de extracción dos veces más, agregando 5 mL de hexano cada vez. Una vez que esto esté completo, deseche la solución acuosa sobrante en un contenedor de desechos adecuado. Etiquete el vial que contiene la fase orgánica recién saponificada. Los ácidos carboxílicos producidos no se pueden inyectar en los instrumentos comúnmente utilizados para el análisis de alquenonas sin una purificación adicional. Los ácidos carboxílicos inyectados en un cromatógrafo de gases se acumulan rápidamente y arruinan las entradas, los revestimientos de entrada y el extremo frontal de las columnas. Para eliminar estos ácidos, primero es necesario someter la muestra a otra técnica de purificación: la separación mediante cromatografía en columna.
La saponificación tiene varias aplicaciones en la extracción y purificación de moléculas orgánicas.
La saponificación se puede utilizar no solo para separar biomarcadores, sino también para extraer componentes individuales para su uso en productos comerciales. En este ejemplo, los compuestos del árbol del tabaco -? Se aislaron y analizaron Nicotiana glauca para investigar su potencial como materia prima para una amplia variedad de productos de base biológica, como combustible, calor y una variedad de compuestos químicos.
Primero se homogeneizaron las hojas, luego se centrifugaron para concentrar las moléculas de interés. A continuación, se saponificó el material vegetal concentrado. El material extraído se analizó con cromatografía líquida-espectrometría de masas, para determinar la concentración de tocoferol, una familia de compuestos de vitamina E que se encuentran típicamente en las plantas.
El material extraído también puede ser reconstituido in vitro a su composición original. En este ejemplo, se utilizó la saponificación para extraer carotenoides de las plantas de espinaca, para luego ser reconstituidos in vitro. Primero se homogeneizó la espinaca, luego se centrifuga para cosechar las moléculas de pigmento. A continuación, estas moléculas se suspendieron en una solución de hidróxido de potasio en un embudo separador, iniciando la saponificación. Los carotenoides saponificados se separaron en una capa de éter, que se recogió y se secó. Utilizando una serie de tampones en solución, los carotenoides, y otras moléculas de pigmentación, se reconstituyeron posteriormente in vitro. Esta purificación permitió el análisis de estos pigmentos sin la interferencia de compuestos orgánicos de estructura similar.
Debido a su capacidad para hidrolizar ésteres, la saponificación se puede utilizar para "liberar" compuestos que de otro modo estarían unidos a macromoléculas. En este ejemplo, se utiliza un paso de saponificación anhidra para convertir el 4-fluorobenzoato de etilo en la sal de ácido carboxílico del 4-fluorobenzoato de potasio. Esta desprotección a través de la saponificación permite la producción de SFB crudo, una reacción que no sería posible si la molécula hubiera permanecido "atascada".
Acabas de ver la introducción de JoVE a la purificación de muestras de Uk'37 a través de la saponificación. Ahora debería comprender cómo funciona la saponificación y cómo usarla para purificar las alquenonas en un extracto lipídico total. En los siguientes vídeos se demostrarán otros procesos de purificación.
¡Gracias por mirar!
