$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Los virus son partículas biológicas infecciosas que son responsables de muchas enfermedades, desde el resfriado y la gripe, hasta la hepatitis y el VIH.
Los virus son partículas biológicas que consisten en un genoma de ADN o ARN, envueltas dentro de una capa de proteína conocida como cápside, a veces con una envoltura lipídica adicional. Los virus no tienen capacidad metabólica o reproductiva por sí mismos, y deben invadir las células vivas y secuestrar su maquinaria celular para hacer más copias de sí mismos.
Tanto las células procariotas, como las bacterias, como las células eucariotas, como las de los humanos, pueden ser infectadas por clases específicas de virus. En concreto, los bacteriófagos son virus que infectan a las bacterias. Por ejemplo, los colifagos son aquellos fagos que infectan a E. coli, una bacteria intestinal común, algunas cepas de las cuales pueden causar intoxicación alimentaria, y que es una indicación de contaminación fecal del suministro de agua.
Si bien no se sabe generalmente que los fagos en sí mismos sean patógenos en los seres humanos, existe evidencia de que son indicadores sustitutos confiables para los enterovirus causantes de enfermedades que también se transmiten fecalmente pero son difíciles de analizar. La disponibilidad de métodos relativamente rápidos y baratos para enumerar bacteriófagos los convierte en una herramienta atractiva para la evaluación de la contaminación fecal en muestras ambientales.
Este video presentará los principios detrás de la enumeración de fagos; demostrará un protocolo para cuantificar fagos, conocido como el ensayo de placa; y finalmente, explorará varias aplicaciones de la ciencia ambiental para la detección y el conteo de fagos y otros virus.
Los bacteriófagos, como todos los virus, deben parasitar las células vivas, en este caso las bacterias, para poder reproducirse.
Los fagos lo hacen aterrizando y adhiriéndose a la superficie de la célula bacteriana e inyectando sus materiales genéticos en la célula. Una vez dentro de la célula, el genoma viral se replica y se producen los componentes proteicos de la cápside viral, ambos utilizando la maquinaria bioquímica de la célula huésped. Una vez que las partículas del fago se ensamblan, se liberan de las bacterias, a menudo lisando al huésped y estallando, matando a la célula huésped en el proceso.
Un método ampliamente utilizado para determinar la concentración de fagos en una muestra aprovecha esta actividad lítica. En esta técnica, el fago de la muestra se mezcla con bacterias y agar blando. Esta mezcla se vierte en placas de Petri con agar regular como sustrato, y la capa superior forma una superposición.
Las bacterias están en una concentración tan alta que forman un césped continuo. Las bacterias deben obtenerse de cultivos que se encuentren en la fase logarítmica de crecimiento, para garantizar que todas las bacterias infectadas por los fagos estén vivas y permitan que el fago produzca progenie.
Cuando una partícula de fago infecta y lisa una bacteria, la progenie del fago se propagará a las células bacterianas cercanas y continuará la infección. El agar blando restringe la difusión de las partículas de fagos. Eventualmente, se formará un área de claro, conocida como placa.
Si el fago se diluye a una concentración lo suficientemente baja, se pueden observar placas individuales discretas en el césped bacteriano. Estos se pueden contar y usar para calcular el número de unidades formadoras de placas, o PFU, de fago por ml de la muestra original.
Ahora que comprende cómo los fagos infectan a las bacterias y cómo se puede usar esta actividad para medir la concentración de fagos, repasemos un protocolo para usar un ensayo de placa para enumerar fagos en muestras de agua ambiental.
Un día antes de realizar el ensayo, inocular una colonia de E. coli cepa ATCC 15597 en 100 mL de caldo de soja tripticasa en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. Incubarlo agitando a 35 ? C durante la noche.
3 h antes del ensayo, inocule 1 mL del cultivo de E. coli durante la noche en 100 mL de caldo fresco. Coloque este nuevo cultivo en un baño de agua agitado a una temperatura entre 35 y 37 μC. Esto asegura que las bacterias estén en la fase logarítmica de crecimiento cuando comienza el ensayo.
