Purificación de un extracto lípido Total con cromatografía de columna

Purification of a Total Lipid Extract with Column Chromatography

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Purification of a Total Lipid Extract with Column Chromatography

3.8: An Overview of bGDGT Biomarker Analysis for Paleoclimatology

3.15: Removal of Branched and Cyclic Compounds by Urea Adduction for U^k’₃₇ Paleothermometry

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09:18 min

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February 27, 2015

Overview

Fuente: Laboratorio de Jeff Salacup – Universidad de Massachusetts Amherst

El producto de una extracción con disolvente orgánico, un extracto total de lípidos (TLE), es a menudo una mezcla compleja de cientos, si no miles, de diferentes compuestos. El investigador a menudo solamente está interesado en un puñado de compuestos. Los compuestos de interés pueden pertenecer a una de varias clases de compuestos, tales como alcanos, cetonas, alcoholes o ácidos (figura 1), y puede ser útil eliminar las clases compuestas que no pertenece con el fin de obtener una visión más clara de los compuestos que le interesa. Por ejemplo, un ELT puede contener compuestos de 1.000, pero la U^k’proxy de temperatura de la superficie de mar de₃₇ se basa en sólo dos compuestos (alkenones) y el proxy de TEX⁸⁶mar temperatura superficial se basa en sólo cuatro (thioureas glicerol glicerol tetraethers). Que le tocaría el investigador para eliminar muchos de los compuestos que no les interesa. Esto hace que el análisis instrumental de los compuestos de interés (alkenones o GDGTs) menos propensos a ser complicada por otros compuestos extraños.

En otros casos, una técnica de purificación de aguas arriba puede han producido compuestos que desea ahora eliminar de la muestra, tales como la producción de ácidos carboxílicos durante la saponificación en nuestro video anterior. En ambos de estos casos es muy útil la técnica de purificación denominada cromatografía en columna.

Figura 1. Geoquímicamente importantes grupos funcionales. De Killops y Killops¹.

Principles

Cromatografía de columna de gel de silicona es una técnica de depuración que utiliza las diferentes asociaciones de clases compuestas discretas para una fase sólida de silicona, un polvo fino llamado un gel. Una pequeña pipeta se carga aproximadamente medio lleno con el gel (figura 2). Esta columna está entonces saturada con un disolvente apolar, a menudo de hexano. Entonces se carga una muestra en la parte superior del gel en la columna, y una serie de solventes de polaridad creciente se pasa secuencialmente a través de la muestra con el fin de separar en clases separadas de compuesto. La separación se basa en la afinidad de las diferentes clases compuestas para la fase sólida o fase solvente. Compuestos polares bonos más fuertemente a la sílice y por lo tanto, toman más disolventes polares para ser lavado de la columna. Así, utilizando una columna y una muestra, esa muestra se puede separar en varias fracciones; por ejemplo, apolars (hidrocarburos), mediados de polars (cetonas y alcoholes) y polares (ácidos y otros compuestos funcionalizados).

Figura 2. Imagen de un rack a medida que permite la purificación de hasta 12 muestras a la vez.

Cromatografía en columna es una técnica flexible para purificar la mezcla compleja de compuestos encontrados en el sedimento. Mezclas separan como se mueven a través de la columna y se recogen en fracciones, cada uno con una diferente clase química de los compuestos. Por lo tanto, cromatografía en columna se utiliza a menudo como un paso de purificación adicional después de aislamiento inicial del compuesto deseado. Orgánica extractos tales como extractos del total de lípidos pueden ser mezclas complejas de muchos compuestos. Algunas técnicas de purificación, como saponificación, presentan compuestos que pueden dañar los instrumentos analíticos y por lo tanto deben eliminarse antes del análisis. Este video es parte de una serie de extracción, purificación y análisis de los sedimentos. Una vez que un extracto lípido total se obtiene de una muestra sedimentaria, cromatografía en columna se utiliza para purificar el alkenones y GDGTs, según el análisis deseado.

