Extracción de sangre II

La recolección de sangre de ratones y ratas es necesaria para una amplia variedad de estudios científicos, y los investigadores han desarrollado diferentes métodos para lograr objetivos experimentales específicos.

En la primera entrega, discutimos la consideración general de la extracción de sangre y revisamos el sangrado ocular retroorbital, los cortes de cola y los rasguños, así como los métodos de recolección de sangre intracardíaca. Aquí, describiremos los procedimientos para la recolección de sangre de las venas faciales, submandibulares, safenas y femorales. Estos métodos son menos invasivos y no requieren anestesia, lo que los convierte en métodos de elección cuando el uso de anestésicos puede confundir los resultados de sangre u otros datos.

Comencemos con el procedimiento para obtener una muestra de sangre de una vena facial murina. En el ratón, hay una vena facial de fácil acceso que atraviesa la mejilla. Comience por elegir el equipo adecuado para el procedimiento. Básicamente, necesita un pequeño tubo de centrífuga para la extracción de sangre y una lanceta, que está disponible en diferentes tamaños. La selección de la lanceta correcta depende de la edad, el sexo y el peso corporal del animal y del tamaño de la muestra que se va a recolectar. Consulte el protocolo de texto para obtener más información sobre la selección de lancetas.

Comience el procedimiento sujetando al animal con la técnica de desaliñado. La sujeción adecuada minimiza el movimiento de lado a lado de la cabeza y ayuda a garantizar una venopunción precisa y segura con la lanceta. Si el agarre es demasiado apretado, el flujo sanguíneo puede restringirse, lo que resulta en una reducción del volumen recogido. Una vez que el animal está sujeto, localice el área aproximada de la vena facial midiendo la longitud del ojo por debajo del canto lateral y el ancho del ojo caudalmente. Con la punta de la lanceta, palpa suavemente el punto en el que termina la mandíbula. Para una mejor precisión en la perforación de la embarcación, es posible que desee colocar el mouse de lado.

Ahora, en el sitio de inserción, sostenga la lanceta perpendicular a la superficie de la piel con la punta ligeramente hacia la nariz. Esto es crítico, porque si la punta de la lanceta se dirige caudalmente, el canal auditivo se perforará causando sangrado de la oreja. Para perforar la vena, aplique un empuje firme y perfore la piel hasta el hombro de la lanceta. Al retirarla, la sangre comenzará a fluir. Para ayudar al flujo, coloque al animal con la cabeza más baja que el corazón. Para detener el sangrado, seque el sitio de la punción para lograr la hemostasia y evitar la pérdida excesiva de sangre. Por último, libere la presión sobre el pescuezo y devuelva al animal a su jaula. Tenga en cuenta que los volúmenes de recolección variarán, pero es imperativo NO exceder el volumen máximo para la recolección de sangre de supervivencia. Consulte el protocolo de texto del video Extracción de sangre One para obtener detalles sobre el volumen máximo recomendado de recolección. Las muestras en serie se pueden tomar alternando el lado utilizado. Ninguno de los dos lados debe usarse con más frecuencia que cada 5-7 días.

Ahora repasemos el método de sangrado de la vena submandibular. Aunque esto es muy similar a la técnica para el sangrado de las venas faciales, existen variaciones en el equipo y diferencias sutiles en el procedimiento de sangrado.

La vena submandibular corre a lo largo de la mandíbula inferior del ratón y converge con la vena facial en la vena yugular. En lugar de una lanceta, este método se realiza con agujas. Pero al igual que en las lancetas, la selección del calibre de la aguja depende de la edad, el sexo, el peso del animal y el tamaño de la muestra (consulte el protocolo de texto para obtener más detalles).

Para empezar, frote el pescuezo del animal de la misma manera que para el sangrado de las venas faciales para que haya un movimiento mínimo de la cabeza de lado a lado. Recuerde que un agarre demasiado apretado puede disminuir el volumen de la recolección de sangre. Mientras sujetas al ratón, imagina una línea desde la comisura de la boca a través de la cara y una línea desde el canto lateral del ojo. El punto de intersección de estas líneas es el área aproximada de la vena submandibular. Esto coincide con un pequeño hoyuelo sin pelo que se encuentra caudal a la comisura de la boca y ligeramente por debajo de la línea de la mandíbula.

Para una mayor precisión, coloque al animal en decúbito lateral (3.6.1). A continuación, sostenga la aguja perpendicular a la superficie de la piel e insértela con un empujón firme. NO inserte la aguja más allá de la punta biselada, ya que una profundidad de inserción mayor que esa puede provocar un traumatismo en los músculos, nervios y otros vasos que se encuentran en la cabeza, el cuello y la cavidad oral. Al retirar la aguja, la sangre comenzará a fluir. Al igual que para el sangrado de las venas faciales, coloque el ratón con la cabeza más baja que el corazón para ayudar con el flujo sanguíneo. Finalmente, seque el sitio de punción para lograr la hemostasia y libere la presión sobre el pescuezo para que el animal regrese a su jaula.

Ahora, aprendamos cómo recolectar sangre de la vena safena. Esta vena es un vaso superficial que corre dorsalmente y luego lateralmente a través de la articulación del tarso.

El equipo que necesita para este procedimiento incluye un dispositivo de restricción, que puede ser uno de plástico flexible para ratas o, para ratones, se puede usar un tubo cónico de plástico modificado de 50 mililitros. Tenga en cuenta que el extremo del tubo está cortado para permitir un orificio para respirar, y una ranura de media pulgada de ancho y 2 pulgadas de largo se corta desde el extremo de la tapa. Los bordes están cubiertos con cinta adhesiva para la seguridad del animal. Este procedimiento también requiere un torniquete, fabricado con una jeringa de 3 cc y una longitud de sutura no absorbible de 0 a 2, ungüento antibiótico triple con un hisopo, que se utilizará como una barrera a prueba de humedad entre la piel y la gota de sangre, un cortapelos, una aguja de calibre 22 para la venopunción y un tubo de hematocrito para la recolección de sangre.

