Aislamiento de bacterias fecales de muestras de agua por filtración

1. recogida de muestras y procesamiento del agua

1. Recoger varias muestras de 1 L de agua de la fuente de agua de prueba (por ejemplo, fuentes de agua, piscinas, embalses, sistemas de distribución de agua, aguas residuales crudas o tratadas) y transporte en hielo al laboratorio para su análisis microbiano.
2. Esterilizar o desinfectar el conjunto múltiple de filtración de membrana antes de uso en autoclave, exposición a ignición de radiación (2 min), o etanol de la llama de UV.
3. A enfriamiento de todas las partes, conectar correctamente el múltiple a una bomba de vacío y vacío filtrado residuos frasco que contenga lejía.
4. Etanol-llama esterilizar un par de pinzas y con ellas, quitar un filtro de membrana estéril, cuadriculada de su embalaje. Por lo general se utilizan membranas de 47 mm de diámetro con un tamaño de poro de 0,45 μm. Sin embargo, alternan diámetros y tamaños de poro pueden emplearse siempre que el tamaño del poro suficientemente puede atrapar los microorganismos de la blanco, y al menos 70% de la superficie de filtro se compone de espacio de poro.
5. Coloque el filtro en el centro de la zona de filtración de membrana de los colectores y aplica un embudo de filtro estéril a la unidad y asegúrela en su lugar.
6. Medir un volumen de agua de prueba (por ejemplo 100 mL) y agregarla en el embudo (una marca de 100 mL línea es visible en el embudo).
7. Aplicar un vacío parcial [presión diferencial de 34 a 51 kPa (kilopascales)] para extraer la muestra a través del filtro. Total suspendido material sólido, incluyendo bacterias y descomposición de materia orgánica, mayor que el filtro de medio tamaño de poro de 0.45 μm son atrapadas en el filtro. Partículas más pequeñas incluyendo virus y sólidos disueltos tales como pequeñas cantidades de materia orgánica y sales, pasará a través de la membrana y en el matraz de vacío contenedor de residuos que contienen cloro.
8. Tras la aprobación completa de la muestra a través del filtro, enjuague el interior del embudo con dos o tres volúmenes de 20-30 mL de agua estéril.
9. Apagado el vacío y retire el embudo colector al cierre del enjuague final.
10. Con pinzas estériles etanol-llama, inmediatamente retire el filtro de membrana de la unidad y colocarlo rápidamente en el medio de agarosa de crecimiento apropiado para el microorganismo de destino (la tabla 1 enumera las condiciones de incubación y los medios de crecimiento recomendado para cada uno).
11. Aplicar el filtro de membrana en la superficie de agarosa con un movimiento de tipo rodillo para asegurar el contacto completo de la membrana con el medio de crecimiento y para evitar el atrapamiento de burbujas de aire.
12. Vuelva a colocar el embudo de filtración usados con una unidad estéril entre el procesamiento de cada muestra y etanol-desinfectar el colector de acero inoxidable para evitar la contaminación cruzada.

2. Colonia (enumeración)

1. Tras el período de incubación, retirar las placas de crecimiento de la incubadora para la enumeración.
2. Lo ideal es realizar los recuentos de colonias bajo ampliación de baja potencia utilizando una fuente de luz fría, blanca.
3. Coliformes totales
   1. Colonias de coliformes totales son típicamente rosadas a rojo oscuro en color con un brillo metálico de la superficie. El brillo puede cubrir parcial o totalmente la Colonia. Morfologías de colonias coliformes total anormal pueden ser rojo oscuro, nucleada sin brillo o mucoide.
   2. Las colonias que son rosa, azul, blanco o incoloro al carecer de brillo se consideran no coliformes.
4. Coliformes fecales
   1. Colonias de coliformes fecales aparezcan como distintos tonos de azul.
   2. Nonfecal colonias de coliformes son de color gris a crema en color.
5. Enterococos fecales
   1. Enterococos fecales colonias entre rosa y rojo oscuro en color.

3. Colonia verificación

1. Coliformes totales
   1. Verificación de presencia-ausencia, limpiar la membrana entera usando un asa de inoculación estéril. Para las colonias, es preferible verificar por lo menos cinco cada de morfologías típicas y atípicas.
   2. Transferir la Colonia seleccionada en un recipiente de vidrio que contenga caldo de triptosa de laurilo con un tubo de Durham. Incubar los tubos inoculados a 35±0.5 ° C por 48 h. La presencia de crecimiento indicando turbidez conjuntamente con producción de gas verifica a la Colonia como un coliforme.
2. Coliformes fecales
   1. Transferir asépticamente colonias de color azules en los recipientes de vidrio que contiene el medio estéril de CE con un tubo de Durham. Incubar los tubos inoculados a 44,5 ± 0,2 ° C por 24 h. La presencia de crecimiento indicando turbidez conjuntamente con producción de gas verifica a la Colonia como un coliforme fecal.
3. Enterococos fecales
   1. Huelga colonias representando morfología de enterococos fecales para aislamiento asépticamente en cerebro corazón infusión Agar (BHIA) e incubar a 35 ± 0,5 ° C por 24 a 48 h.
   2. Transferencia de crecimiento de una colonia aislada en BHIA sobre dos portaobjetos previamente limpiado.
   3. Añadir dos o tres gotas de peróxido de hidrógeno 3% a los borrones de transferencia preparados de las diapositivas. La rápida aparición de burbujas indica un resultado de "catalasa positiva", y el aislante no es una bacteria estreptococo fecal.
   4. Realizar una tinción de Gram para aislamientos pruebas como "catalasa negativa" (sin burbujas observadas). Enterococos fecales son bacterias Gram positivas, ovoides y aparecen sobre todo en parejas o cadenas cortas.

Indicador bacteriano fecal	Medios recomendados (Temperatura de incubación, tiempo) 1
Coliformes totales	LES Endo Agar (35 ± 5 ° C, 24 h) Medio M-Endo (35 ± 5 ° C, 24 h)
Coliformes fecales	Medio m-FC (44,5 ± 0,2 ° C, 24 h)
Enterococos fecales	m. enterococos Agar (35 ± 0,5 ° C, 48 h)

Tabla 1. Medios de crecimiento de cultivo comúnmente utilizado para la detección de indicadores bacterianas fecales en muestras ambientales
¹ según lo recomendado por los Métodos estándar para la examinación de agua y aguas residuales (American Asssociation de salud pública y la Asociación estadounidense de obras hídricas, 22^nd edición, 2012)