En cromatografía de columna, una mezcla de compuestos químicos se carga sobre una fase estacionaria sólida como gel de sílice. Una fase móvil como un solvente orgánico se utiliza entonces para eluir, o eliminar, los compuestos de la columna. El orden en que se eluyen los compuestos depende de la fuerza las interacciones de los compuestos con el gel de sílice y con el eluyente.

El efluente se recoge en fracciones, cada una con diferentes compuestos de la mezcla. Dependiendo de las propiedades de los compuestos, un solvente único puede proporcionar suficiente separación y procederá a la elución de los compuestos de interés. De lo contrario, se utilizan múltiples solventes a fin de eluir cada compuesto de interés a su vez.

Compuestos polares, que tienen una distribución desigual de la carga, fijan por adsorción fuertemente el polar gel de sílice, mientras que los compuestos apolar por adsorción débil. Solventes polares tienen mayor afinidad por gel de sílice y por lo tanto eluyentes más de gran alcance que solventes apolar. Por lo tanto, solventes apolar elución compuestos único apolar, mientras que los solventes polares elución compuestos polares y apolar.

Cuando los compuestos deseados son moderadamente polares, apolar compuestos se deben lavar la columna con un disolvente apolar antes de utiliza un solvente polar. Para evitar el liberador no deseados compuestos altamente polares, como ácidos, un eluyente polar no debe tener más poder liberador que necesitó para el compuesto deseado más polar.

Ahora que usted entiende los principios de la cromatografía en columna, vamos a ir a través de un procedimiento para la purificación de biomarcadores lípidos de un extracto total de lípidos por cromatografía de columna de gel de silicona.

Para eliminar contaminantes orgánicos, combustión pipetas de vidrio de borosilicato, viales de borosilicato vidrio y lana de vidrio de 6 h a 550 ° C. Una vez que la cristalería está lista para usar, configurar una parrilla para sostener pipetas y frascos. Obtener pipeta bombillas, limpiar pinzas, espátula de laboratorio, gel de sílice, hexano, diclorometano y metanol. Con unas pinzas limpias, coloque un pequeño mechón de lana de vidrio en la boca de una pipeta. Empuje suavemente la lana de vidrio en la parte inferior de la pipeta con el vástago de pipeta de otro para formar un tapón suelto. Cuidadosamente la carga gel de sílice dentro de la pipeta hasta la mitad. Fije el montante de la pipeta en el rack. Asegure un frasco de vidrio de borosilicato de 4-mL debajo de la punta de la pipeta para recogida de residuos. En otro frasco de vidrio de borosilicato, suspender hasta 10 mg de muestra seca desde el proceso saponificación en hexano. Si la muestra se pega a las paredes del frasco, someter a ultrasonidos el frasco por 5 minutos. Ahora puede comenzar el procedimiento de cromatografía.

Para empezar la cromatografía, lavar la columna de gel de silicona con 3 volúmenes de hexano para extraer las burbujas de aire y las impurezas. Entonces, vuelva a colocar el frasco de residuos con un frasco vacío de la fracción apolar. Con una pipeta de vidrio, carga la muestra en la columna y permitir que la suspensión absorba el gel de sílice. Trabajar con rapidez para que la columna no se deseque durante el procedimiento. Enjuagar el frasco dos veces con pequeñas porciones de hexano de la muestra y transferir cada enjuague a la columna. Seguir añadiendo hexano a la columna hasta que el frasco está casi lleno. Permitir a todos el hexano para terminar entrando en el gel de sílice. Entonces, cambio el frasco lleno con un frasco vacío de la fracción polar mediados. Luego, enjuague el frasco de la muestra con DCM y añadir a la columna 3 veces. Seguir añadiendo DCM a la columna hasta que el frasco está casi lleno. Permite el DCM terminar empapando en el gel de sílice y luego cambio el frasco lleno con un frasco vacío de la fracción polar. Repita este proceso con metanol.

