5.3: Fundamentos de la crianza y destete

1. información necesaria cuando se están emparejando animales incluye cepa/stock del animal utilizando la nomenclatura adecuada, las fechas de nacimiento para el criador masculino y femenino y la fecha de instalación. Mantenimiento de registros precisos es imprescindible con colonias de cría.

2. sexo determinación de ratones y ratas se realiza comparando las distancias anogenitales. En las hembras, la distancia entre el ano y los genitales externos es más corta que es para los hombres. La presencia de un saco escrotal en machos es otro indicador de sexo.

3. seleccionar y establecer el esquema de apareamiento

Nota: Hay dos esquemas de apareamiento que se pueden utilizar.

1. Proestro/estro tiempo acoplamiento: este método se basa en pelado las hembras con los machos en el momento de máxima receptividad y fertilidad.
   1. Debe controlarse el ciclo estral en las hembras por la examinación visual de los genitales externos para los cambios que son indicativos de proestro y estro, o citología de las secreciones vaginales (véase abajo).
   2. Cuando una mujer está decidida a estar en proestro o estro, ella está emparejada con un hombre al final del día, como los animales se aparean generalmente en la noche.
   3. A la mañana siguiente, la mujer se examina un enchufe copulatoria (véase abajo). Si no hay enchufe está presente, la mujer puede permanecer con el macho durante el día y comprobada para un enchufe copula al final del día. Por otra parte, si se determina que ya no está en proestro o estro, ella se retira de la jaula de cría.
2. Al azar tiempo acoplamiento: este método se basa en el hecho el ciclo estral de roedores es muy corto, 4-5 días.
   1. Para este método, apareamientos se pueden configurar en cualquier momento, y las hembras entonces se comprueban copula enchufes cada mañana y tarde hasta que se observe un enchufe.
   2. Una hembra se empareja con un hombre en la noche.
   3. Ella está marcada por un enchufe consistieron al principio y al final de cada día hasta que se observe un enchufe. Comúnmente se toma 3 o más días de un enchufe ser visto cuando se utiliza este método.

4. predecir embarazo

Puesto que la palpación de los cachorros es difícil hasta más tarde durante el embarazo, alrededor de 10 a 12 del día, se han desarrollado sistemas de ultrasonido comercial para roedores; sin embargo, algunos centros de investigación animal con esta tecnología. Por lo tanto, visualización de tapones copulador, observación de cambios vaginales o citología vaginal se utilizan para ayudar en la predicción de cuándo una mujer ha concebido una camada (véase abajo). Sin embargo, ninguno de estos métodos son capaces de confirmar el embarazo. Una vez que se observa un tapón de copulación, la hembra debe ser vigilada para detectar signos de embarazo, como aumento de peso.