Para sujetar a un ratón, colóquelo en el tubo, con la nariz primero. Luego, guíe suavemente la pata trasera hacia la ranura y estabilícela con el dedo índice y el pulgar. Posteriormente, afeitar el vello desde la cara lateral de la pierna desde el corvejón hasta la rodilla. A continuación, unta una capa muy fina de la pomada antibiótica triple en la zona sin pelo. A continuación, aplique el torniquete lo más cranealmente posible y apriételo. El vaso safeno que atraviesa la superficie externa desde la rodilla hasta el tobillo comenzará a llenarse y se elevará y será fácil de visualizar.

A continuación, sostenga una aguja de calibre 22 directamente sobre el vaso sanguíneo y perpendicular a la superficie de la piel. Y perforar el vaso, teniendo cuidado de no insertar la aguja demasiado profundamente y perforar el músculo o el hueso. La sangre se acumulará en la superficie de la pierna para recogerla en un tubo de hematocrito. Una vez que se haya recogido la sangre, afloje el torniquete y aplique presión sobre la punción para la hemostasia. Una vez que se haya detenido el sangrado, retire al animal de la sujeción y devuélvalo a su jaula. Los volúmenes recogidos con este método oscilan entre 10 y 150 ? L, dependiendo de la frecuencia de muestreo. Y la calidad de la muestra es variable, ya que puede contener productos de tejido. No se deben tomar más de 4 muestras de sangre en un período de 24 horas de la misma pierna.

Por último, aprenderemos cómo recolectar sangre de la vena femoral, que es otra opción para la recolección de sangre en una rata. La vena femoral corre por la cara medial de la pata trasera desde la ingle hasta la articulación de la rodilla antes de cruzar la rodilla y convertirse en la vena safena lateral, lo que la hace fácilmente accesible.

La ventaja de la hemorragia de la vena femoral es que se recoge más fácilmente un volumen mayor que el de la vena safena. La desventaja es que este procedimiento, en un animal consciente, requiere de dos personas. El equipo necesario para este procedimiento es similar al método de la vena safena, excepto que no requiere el torniquete, y el dispositivo de restricción preferible es un cono flexible. Para seleccionar el cono correcto, mídalo contra la longitud del cuerpo del animal y luego haga un corte de agujero ovalado a la altura del muslo.

Para sujetar al animal, colóquelo en el tubo, con la nariz primero. Luego, dobla el extremo del cono y ciérralo con una pequeña pinza de carpeta para evitar que el animal salga. Ahora tire de la pata trasera a través de la abertura ovalada para acceder a la vena femoral. No agarre con demasiada fuerza, ya que podría exacerbar la formación de hematomas. A continuación, afeita la superficie interna de la pierna desde la ingle hasta la rodilla y aplica una capa fina de ungüento antibiótico triple en la zona sin vello. Posteriormente, la persona que la sujeta debe ocluir la vena femoral y agarrar a la rata con la superficie interna de la pierna mirando hacia la persona que va a extraer sangre. Sosteniendo la aguja de calibre 22 perpendicular al vaso sanguíneo, perfore directamente la vena y recoja la sangre en tubos de hematocrito a medida que se acumula en la superficie de la piel. La punción debe ser lo más cerca posible de la rodilla para permitir la toma de muestras futuras anteriores a este sitio. Además, asegúrese de que la profundidad de la punción no sea más profunda que la longitud del bisel de la aguja. Para ayudar al flujo sanguíneo, coloque la rata con la pata más baja que el corazón. Finalmente, libere la presión sobre la pierna y aplique presión en el sitio de punción para lograr la hemostasia y evitar la pérdida excesiva de sangre. Tenga en cuenta que se puede recolectar una cantidad significativamente mayor de sangre con este procedimiento.

Después de discutir los conceptos básicos de las técnicas de recolección de sangre, revisemos algunos ejemplos de por qué estos procedimientos pueden ser útiles para la investigación científica

La sangre a menudo se analiza para confirmar la respuesta inmune durante el desarrollo de la vacuna. Aquí, los investigadores administraron una vacuna peptídica a animales que padecían cáncer de vejiga. A continuación, recogieron sangre a través de la vena submandibular y separaron el suero para detectar los niveles de diferentes citocinas, que sirven como indicadores de la eficacia de la vacuna.

La extracción de sangre también se realiza comúnmente para probar la eficacia de un tratamiento mediante el estudio de biomarcadores de la enfermedad humana, como los niveles de glucosa en la diabetes. Estos investigadores estaban interesados en probar la eficacia de una nueva terapia génica administrada a través de la vena de la cola en animales diabéticos. Después de la inyección, estos investigadores recolectaron sangre de la vena safena en varios puntos del tiempo para analizar el efecto de diferentes protocolos de tratamiento sobre el nivel de glucosa en sangre.

Por último, para algunos experimentos, es importante conocer el estado básico del animal, como los niveles de inflamación o estrés. En este ejemplo, se recolectó plasma sanguíneo de una rata antes y después de un evento estresante. Y como puede ver, el nivel de corticosterona, o la hormona del estrés, es más alto en los animales diez minutos después del evento estresante.

Acabas de ver la segunda entrega de JoVE sobre técnicas de extracción de sangre para ratones y ratas. Después de ver estos dos videos, debería tener una mejor comprensión de las consideraciones y procedimientos para la recolección de sangre de estos animales y cómo se utilizan en la investigación biomédica en la actualidad. Como siempre, ¡gracias por mirar!