Una vez que el frasco está casi completo, permita que el metanol termine gotear en el frasco y luego tapa de los frascos. La fracción polar mediados contiene el alkenones deseado, mientras que el GDGTs se encuentran en la fracción polar. Para muestras de alkenone particularmente sucia o complejo, la fracción polar mediados deberá purificarse aún más con la aducción de la urea, antes del análisis.

Cromatografía en columna es ampliamente utilizada en química como una técnica de análisis y purificación.

Nanotubos de carbono, o CNTs, cada vez más se utilizan en muchas industrias, pero hay una creciente preocupación de sus efectos sobre la salud humana. Variando las propiedades de los CNTs cambios cómo se comportan en el agua y el suelo. Para investigar cómo medios porosos como arena y la suciedad retienen CNTs, una columna se preparó con suelo poroso como la fase estacionaria. En primer lugar, se obtuvieron fracciones durante la carga de la solución de la CNT en la columna a analizar el transporte de los CNTs en el suelo. Luego, se eluyeron el CNTs todavía adsorbidos al suelo y las fracciones se analizaron por la cantidad de nanotubos que se han quedado en el suelo. Los resultados dan información sobre la relación entre funcionalización superficial de CNT y sus mecanismos de transporte en el medio ambiente.

Cromatografía en columna se puede funcionar a escalas grandes y pequeñas, y es cuando por lo tanto utiliza diseño de síntesis para aplicaciones industriales. Sedas de araña tienen excelente resistencia a la tracción y ductilidad, pero no pueden ser cosechados a escala industrial. Después de la síntesis de proteínas de seda, las seda proteínas recombinantes son purificadas mediante cromatografía de afinidad, en la que la fase estacionaria está diseñada para atrapar sólo la molécula deseada. Cuidadoso lavado y elución concede las fracciones de proteína pura necesarias para girar de la seda de araña en gran escala.

Existen muchas fases estacionarias para cromatografía en columna. Una fase inmóvil puede no ser conveniente para todos los productos posibles de una síntesis con una amplia gama de sustituyentes, como esta síntesis iodoaziridine. Producto crudo se mezcla con diferentes fases estacionarias y descomposición por protón NMR. Como protón NMR es muy sensible, muchas fases estacionarias pueden ser defendidas para descomposición de producto usando una pequeña cantidad de producto crudo. Cromatografía de columna se realiza con la fase estacionaria óptima, permitiendo la purificación de compuestos altamente reactivos y novela.

Sólo ha visto la introducción de Zeus para cromatografía en columna para la purificación de un extracto lípido total. El siguiente video mostrará cómo purificar más mezclas complejas que contienen alkenones.

¡Gracias por ver!

Procedure

1. configuración y preparación de materiales

Obtener un total de lípidos extracto (TLE) utilizando un método de extracción por solvente (sonicación, Soxhlet o extracción acelerada de disolvente (ASE)).
Se reúnen las siguientes: combustión de borosilicato de vidrio pipetas y bulbos, gel de sílice, hexano, diclorometano (DCM) y el metanol.
1. Estos materiales pueden adquirirse en cualquier tienda química. Los reactivos deben ser puro y libre de hidrocarburos.
También obtener combustión lana de vidrio y frascos de vidrio de borosilicato de 4 mL.
Asegúrese de tener un medio de apoyo a la columna y los frascos de colección durante el procedimiento. Por ejemplo, un soporte con pinzas y un rack de vil. Muchos laboratorios han diseñado a medida estantes que contienen varias columnas y frascos de colección (figura 2). Esto permite que muchas columnas para ejecutarse al mismo tiempo.

