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La cromatografía en columna es una técnica flexible para purificar la compleja mezcla de compuestos que se encuentran en los sedimentos. Las mezclas se separan a medida que se mueven a través de la columna y se recogen en fracciones, cada una de las cuales contiene una clase química diferente de compuestos. Por lo tanto, la cromatografía en columna se utiliza a menudo como un paso de purificación adicional después del aislamiento inicial del compuesto deseado. Los extractos orgánicos, como los extractos de lípidos totales, pueden ser mezclas complejas de muchos compuestos. Algunas técnicas de purificación, como la saponificación, introducen compuestos que pueden dañar los instrumentos analíticos y, por lo tanto, deben eliminarse antes del análisis. Este video es parte de una serie sobre extracción, purificación y análisis de lípidos a partir de sedimentos. Una vez que se recolecta un extracto lipídico total de una muestra sedimentaria, se utiliza la cromatografía en columna para purificar tanto las alquenonas como los GDGT, según el análisis deseado.
En la cromatografía en columna, se carga una mezcla de compuestos químicos en una fase estacionaria sólida, como el gel de sílice. A continuación, se utiliza una fase móvil, como un disolvente orgánico, para eluir o eliminar los compuestos de la columna. El orden en que se eluyen los compuestos depende de la fuerza de las interacciones de los compuestos con el gel de sílice y con el eluyente.
El eluido se recoge en fracciones, cada una de las cuales contiene diferentes compuestos de la mezcla. Dependiendo de las propiedades de los compuestos, un solo disolvente puede proporcionar suficiente separación y eluir todos los compuestos de interés. De lo contrario, se utilizan múltiples solventes para eluir cada compuesto de interés a su vez.
Los compuestos polares, que tienen una distribución desigual de la carga, se adsorben fuertemente al gel de sílice polar, mientras que los compuestos apolares se adsorben débilmente. Los disolventes polares tienen una mayor afinidad por el gel de sílice y, por lo tanto, son eluyentes más potentes que los disolventes apolares. Por lo tanto, los solventes apolares eluyen solo compuestos apolares, mientras que los solventes polares eluyen tanto compuestos apolares como polares.
Cuando los compuestos deseados son moderadamente polares, los compuestos apolares deben lavarse de la columna con un disolvente apolar antes de utilizar un disolvente polar. Para evitar eluir compuestos altamente polares no deseados, como los ácidos, un eluyente polar no debe tener más potencia de elución que la necesaria para el compuesto más polar deseado.
Ahora que comprende los principios de la cromatografía en columna, repasemos un procedimiento para la purificación de biomarcadores lipídicos a partir de un extracto lipídico total mediante cromatografía en columna de gel de sílice.
Para eliminar los contaminantes orgánicos, queme pipetas de vidrio de borosilicato, viales de vidrio de borosilicato y lana de vidrio durante 6 h a 550 μC. Una vez que la cristalería esté lista para su uso, coloque un estante para contener pipetas y viales. Obtenga bulbos de pipeta, pinzas limpias, una espátula de laboratorio, gel de sílice, hexano, diclorometano y metanol. Con unas pinzas limpias, coloque un pequeño mechón de lana de vidrio en la boca de una pipeta. Empuje suavemente la lana de vidrio hasta el fondo de la pipeta con el tallo de otra pipeta para formar un tapón suelto. Cargue con cuidado el gel de sílice en la pipeta hasta que esté medio llena. Fije la pipeta en posición vertical en la gradilla. Fije un vial de vidrio de borosilicato de 4 ml debajo de la punta de la pipeta para la recogida de residuos. En otro vial de vidrio de borosilicato, suspenda hasta 10 mg de muestra seca del proceso de saponificación en hexano. Si la muestra se adhiere a las paredes del vial, sonique el vial durante 5 min. Ahora puede comenzar el procedimiento de cromatografía.
Para comenzar la cromatografía, lave la columna de gel de sílice con 3 volúmenes de hexano para eliminar las burbujas de aire y las impurezas. A continuación, sustituya el vial de desecho por un vial vacío para la fracción apolar. Con una pipeta de vidrio, cargue la muestra en la columna y deje que la suspensión penetre en el gel de sílice. Trabaje rápidamente para que la columna no se seque durante el procedimiento. Enjuague el vial de muestra dos veces con pequeñas porciones de hexano y transfiera cada enjuague a la columna. Continúe agregando hexano a la columna hasta que el vial de recolección esté casi lleno. Deje que todo el hexano termine de ingresar al gel de sílice. A continuación, cambie el vial lleno por un vial vacío por la fracción polar media. A continuación, enjuague el vial de muestra con DCM y añádalo a la columna 3 veces. Continúe agregando DCM a la columna hasta que el vial de recolección esté casi lleno. Deje que el DCM termine de empapar el gel de sílice y luego cambie el vial lleno por un vial vacío por la fracción polar. Repita este proceso con metanol.
Una vez que el vial esté casi lleno, deje que el metanol termine de gotear en el vial y luego tape todos los viales. La fracción polar media contiene las alquenonas deseadas, mientras que las GDGT están en la fracción polar. En el caso de muestras de alquenona particularmente sucias o complejas, la fracción polar media debe purificarse aún más con aducción de urea, antes del análisis.
La cromatografía en columna es ampliamente utilizada en química como técnica analítica y de purificación.
Los nanotubos de carbono, o CNT, se utilizan cada vez más en muchas industrias, pero existe una creciente preocupación por sus efectos en la salud humana. La variación de las propiedades de los CNT cambia la forma en que se comportan en el agua y el suelo. Para investigar qué tan bien los medios porosos como la arena y la tierra retienen los CNT, se preparó una columna con suelo poroso como fase estacionaria. En primer lugar, se recogieron fracciones durante la carga de la solución de CNT en la columna para analizar el transporte de CNT a través del suelo. A continuación, se eluyeron los CNTs aún adsorbidos al suelo y se analizaron las fracciones para determinar la cantidad de CNTs que habían permanecido en el suelo. Los resultados permiten comprender la relación entre la funcionalización de la superficie de los CNT y sus mecanismos de transporte en el medio ambiente.
La cromatografía en columna puede utilizarse tanto a gran como a pequeña escala y, por lo tanto, se utiliza en el diseño de síntesis para aplicaciones industriales. Las sedas de araña tienen una excelente resistencia a la tracción y ductilidad, pero no se pueden cosechar a escala industrial. Después de la síntesis de proteínas de seda, las proteínas de seda recombinantes se purifican mediante cromatografía de afinidad, en la que la fase estacionaria está diseñada para atrapar solo la molécula deseada. El lavado y la elución minuciosos proporcionan las fracciones de proteína pura necesarias para hilar la seda de araña a gran escala.
Hay muchas fases estacionarias disponibles para la cromatografía en columna. Una fase estacionaria puede no ser adecuada para todos los productos potenciales de una síntesis con un amplio alcance de sustituyentes, como esta síntesis de yodoaziridina. El producto crudo se mezcla con varias fases estacionarias y la descomposición se evalúa mediante RMN de protones. Dado que la RMN de protones es muy sensible, se pueden analizar muchas fases estacionarias para determinar la descomposición del producto utilizando una pequeña cantidad de producto crudo. A continuación, se realiza la cromatografía en columna con la fase estacionaria óptima, lo que permite la purificación de compuestos nuevos y altamente reactivos.
Acaba de ver la introducción de JoVE a la cromatografía en columna para la purificación de un extracto lipídico total. El siguiente video demostrará cómo purificar aún más mezclas complejas que contienen alquenonas.
¡Gracias por mirar!
