Detección de bacteriófagos en muestras ambientales

1. Obtener una muestra de aguas residuales o aguas que contienen colifago.
2. Diluir la muestra 1:10 y 1: 100 utilizando tampón Tris. Para ello, transferir 1,0 mL de cultivo a 9 mL de tampón Tris y luego hacer una dilución de 10 veces en segundo lugar.
3. Fundir los tres tubos de agar blando (0,7% de agar nutritivo o agar de soja trypticase por tubo de 3 mL) colocándolos en un baño de vapor o autoclave.
4. Ponga el agar en un baño de agua a 45-48 ° C por 15 min para permitir que la temperatura del agar a 45 ° C.
5. Al primer tubo agregar 1 mL de un cultivo en caldo fase log de e. coli¹ y 1 mL de muestra sin diluir.
6. Retire el tubo del baño de agua y suavemente roca entre las manos para mezclar la suspensión de s de 2-3.
7. Limpie el agua del tubo con una toalla de papel y verter el agar en una placa Petri previamente preparadas que contienen agar base (agar nutritivo regular o agar de soja trypticase).
8. Gire rápidamente la placa para difundir el agar superior. Asegúrese de que el agar cubre toda la superficie.
9. Repita los pasos 5-8 con los otros dos tubos de agar blando, utilizando 1 mL de bacterias y 1 mL de cada dilución de la muestra (figura 2).
10. Después de que se haya solidificado el agar, invertir las cajas Petri e incubar a 37 ° C por 48 h. golpee cualquier humedad de la tapa de la caja Petri. Si cae una gota de humedad en una placa hará que el virus se propague en toda la superficie del agar.
11. Después de la incubación, cuente el número de placas en cada dilución (figura 3) y calcular la concentración de fagos en la muestra original. Anotar las principales diferencias en el tamaño o aspecto de las placas.

Figura 2. Procedimiento para la preparación de un césped bacteriano usando top agar para el recuento de colifago.

Figura 3. Placas de fagos sobre un césped bacteriano.

¹ Cepa de e. coli ATCC 15597 generalmente produce el mayor número de placas de muestras de aguas residuales. Se debe cultivar durante la noche en un erlenmeyer de 250 mL que contenga 100 mL de caldo de nutrientes o tripticasa soya e incubados bajo condiciones de agitación a 35 ° C. 3 h antes del ensayo de fago inocular 1 mL de esta cultura en un fresco frasco que contenga 100 mL de caldo de nutrientes o tripticasa soya y el lugar en un baño a 35-37 ° C. Esto asegurará que las bacterias están en la fase logarítmica de crecimiento.