Para iniciar el ensayo de placa, realice diluciones en serie de 10 y 100 veces de la muestra de agua, utilizando 9 ml de tampón Tris.
Con un baño de vapor, derrita tres tubos de 5 ml de agar blando al 0,7%, ya sea tripticasa de soja o agar nutriente. Una vez derretido, colóquelo en un baño de agua a 45 a 48 ? C durante al menos 15 minutos para que la temperatura del agar baje a 45 μC.
Al primer tubo de agar blando, agregue 1 mL del cultivo de E. coli en fase logarítmica previamente preparado y 1 mL de la muestra de agua sin diluir. Retire el tubo del baño de agua y muévalo suavemente entre sus manos durante 2-3 segundos para mezclar la suspensión.
Vierta el agar blando sobre una placa de Petri previamente preparada con tripticasa, soja o agar nutriente. Gire rápidamente la placa para extenderla, asegurándose de que cubra toda la superficie.
Repita la inoculación y el enchapado de los otros dos tubos, utilizando 1 mL de cada una de las muestras diluidas.
Una vez que el agar superior se haya solidificado, invierta los platos e incube a 37 ? C durante 48 h.
Después de la incubación, cuente el número de plagas en cada plato. A partir del recuento, calcule la concentración de fagos en la muestra original
Por ejemplo, si se obtuvieron 9 placas de la placa de dilución de 10 veces, entonces hay 9 por 10 dividido por 1 mL, o 90 PFU / mL de colifagos en la muestra de agua original.
Ahora que ha visto cómo se realizan los ensayos de placa de fagos, veamos cómo se pueden usar los ensayos de placa para enumerar fagos y otros tipos de virus de una variedad de fuentes.
Los métodos basados en el ensayo de placa se pueden utilizar para aislar bacteriófagos de diferentes muestras ambientales, como el suelo. En este ejemplo, los investigadores primero recolectaron fagos del suelo por filtración. A continuación, el fago se utilizó para infectar la bacteria común del suelo Arthrobacter en un ensayo de placa. Los fagos se seleccionaron de placas individuales y se rayaron en nuevas placas de agar, y luego se superpusieron con agar superior que contenía bacterias. La concentración de fagos disminuye a lo largo de la raya, por lo que se pueden obtener placas discretas, probablemente formadas por un solo tipo de fago. Estas placas individuales podrían seleccionarse para analizar más a fondo los fagos que contienen.
Además de los bacteriófagos, los ensayos de placa también se pueden realizar con otros virus, incluidos los que, como la gripe, infectan a los mamíferos. Para ello, las células de mamíferos se cultivan primero como monocapas en placas de cultivo de tejidos. A continuación, se añaden medios que contienen los virus a las células para permitir que se produzca la infección, antes de que las células se superpongan con un medio inmovilizador como la agarosa gelatinosa. Después de un período de incubación que puede durar hasta dos semanas, las células infectadas se fijan y tiñen para permitir que las placas se visualicen y cuenten.
Por último, además de las muestras recogidas en el medio ambiente, los ensayos de placa son útiles para detectar y enumerar virus en muestras de tejido de individuos infectados. Aquí, los investigadores obtuvieron y homogeneizaron tejidos pulmonares de ratones infectados con gamma-herpesvirus. Este homogeneizado que contenía virus se utilizó para infectar el cultivo de células de mamíferos. A continuación, se podría contar el número de placas para proporcionar una estimación del título viral en los tejidos pulmonares infectados.
Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la detección de bacteriófagos en muestras ambientales. Ahora debe comprender la biología básica de los fagos, cómo realizar un ensayo de placa para cuantificar fagos en una muestra ambiental y cómo se pueden usar los ensayos de placa para estudiar fagos y otros virus en muestras ambientales o clínicas. Como siempre, ¡gracias por mirar!
