Cromatografía de intercambio iónico

1. preparación de la muestra y la columna

1. En esta demostración, una mezcla de 2 proteínas se separan en una columna de intercambio catiónico: la hemoglobina y el citocromo C. agregar 0,2 mL de tampón de equilibrado (pH 8.1) a la muestra de proteína y vortex para mezclar bien. Centrifugar durante 2 min eliminar cualquier espuma.
2. Colocar la columna de intercambio catiónico en un tubo de ensayo durante 5 minutos permitir que la resina resolver. Abrazadera para el tubo de ensayo con la columna en un soporte de anillo para asegurarse de que esté en posición vertical.
3. Abra la tapa superior de la columna y luego la tapa inferior. Permitir que el tampón en la columna gotee hacia fuera bajo gravedad en el tubo de ensayo.
4. Lavar la columna dos veces con un columna de volumen (en este caso el volumen de la columna es de 0,3 mL) de tampón de equilibrado. Que el primer volumen de columna (0,3 mL) de goteo de tampón de equilibrado hacia fuera en el frasco de residuos antes de agregar el segundo volumen de la columna. Este paso permite la columna de equilibrar con el tampón de equilibrado. Añadir el tampón de equilibrado lentamente en este paso para no perturbar la resina.

2. ejecución de una muestra de proteína a través de una columna de intercambio catiónico

1. Poner la columna en un tubo de centrífuga de 2 mL con la etiqueta "Sin consolidar 1". Cuidadosamente coloque 0.1 mL de la muestra de proteína en la parte superior de la columna.
2. Una vez que la muestra ha sido cargada en la parte superior de la columna, lavar con 0,3 mL de tampón de equilibrado por agregar el buffer en la parte superior de la columna y dejándola gotear a través de todo el camino. Repita este paso x 4 (para un total de 5 lavados) y recoger cada lavado en un tubo de centrífuga separado, 2 mL. Etiquetar los tubos como "Desatados 1-5".
3. Para los últimos 2 lavados, centrifugue durante 10 s a 1.000 x g para asegurarse de que todas las especies salen de la columna. Cualquier muestra que se une a la columna no debe ser en estos lavados, pero muestra que no se lave bien. Centrifugación proporciona más fuerza para lavar materiales no consolidados de la columna.
4. Poner la columna en un tubo nuevo de colección 2 mL centrífuga con la etiqueta "destino 1". Poner 0,3 mL de tampón de elución (alta sal, pH 5.5) en la parte superior de la columna. Centrifugue el eluyente resultante de 10 s a 1.000 x g.
5. Repita el paso de elución 2 veces más, colocando la columna en un nuevo tubo de centrífuga, agregar 0.3 mL, y centrifugar por 10 etiqueta s. estos "Bound 2 y 3".
6. Registrar cualquier cambio de color u observaciones sobre las fracciones. La hemoglobina es una proteína de color que se ve rojizo mientras que el citocromo C es de color rojizo.

3. resultados: Intercambio catiónico de la hemoglobina y el citocromo C

1. Citocromo C tiene un pI de 10.5 y un pI de 6,8 de la hemoglobina. Así, cuando se utiliza un tampón de equilibrado pH 8.1, la hemoglobina no se une a la columna porque está cargado negativamente. Citocromo C se carga positivamente a este pH y se unen a la columna porque el pH < pI.
2. Hemoglobina se observa en la fracción no unida porque no está enlazado a la columna.
3. Citocromo C se observa en fracciones consolidados, ya que fue enlazado a la columna de intercambio catiónico.

Figura 1. Foto de la fracción no unida (hemoglobina) y fracción unida (citocromo C).