2. métodos

Comenzar con la muestra seca en un vial de 4 mL. Si la muestra se pesa más de ~ 10 mg cuando seco, necesite dividirse antes de realizar los pasos como el gel de silicona sólo pueden reaccionar con una masa finita de materia orgánica.
Suspender la muestra en una pequeña cantidad de hexano. Este es el primero y el menos polar de los tres solventes utilizados en este experimento.
Si hay pegada en el interior del frasco de la muestra, someter a ultrasonidos las muestras durante 5 minutos.
Coloque una pequeña cantidad de lana de vidrio en la parte superior de una pipeta mediante un conjunto de pinzas limpias. Empuje suavemente la lana de vidrio en la parte inferior de la pipeta, con otra pipeta, para formar un tapón.
Cuidadosamente transfiera gel de sílice en la pipeta hasta que esté aproximadamente medio llena.
Colocar un frasco de 4 mL de recolección debajo de la columna.
Remojo el gel de sílice en la pipeta y 3 volúmenes de hexano. Esto condiciona la columna, elimina las burbujas de aire y enjuaga las impurezas de la gel de sílice.
Una vez hecho el lavado final, sacar la cubeta de recogida de residuos y reemplácelo con un frasco para recoger la fracción apolar.
Cuidadosamente transfiera toda la muestra en hexano a la columna mediante una pipeta. Enjuagar el frasco de la muestra dos veces con pequeños volúmenes de hexano y transferir a la columna. Permita que el hexano de que la muestra fue transferida en que absorba totalmente el gel de sílice. En ningún momento durante el procedimiento si el gel de sílice seca.
Continuar agregando hexano en la parte superior de la muestra hasta que el frasco debajo de la columna es casi completo (~ 4 mL).
1. Permitir a todos el hexano para entrar en el gel de silicona antes de comenzar con el siguiente solvente.
Coloque el frasco debajo de la columna media polaridad.
Añadir DCM a la parte superior de la columna hasta que el frasco está casi lleno. Una vez más, permite todos lo DCM para entrar en el frasco antes de comenzar el siguiente solvente.
Coloque el frasco debajo de la columna polar.
Agregar metanol a la parte superior de la columna hasta que la colección vil está casi llena.

Results

Esta técnica de purificación produce tres frascos diferentes, cada uno con una diferente clase compuesto o grupo de clases de compuestos. Se ha reducido enormemente la complejidad de cualquier muestra para su análisis en un instrumento. Este proceso también elimina compuestos, como ácidos que se producen durante una saponificación, que realmente puede pegarse a las partes de los instrumentos, debido a su baja volatilidad, que disminuiría su exactitud, precisión y vida útil.

Applications and Summary

Alkenones y isoprenoidal GDGTs son dos componentes muy comunes de los sedimentos marinos y pueden encontrarse a través de los océanos del mundo. Alkenones que se detectan cada vez más en los sedimentos del lago, aunque los organismos responsables de su producción son diferentes que en el océano y, por tanto, la relación entre la U^k’₃₇ proporción y temperatura del agua (calibración) es diferente del océano e incluso entre distintos lagos. Isoprenoidal GDGTs se encuentran en algunos grandes lagos, al igual que alkenones, a menudo necesitan una calibración local.

La alkenones y GDGTs estamos interesados en salen en la cetona y fracciones polares, respectivamente. En los sedimentos marinos a menudo analizamos a ambos poderes de temperatura superficial (SST) de mar de una muestra. Esto permite la construcción de dos independiente SST records, el cual muestra la evolución de la temperatura del agua en el sitio de la base a través del tiempo. Esta comparación, llamada un enfoque multi-proxy, a menudo destaca veces cuando los dos proxies de acuerdo y cuando no lo hacen. Este acuerdo o la discrepancia sí mismo contiene información. Si los dos proxies de acuerdo, tal vez los organismos productores ocupan el mismo hábitat de profundidad, o tal vez vivieron en distintas profundidades pero una columna de agua bien mezclada condujo a la homogeneización vertical de temperatura (agua generalmente se refresca con profundidad). Si no están de acuerdo los dos proxies, podría ser que las dos poblaciones vivieron a distintas profundidades; viven en aguas cálidas, someras y en aguas más frescas, más profundo. O podría ser que los compuestos produjeron durante diferentes épocas del año y así reflejar las temperaturas de las diferentes estaciones. Estas preguntas son creadas por el análisis de dos diferentes proxies de SST en el mismo sitio y ponen de manifiesto los geoquímicos orgánicos cuidado y paleo climatólogos necesitan tomar al interpretar sus datos.