5. determinar la fase del ciclo estral

1. Inspección visual
   Nota: Para el tiempo de apareamiento de ratones y ratas, observación visual de la vagina para los cambios que son indicativos de proestro y estro es el método más rápido para determinar la etapa del ciclo estral, y no requiere ningún equipo especial.
   1. Al evaluar el ciclo estral mediante el método visual, es importante realizar la inspección visual en la misma zona con respecto a la iluminación de la sala, como la fuente de luz puede cambiar el color percibido de los tejidos vaginales y hacer difícil la evaluación. Por ejemplo, la tonalidad púrpura por luces dificulta la detección visual.
   2. Para evaluar la etapa del ciclo estral por observación visual, cada ratón debe manualmente restringida por la cola, con las patas delanteras apoyadas sobre una tapa de la jaula.
   3. La abertura vaginal de cada mujer se evalúa basado en la condición del tejido que rodea el área vaginal y el tamaño de la abertura vaginal. ²
      1. Durante el proestro, la abertura vaginal es amplia y se caracteriza por la hinchazón de los tejidos circundantes. El tejido es en color rosa y muy húmedo. A menudo hay arrugas o estrías a lo largo de los bordes dorsales y ventrales de la abertura.
      2. Durante el celo, la hinchazón de los tejidos que rodean la abertura vaginal se reduce y los tejidos no son tan húmedos y rosados.
      3. Durante el metestro la abertura vaginal es mínima y hay inflamación insignificante.
      4. Durante el diestro, no hay ninguna hinchazón de los tejidos alrededor del área vaginal, y la abertura vaginal es pequeña y cerrada.
2. Citología vaginal
   Como ratones y ratas son polyestrous, la duración del ciclo estral es muy corta, que van desde 4-5 días. A veces es necesario identificar todas las cuatro etapas del estro: proestro, estro, metestro y el diestro. La citología vaginal es un método muy preciso para determinar estas etapas. También existen dos métodos de recolección de muestras: el método no invasivo de lavado vaginal y el método de hisopado de vagina.
   1. Lavado vaginal
      1. Los materiales necesarios son puntas de pipetas μl 200 estériles, bulbos de látex, estéril doble (ddH₂0) de agua destilación y limpiar portaobjetos de vidrio.
      2. Coloque un bulbo de látex en el extremo de una punta de 200 μL estériles. Elaborar aproximadamente 100 μl de ddH estéril₂O con la pipeta.
      3. Levante el ratón fuera de la jaula y le coloque encima el alambre barra jaula con su cola hacia usted.
      4. Sujete la cola firmemente y elevar los cuartos traseros del ratón. El ratón tendrá ahora sólo las patas delanteras sujetando la tapa.
      5. Si orina de ratón, espere hasta que deje de orinar. Debe haber orina a la izquierda en la entrada a la vagina, la abertura puede ser aclarada con una pequeña cantidad de ddH₂O. cambio la punta que se utilizó para el enjuague.
      6. Coloque el extremo de la punta de llenado O ddH₂en la apertura de la vagina sin penetrar en el orificio.
      7. Presione suavemente la bombilla para expulsar a un cuarto a la mitad del volumen de agua (~ 25-50 μL) en la apertura del canal vaginal. Espontáneamente se aspire el líquido en el canal sin la inserción de la punta. Suelte lentamente la presión ejercida sobre el foco. El líquido se retirará hacia la punta.
      8. Evitar la liberación de presión demasiado rápido para evitar la aspiración del líquido en el bulbo. Una punta de filtrado puede ser útil para este propósito.
      9. Repita el paso anterior 4 - 5 veces con la misma punta, bulbo y fluido para obtener un número suficiente de células en una sola muestra.
      10. Colocar el líquido en portaobjetos de vidrio y permitir el frotis a completamente seco a temperatura ambiente.
      11. Utilice una nueva pipeta para cada ratón.
      12. Una vez seco, estos frotis estros pueden manchadas inmediatamente o almacenados y manchados en una fecha posterior. Tinción de Wright-Giemsa es más comúnmente utilizado para las diapositivas de la mancha. Esta mancha está disponible comercialmente como una mancha de un solo paso que no requiere la fijación de la corredera para evitar que las células del lavado durante el proceso de tinción. La diapositiva se coloca en la mancha durante 45-60 segundos, según las instrucciones del fabricante.
      13. Las diapositivas son luego examinados bajo el microscopio y las células vistas corresponden a la etapa del ciclo: 1) si la mujer está en proestro, las células se ven como racimos de redondo, bien formado nucleated células epiteliales con un núcleo que las manchas más oscuras que la citoplasma; 2) si la hembra está en celo, la mayoría de las células son las células epiteliales squamous cornified que carecen de un núcleo, son angulares en apariencia y ocurren en racimos densamente; 3) si la mujer está en metestro, las células son glóbulos blancos (especialmente neutrófilos con algunas células epiteliales squamous cornified presente) con núcleos teñidos de oscuro que se forman de dos salchichas Unidas entre sí; 4) durante el diestro, las células presentes son normalmente las células blancas de la sangre con la aparición de algunas células epiteliales nucleadas...
   2. Hisopado vaginal
      1. Los materiales necesarios son aplicadores con punta de algodón estériles con una punta de 2 mm de diámetro, portaobjetos de vidrio limpio y solución salina fisiológica estéril.
      2. Moje un aplicador con punta de algodón con solución salina.
      3. Introduzca la punta del aplicador en la vagina del ratón restringida.
      4. Suavemente gire y ruede la punta contra la pared vaginal. Retire con cuidado la torunda.
      5. Las células se transfieren a un portaobjetos de vidrio seca girando la torunda a través de la diapositiva.
      6. Una vez seca la diapositiva, puede ser teñido con tinción de Wright-Giemsa.
         Aplicador se considera un procedimiento estresante, y -cuando ratones subrayó pueden haber interrumpido ciclos estruales. Estimulación vaginal y del cuello uterino causada por hisopado puede inducir seudoembarazo. Repetidos frotis de la mucosa vaginal pueden causar daño si no es realizaron, con el alojamiento adecuado y con los hisopos de algodón de tamaño correcto. ^{3, 4}

Figura 2. Citología vaginal--diferentes fases del estro roedor ciclo

6. visualizar un enchufe copulatoria

Este enchufe consta de semen y fluido vaginal y persiste en la vagina para postcopulation de 12-24 h. La presencia del tapón confirma el apareamiento, pero no garantiza que la mujer está embarazada. Si la mujer tapada está embarazada, el primer día de gestación se considera el día después de que el enchufe se encuentra.

