3.10: Cromatografía de intercambio iónico

1. preparación de la muestra y la columna

1. En esta demostración, una mezcla de 2 proteínas se separan en una columna de intercambio catiónico: la hemoglobina y el citocromo C. agregar 0,2 mL de tampón de equilibrado (pH 8.1) a la muestra de proteína y vortex para mezclar bien. Centrifugar durante 2 min eliminar cualquier espuma.
2. Colocar la columna de intercambio catiónico en un tubo de ensayo durante 5 minutos permitir que la resina resolver. Abrazadera para el tubo de ensayo con la columna en un soporte de anillo para asegurarse de que esté en posición vertical.
3. Abra la tapa superior de la columna y luego la tapa inferior. Permitir que el tampón en la columna gotee hacia fuera bajo gravedad en el tubo de ensayo.
4. Lavar la columna dos veces con un columna de volumen (en este caso el volumen de la columna es de 0,3 mL) de tampón de equilibrado. Que el primer volumen de columna (0,3 mL) de goteo de tampón de equilibrado hacia fuera en el frasco de residuos antes de agregar el segundo volumen de la columna. Este paso permite la columna de equilibrar con el tampón de equilibrado. Añadir el tampón de equilibrado lentamente en este paso para no perturbar la resina.

2. ejecución de una muestra de proteína a través de una columna de intercambio catiónico

1. Poner la columna en un tubo de centrífuga de 2 mL con la etiqueta "Sin consolidar 1". Cuidadosamente coloque 0.1 mL de la muestra de proteína en la parte superior de la columna.
2. Una vez que la muestra ha sido cargada en la parte superior de la columna, lavar con 0,3 mL de tampón de equilibrado por agregar el buffer en la parte superior de la columna y dejándola gotear a través de todo el camino. Repita este paso x 4 (para un total de 5 lavados) y recoger cada lavado en un tubo de centrífuga separado, 2 mL. Etiquetar los tubos como "Desatados 1-5".
3. Para los últimos 2 lavados, centrifugue durante 10 s a 1.000 x g para asegurarse de que todas las especies salen de la columna. Cualquier muestra que se une a la columna no debe ser en estos lavados, pero muestra que no se lave bien. Centrifugación proporciona más fuerza para lavar materiales no consolidados de la columna.
4. Poner la columna en un tubo nuevo de colección 2 mL centrífuga con la etiqueta "destino 1". Poner 0,3 mL de tampón de elución (alta sal, pH 5.5) en la parte superior de la columna. Centrifugue el eluyente resultante de 10 s a 1.000 x g.
5. Repita el paso de elución 2 veces más, colocando la columna en un nuevo tubo de centrífuga, agregar 0.3 mL, y centrifugar por 10 etiqueta s. estos "Bound 2 y 3".
6. Registrar cualquier cambio de color u observaciones sobre las fracciones. La hemoglobina es una proteína de color que se ve rojizo mientras que el citocromo C es de color rojizo.

3. resultados: Intercambio catiónico de la hemoglobina y el citocromo C

1. Citocromo C tiene un pI de 10.5 y un pI de 6,8 de la hemoglobina. Así, cuando se utiliza un tampón de equilibrado pH 8.1, la hemoglobina no se une a la columna porque está cargado negativamente. Citocromo C se carga positivamente a este pH y se unen a la columna porque el pH < pI.
2. Hemoglobina se observa en la fracción no unida porque no está enlazado a la columna.
3. Citocromo C se observa en fracciones consolidados, ya que fue enlazado a la columna de intercambio catiónico.

Figura 1. Foto de la fracción no unida (hemoglobina) y fracción unida (citocromo C).

La cromatografía de intercambio iónico se usa ampliamente en la separación y aislamiento de compuestos cargados, particularmente biomoléculas grandes.

Este tipo de cromatografía líquida utiliza una columna de perlas de fase estacionaria empaquetadas, llamadas resina. La técnica separa los analitos en función de su afinidad con la resina cargada.

Hay dos tipos principales de esta técnica. En la cromatografía de intercambio catiónico, se utiliza resina cargada negativamente para unirse a analitos cargados positivamente. De manera similar, en el intercambio aniónico, los analitos cargados negativamente se unen a la resina cargada positivamente. Los compuestos no unidos se lavan a través de la columna y el analito se puede recoger en un recipiente separado.

Este video presentará los conceptos básicos de la cromatografía de intercambio iónico y demostrará la técnica mediante la separación de una mezcla de proteínas en el laboratorio.

La fase estacionaria es un componente clave para una separación exitosa. Las resinas de intercambio catiónico fuertes suelen presentar grupos funcionales ácidos fuertes, como el ácido sulfónico. Las resinas de intercambio catiónico débil presentan grupos débiles, como los ácidos carboxílicos.

De manera similar, las resinas de intercambio aniónico fuerte utilizan bases fuertes, como las aminas cuaternarias, mientras que las resinas de intercambio aniónico débil usan aminas secundarias o terciarias. La selección de la resina dependerá de las propiedades de la mezcla de la muestra y del analito de interés.

Los tampones utilizados, denominados colectivamente fase móvil, también son importantes para la separación, especialmente en términos de pH. En el caso de las proteínas, el pH se selecciona en función de su punto isoeléctrico, o pI. A un pH igual al pI de la proteína, la proteína es neutra. Por encima del pI, tendrá una carga neta negativa, mientras que por debajo del pI, tendrá una carga neta positiva. El pH del tampón debe seleccionarse para que la proteína esté correctamente cargada y pueda unirse a la fase estacionaria.