Debido a la alta estabilidad relativa de hidrocarburos apolar, la fracción apolar contiene muchos compuestos orgánicos interesantes. Alcanos son constituyentes importantes de la capa cerosa externa de la hoja y se utilizan en los registros de sedimentos por muchas razones. Su longitud de cadena media (número de átomos de carbono) contiene información sobre el dominio acuático frente a las plantas terrestres, la temperatura y la precipitación. La relación isotópica de carbono en los alcanos se relaciona con el tipo de planta C3 vs C4 de la planta que lo produjo y la proporción de isótopos de hidrógeno está relacionado con locales a la precipitación y la temperatura global. Esteranos y hopanes también se encuentran en la fracción apolar. Estos biomarcadores son las versiones geostable de compuestos bioactivos como hopanoids y esteroides, que sirven a funciones bioquímicas importantes en procariotas y eucariotas, respectivamente.

La fracción de polaridad media contiene nuestro alkenones. Alkenones son las cetonas, que son importantes registradores de temperaturas de la superficie antigua vía el U^k’proxy de temperatura superficial de mar₃₇ . Algunas cetonas también provienen de la misma hoja de ceras que hacen los alcanos, aunque hay generalmente mucho menos.

La fracción polar contiene ácidos carboxílicos, otro importante constituyente en cera de la hoja, que es ligeramente menos específico y más difícil de trabajar con que alcanos (baja volatilidad) pero sin embargo pueden identificarse con algunos de la misma información. Tetraethers de glicerol glicerol thioureas (GDGTs) son en la fracción polar y otro importante grabador de temperaturas de agua y de aire antiguo.

References

Killops, S. and Killops, V. Introduction to Organic Geochemistry. Blackwell Publishing, Malden, MA (2005).

Transcript

Column chromatography is a flexible technique for purifying the complex mixture of compounds found in sediment. Mixtures separate as they move through the column and are collected in fractions, each containing a different chemical class of compounds. Therefore, column chromatography is often used as an additional purification step after initial isolation of the desired compound. Organic extracts such as total lipid extracts may be complex mixtures of many compounds. Some purification techniques, such as saponification, introduce compounds that can damage analytical instruments and so must be removed before analysis. This video is part of a series on lipid extraction, purification, and analysis from sediments. Once a total lipid extract is collected from a sedimentary sample, column chromatography is used to purify both alkenones and GDGTs, depending on the desired analysis.

In column chromatography, a mixture of chemical compounds is loaded onto a solid stationary phase such as silica gel. A mobile phase such as an organic solvent is then used to elute, or remove, the compounds from the column. The order in which the compounds are eluted depends on the strength of the interactions of the compounds with the silica gel and with the eluent.

The eluate is collected in fractions, each containing different compounds from the mixture. Depending on the properties of the compounds, a single solvent may provide sufficient separation and elute all of the compounds of interest. Otherwise, multiple solvents are used to elute each compound of interest in turn.

Polar compounds, which have an uneven distribution of charge, adsorb strongly to the polar silica gel, whereas apolar compounds adsorb weakly. Polar solvents have greater affinity for silica gel and therefore are more powerful eluents than apolar solvents. Thus, apolar solvents elute only apolar compounds, whereas polar solvents elute both apolar and polar compounds.

When the desired compounds are moderately polar, apolar compounds should be washed off the column with an apolar solvent before a polar solvent is used. To avoid eluting unwanted highly polar compounds such as acids, a polar eluent should not have more eluting power than needed for the most polar desired compound.

