3.11: Electroforesis capilar (EC)

1. configuración de instrumentación CE

1. Encienda el instrumento de la CE y la computadora. Utilizando el software de la computadora, encienda la fuente de luz para el análisis de la UV permitir que se caliente. Algunos programas tienen un indicador cuando la lámpara está lista para usar (icono de la lámpara ilumina en color).
2. Hacer un archivo de métodos. Configure los parámetros importantes para el funcionamiento de la CE. En este análisis las temperaturas del almacenaje del cartucho y de la muestra son de 35 ° C. La longitud de onda para la detección de UV es 214 nm.
3. Escribir un programa de tiempo. El programa consiste en generalmente pasos de enjuague (para limpiar el capilar antes del análisis), pasos de la inyección y luego un paso de electroforesis. Para el paso de enjuague, realizar 2 enjuagues durante 1 minuto con 20 psi de presión. El primer enjuague es con NaOH, que ayuda a asegurarse de que los grupos silanol de la pared capilar son deprotonated. La segunda aclaración es con tampón de ejecución (aquí para el tampón de borato de 0,025 M) para asegurarse de que el tubo capilar es izquierda equilibrada con el tampón.
4. Para la inyección, inyección a presión se utiliza en 0,5 psi para 5 s.
5. Para el paso de la electroforesis, las condiciones son separación tensión: 20 kV, tiempo: 5 min, polaridad normal. Para cada paso, también indican que vial es la entrada y que vial es la salida. Guarde el archivo de métodos después de entraron todos los parámetros.

2. preparación de los estándares y las muestras de Soda

1. Hacer soluciones madre de 500 ppm de aspartamo, cafeína y ácido benzoico en agua. Tomar 50 mL de cada uno, utilizando un matraz aforado.
2. Hacer una solución estándar de aspartamo 150 ppm, 150 ppm cafeína y ácido benzoico de 100 ppm en un matraz aforado de 10 mL.
3. Hacer soluciones de cafeína estándar de 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm y 200 ppm en un matraces aforados de 10 mL.

3. ejecutar los ejemplos en la CE

1. Coloque los frascos que contienen estándares o muestras de soda en el soporte para el frasco de muestra. Asegúrese de anotar que la muestra está en que ranura. Dos ranuras tienen el borato ejecutar el buffer y la solución de enjuague de NaOH de 0.1 M.
2. En el fichero, la entrada ranura que es el primer frasco de la muestra.
3. Adquirir una única prueba, asegurándose de que toda la información de datos del programa de entrada las solicitudes.
4. Seguir para la adquisición de datos, cambiando el frasco de entrada para cada muestra. Ejecutar la norma de combinación, las 3 concentraciones de cafeína y una Pepsi y diet Pepsi muestra.
5. Inserte el blanco en el instrumento y elegir el instrumento adecuado.
6. Analizar los datos en el ordenador. Calcular las áreas de pico y superposición de normas y muestras reales para ayudar a identificar picos. Hacer una curva de calibración para los datos de la cafeína.

La electroforesis capilar, o CE, es una técnica utilizada en el análisis químico para separar moléculas en un campo eléctrico según el tamaño y la carga.

La electroforesis capilar se realiza en un tubo de diámetro submilimétrico, llamado capilar, que contiene una solución de electrolito que fluye. La muestra se inyecta en el capilar y se aplica un campo eléctrico. A continuación, las moléculas se separan en función de la diferencia de su velocidad, que está influenciada por la carga, el tamaño y la viscosidad del disolvente. La CE es ideal para la separación de moléculas cargadas y tiene una mayor resolución que la cromatografía líquida de alta resolución, lo que la hace más eficiente y sensible.

Este video presentará los conceptos básicos de la electroforesis capilar y demostrará su uso al determinar la composición de un refresco.

En la CE, se aplica un campo eléctrico a un capilar lleno de un electrolito. El campo eléctrico induce una carga positiva en la entrada capilar y una carga negativa en la salida.

El electrolito fluye dentro del capilar, inducido por el campo eléctrico. Este flujo, llamado flujo electroosmótico, es causado por el movimiento de una capa discreta de iones de sal cargados positivamente a lo largo de las paredes capilares cargadas negativamente.

A medida que la corriente eléctrica corre a través del capilar, los cationes a lo largo de la pared se mueven hacia el extremo negativo. Este flujo de iones tira de la solución en el centro a través del tubo.

A continuación, las moléculas de muestra se separan en función de su velocidad dentro del capilar. Esta velocidad, llamada movilidad electroforética, depende de la carga y el tamaño de las moléculas, y de cuánto es atraída o repelida por un campo eléctrico.

Las moléculas cargadas positivamente fluyen más rápido a través del capilar, ya que son más atraídas por el potencial en la salida. Las moléculas cargadas negativamente fluyen mucho más lento, ya que son más atraídas por el potencial en la entrada. Las moléculas neutras son transportadas junto con el flujo a granel. Por lo tanto, el orden de las moléculas que salen del capilar está cargado positivamente, neutro y luego cargado negativamente. Además, el flujo de electrolito tira de las moléculas más pequeñas más rápido que las moléculas más grandes debido a las fuerzas de fricción.