La cromatografía de intercambio iónico es generalmente un proceso de cuatro pasos. En primer lugar, una columna empaquetada que contiene resina de intercambio aniónico o catiónico se equilibra utilizando un tampón. En el caso de las columnas de intercambio aniónico, esto implica protonar la resina, asegurándose de que esté cargada positivamente.

A continuación, se carga el ejemplo en la columna. El tampón debe tener una conductividad baja, ya que las especies cargadas pueden competir con la muestra por las interacciones con la resina. Los compuestos de carga opuesta se unen a la resina. Las moléculas que no están cargadas, o que llevan la misma carga, permanecen libres.

En el tercer paso, la columna se lava con una zona de influencia adicional para eliminar los componentes no enlazados de la columna, dejando atrás los enlazados.

Finalmente, el cuarto paso es la elución del analito unido. Esto se logra mediante el uso de un gradiente de sal, donde la concentración de sal aumenta gradualmente, o mediante el uso de un tampón de alta elución de sal.

Las moléculas que están débilmente unidas se eluirán primero, ya que el bajo contenido de sal perturbará más fácilmente su enlace iónico a la resina. Los compuestos que están más fuertemente unidos eluirán con concentraciones de sal más altas.

Ahora que se han esbozado los conceptos básicos de la cromatografía de intercambio iónico, echemos un vistazo a su uso en la separación de dos proteínas.

Primero, para preparar la mezcla de proteínas para la separación, agregue 0,2 ml de tampón de unión y vórtice para mezclar bien. Luego, centrifuga la mezcla para eliminar la espuma. Para preparar la columna de intercambio catiónico, sujétala verticalmente a un soporte de anillo y deja que la resina se asiente.

Abra la tapa superior de la columna y, a continuación, la inferior. Deje que el tampón gotee bajo la gravedad en un tubo que se encuentra debajo.

Para preparar la columna, equilibre cargando un volumen de columna de búfer, en este caso 0,3 mL. Deje que el tampón gotee de la columna a un vial de desechos. Una vez que haya salido de un volumen de columna de búfer, repita el paso de equilibrio.

Para realizar el experimento, coloque un tubo de centrífuga de 2 ml etiquetado como "Unbound 1" debajo de la columna. Cargue con cuidado 0,1 ml de la muestra de proteína en la parte superior de la columna.

Una vez que se haya cargado la muestra, lavar con una columna de tampón y dejar que fluya por completo. Repita para un total de 5 lavados. Recoja cada lavado en su propio tubo, etiquetado como "No consolidado 1" a "5". Para los últimos 2 lavados, centrifugue la columna durante 10 s para asegurarse de que todas las especies no ligadas se laven de la columna. Coloque la columna en un nuevo tubo de recolección de centrífuga de 2 ml y etiquételo como "Encuadernado 1". Cargue 1 volumen de columna de tampón de elución en la parte superior de la columna. Centrifugar durante 10 s a 1.000 x g.

Repita el paso de elución 2 veces más para asegurar la recolección del analito unido. Etiquete los tubos "Bound 2" y "3". Registre cualquier cambio de color u observación sobre las fracciones.

En este ejemplo, la hemoglobina y el citocromo C estaban separados. La hemoglobina tiene un pI de 6,8, mientras que el citocromo C tiene un pI de 10,5. En el tampón de pH 8,1, la hemoglobina está cargada negativamente y no se une a la columna. Por el contrario, el citocromo C está cargado positivamente a pH 8,1 y se une a la columna.

La hemoglobina, una proteína de color pardusco, se encontró en las fracciones no unidas, mientras que el citocromo C, una proteína de color rojizo, se observó en la fracción unida.

Existen muchas formas de cromatografía líquida, cada una con diferentes capacidades para separar los componentes de una mezcla.

En este ejemplo, se utilizó la cromatografía en columna para separar una mezcla de ADN monocatenario y bicatenario. La hidroxiapatita, o HA, es una forma cristalina de fosfato de calcio que se usa comúnmente como fase estacionaria debido a sus iones de calcio cargados positivamente. En este caso, la columna de HA era ideal para la separación del ADN, ya que puede unirse a la columna vertebral cargada negativamente del ADN.

Otra forma de cromatografía en columna que se usa con frecuencia para separar proteínas es la cromatografía de afinidad de metales inmovilizados, o IMAC. En IMAC, la fase estacionaria posee un ligando con un ion metálico, que se une a una etiqueta de histidina en la proteína de interés.

Todos los demás componentes de la mezcla salen de la columna. A continuación, la proteína se eluye con una solución de imidazol, que tiene una estructura similar a la histidina, y se une más fuertemente con el ion metálico.

Una aplicación común de la cromatografía en columna es la cromatografía líquida de alta resolución o HPLC. La HPLC se utiliza ampliamente en química analítica tanto para la identificación como para la separación de compuestos biológicos y no biológicos en una mezcla.

La HPLC es similar a la cromatografía en columna que se muestra en este video, excepto que está automatizada y funciona a presiones muy altas. Esto permite el uso de perlas de fase estacionaria más pequeñas, con una mayor relación entre el área de superficie y el volumen. Por lo tanto, es posible mejorar las interacciones entre la fase estacionaria y los componentes de la fase móvil.

Acabas de ver la introducción de JoVE a la cromatografía de intercambio iónico. Ahora debe comprender los conceptos detrás de esto, los 4 pasos involucrados y algunas técnicas relacionadas.

¡Gracias por mirar!