Now that you understand the principles of column chromatography, let’s go through a procedure for purification of lipid biomarkers from a total lipid extract by silica gel column chromatography.

To remove organic contaminants, combust borosilicate glass pipettes, borosilicate glass vials, and glass wool for 6 h at 550 °C. Once the glassware is ready for use, set up a rack to hold pipettes and vials. Obtain pipette bulbs, clean tweezers, a laboratory spatula, silica gel, hexane, dichloromethane, and methanol. With clean tweezers, place a small tuft of glass wool into the mouth of a pipette. Gently push the glass wool to the bottom of the pipette with the stem of another pipette to form a loose plug. Carefully load silica gel into the pipette until half full. Secure the pipette upright in the rack. Secure a 4-mL borosilicate glass vial below the tip of the pipette for waste collection. In another borosilicate glass vial, suspend up to 10 mg of dry sample from the saponification process in hexane. If the sample sticks to the walls of the vial, sonicate the vial for 5 min. The chromatography procedure can now begin.

To begin the chromatography, wash the silica gel column with 3 volumes of hexane to remove air bubbles and impurities. Then, replace the waste vial with an empty vial for the apolar fraction. With a glass pipette, load the sample onto the column and allow the suspension to soak into the silica gel. Work quickly so the column does not dry out during the procedure. Rinse the sample vial twice with small portions of hexane and transfer each rinse to the column. Continue adding hexane to the column until the collection vial is nearly full. Allow all of the hexane to finish entering the silica gel. Then, exchange the filled vial with an empty vial for the mid-polar fraction. Next, rinse the sample vial with DCM and add it to the column 3 times. Continue adding DCM to the column until the collection vial is nearly full. Allow the DCM to finish soaking into the silica gel and then exchange the filled vial with an empty vial for the polar fraction. Repeat this process with methanol.

Once the vial is nearly full, allow the methanol to finish dripping into the vial and then cap all of the vials. The mid-polar fraction contains the desired alkenones, while the GDGTs are in the polar fraction. For particularly dirty or complex alkenone samples, the mid-polar fraction must be further purified with urea adduction, before analysis.

Column chromatography is widely used in chemistry as an analytical and purification technique.

Carbon nanotubes, or CNTs, are increasingly used in many industries, but there is growing concern of their effects on human health. Varying the properties of CNTs changes how they behave in water and soil. To investigate how well porous media like sand and dirt retain CNTs, a column was prepared with porous soil as the stationary phase. First, fractions were collected during loading of the CNT solution onto the column to analyze the transport of CNTs through soil. Then, the CNTs still adsorbed to the soil were eluted and the fractions analyzed for the amount of CNTs that had remained in soil. The results lend insight into the relationship between CNT surface functionalization and their transport mechanisms in the environment.

Column chromatography can be operated on both large and small scales, and is therefore used when designing syntheses for industrial applications. Spider silks have excellent tensile strength and ductility, but cannot be harvested on an industrial scale. Following silk protein synthesis, the recombinant silk proteins are purified by affinity chromatography, in which the stationary phase is designed to trap only the desired molecule. Thorough washing and elution grants the pure protein fractions needed to spin spider silk in large scales.

Many stationary phases are available for column chromatography. One stationary phase may not be suitable for all potential products of a synthesis with a broad substituent scope, such as this iodoaziridine synthesis. Crude product is mixed with various stationary phases and decomposition assessed by proton NMR. As proton NMR is highly sensitive, many stationary phases can be screened for product decomposition using a small amount of crude product. Column chromatography is then performed with the optimal stationary phase, allowing purification of novel and highly reactive compounds.

You’ve just watched JoVE’s introduction to column chromatography for the purification of a total lipid extract. The following video will demonstrate how to further purify complex mixtures containing alkenones.

Thanks for watching!

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