Las moléculas son registradas por un detector, como UV-Vis, a medida que salen de la columna, y se visualizan en un gráfico de la intensidad de la señal del detector frente al tiempo, llamado electroferograma.

Los electroferogramas pueden proporcionar una variedad de información; Por ejemplo, la cantidad de compuestos diferentes presentes en una muestra y la cantidad de cada sustancia.

Ahora que has visto una breve sinopsis de la electroforesis capilar, vamos a echar un vistazo a cómo se realiza en el laboratorio.

Primero, encienda el instrumento de electroforesis capilar y la computadora. A continuación, encienda el detector UV para que se caliente.

Establezca los parámetros para ejecutar el experimento. En primer lugar, ajuste la temperatura del almacenamiento del cartucho y de la muestra a 35 ? C y la longitud de onda para la detección UV a 214 nm.

A continuación, establezca los dos pasos de enjuague. El primer enjuague es con hidróxido de sodio para asegurar que los grupos silanol en la pared capilar se protonen. El segundo enjuague utiliza un tampón de funcionamiento para equilibrar el capilar. A continuación, configure la muestra para inyectar a 0,5 psi durante 5 s.

Establezca el paso de electroforesis, seleccionando el voltaje de separación. En este caso, use 20 kV durante 5 minutos usando polaridad normal, lo que significa que el campo eléctrico es positivo en la entrada y negativo en la salida.

Primero, prepare soluciones madre de 50 ml de los componentes de la soda aspartamo, cafeína y ácido benzoico a 500 partes por millón en agua.

A partir de las soluciones madre, prepare una solución estándar de 150 ppm de aspartamo, 150 ppm de cafeína y 100 ppm de ácido benzoico.

Luego, prepare 4 soluciones estándar de cafeína a 50, 100, 150 y 200 ppm. Estas muestras se utilizarán para hacer una curva de calibración. Para más información, vea el video de esta colección sobre curvas de calibración.

Finalmente, prepare las muestras de refresco desgasificándolas con nitrógeno. Las muestras de refresco se analizarán sin dilución.

Coloque los viales que contienen muestras estándar o de refresco en el soporte de viales. Coloque también los viales que contienen el tampón de funcionamiento y la solución de enjuague de hidróxido de sodio en el portamuestras. Asegúrese de registrar la ubicación de cada uno.

En el software del instrumento CE, indique qué ranuras contienen las dos soluciones de enjuague y el primer vial de muestra. Ahora, ejecute la primera muestra.

Luego, ejecute el estándar de combinación, las 4 concentraciones de cafeína y una muestra de refresco regular y dietético cambiando el vial de entrada.

Cuando se hayan separado todas las soluciones, analice los datos.

Primero, use los estándares para identificar los picos en las muestras de refrescos. Una comparación de los tres picos observados en la muestra de refrescos dietéticos con los estándares muestra que la cafeína, el aspartamo y el ácido benzoico están presentes en los refrescos dietéticos. En la muestra de refresco regular, solo está presente el pico de cafeína, pero no los picos de aspartamo y ácido benzoico.

Luego, calcule el área máxima para cada solución estándar de cafeína y haga una curva de calibración. La curva de calibración de la cafeína se puede utilizar para calcular la concentración de cafeína en cada muestra.

La electroforesis capilar se utiliza para muchas separaciones especializadas en entornos académicos e industriales.

CE se utiliza a menudo como un componente de las pruebas de control de calidad de la industria farmacéutica. Los medicamentos, ya sea como moléculas pequeñas o productos biológicos, se pueden pasar por electroforesis capilar para ver si hay productos secundarios presentes. También se puede utilizar para determinar si las proteínas están correctamente plegadas, ya que el plegamiento puede afectar a la carga proteica.

La CE también se puede utilizar para separar el ADN. Usando una placa de micropocillos y múltiples matrices de capilares, los investigadores pueden aumentar el rendimiento de un solo experimento, como se muestra aquí. Los fragmentos de ADN se separaron en función del tamaño, con una resolución de hasta 1 par de bases. Esto hace posible la secuenciación de fragmentos de ADN, junto con la determinación de otros parámetros como las variantes del número de copias, que se utiliza para diagnosticar posibles enfermedades genéticas.

Una proteína puede ser modificada por varios grupos funcionales que están unidos químicamente a diferentes lugares. Diferentes copias de la misma proteína pueden variar con diferentes modificaciones, lo que cambiará la carga y el tamaño de cada proteína. La ejecución de las proteínas purificadas a través de un CE que está conectado a un espectrómetro de masas puede separar las proteínas en función de las modificaciones que están presentes, y también identificar el tipo y la ubicación de la modificación.

Acabas de ver la introducción de JoVE a la electroforesis capilar. Ahora debería comprender cómo la CE separa las moléculas en función de la carga y la masa, y cómo analizar una muestra de la CE en el laboratorio.

¡Gracias por mirar!