1. Levante el ratón fuera de la jaula y le coloque encima el alambre barra jaula con su cola hacia usted.
2. Posición del ratón mediante la aplicación de presión justo por encima de la cola a arquear la espalda para permitir la mejor presentación de la abertura vaginal.
3. Observar su abertura vaginal de una masa blanquecina. El enchufe copula no puede ser visualmente evidente pero puede confirmarse con el uso de una sonda Roma.
4. Suavemente con la punta de la sonda, introduzca en la abertura vaginal. La presencia de un tapón de copula impedirá el avance de la sonda dentro de 0.5 cm de la abertura vaginal.
5. La sonda debe desinfectarse con alcohol y secar completamente antes de cada uso.

Como la hembra tiene camadas, la fecha de nacimiento, el tamaño de camada, el número de nacidos, el número de destetados, la proporción de hombres y mujeres cachorros y la proporción de los genotipos debe ser registrada. Si los genotipos dentro de una camada no corresponden a los genotipos de los padres, repetir el análisis debe hacerse para verificar el verdadero genotipo.

7. el destete

La gestación de ratones y ratas es de aproximadamente 21 días. Los jóvenes son destetados a los 21-28 días de edad. Ambos ratones y ratas pueden reproducirse tan pronto como 8 semanas de edad, por lo tanto es imperativo que las crías están separadas por sexo a una edad temprana. Cría intensiva requiere que los cachorros de cada camada se destetan a día 20 para evitar que los cachorros mayores de estar presente cuando nace la siguiente camada. Para la cría de nonintensive, los cachorros pueden dejarse con la madre pasados 20 días de edad, a menudo hasta 28 días de edad. Esto puede ser muy beneficioso para muchas variedades genéticamente modificadas, pues los cachorros pueden no ser tan vigorosos como nonengineered o animales de tipo salvaje.

Cachorros machos y hembras se separan al destete. Siempre que sea posible, los cachorros recién destetados deben no alojados individualmente. Si una camada contiene sólo un cachorro de un sexo determinado, deben hacerse intentos para albergar este cachorro con otros del mismo género. Opciones de alojamiento posibles son: 1) una sola cría hembra puede permanecer con la madre, si no en una jaula de cría intensiva; 2) una sola cría hombre o mujer puede colocarse con otros cachorros del mismo género de una camada diferente de la misma edad; 3) si los padres son una pareja monógama, se puede quitar la hembra de la jaula para permitir que una sola cría macho que se encuentra con el padre; y 4) una sola cría macho puede ubicada con hermanos femeninos hasta 5 semanas de edad. El sexo de los cachorros debe ser verificado una semana posdestete para evitar camadas no deseadas de crías mal segregados.

Ratas y ratones destetados se deben revisar diariamente para asegurar que están prosperando. Aunque la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio⁵ indica que alimentos deben presentarse a los animales de tal manera para evitar ser manchado por las heces y la orina, se deberá una cantidad pequeña de comida (un perdigón por a ratones recién destetados ratón) se coloca en un plato de vidrio (placa Petri) en el piso de la jaula. Esto animará a los animales a la transición a tener roedor chow como su fuente de alimento único. Incluso para los animales que se encuentran en los estantes que proporcionan agua a las jaulas a través de un sistema de riego automático, una botella de agua puede añadirse a la jaula si los ratones parecen estar deshidratado.

Tabla 1. Usan con manchas de ratón y las acciones.

Tabla 2. Las acciones y las tensiones de la rata utilizado

Cada año se crían millones de ratones y ratas para su uso en la investigación biomédica, y muchas instituciones optan por esto internamente para reducir costos y aumentar las opciones de investigación. Las ventajas de la cría interna son: 1) los investigadores pueden manipular la genética de los animales a través de la cría selectiva, 2) pueden programar los embarazos para satisfacer las necesidades de investigación, y 3) pueden trabajar con embriones y neonatos según sea necesario. Sin embargo, para establecer un esquema de cría exitoso, uno debe comprender el ciclo estral de los roedores. Además, deben tener conocimientos sobre los diferentes esquemas de apareamiento, los factores que afectan al comportamiento de cría de roedores y las consideraciones sobre el destete... Todo lo cual se discutirá en esta presentación en video.

Comencemos con la revisión del ciclo estral de los roedores. Tanto las ratas hembras como los ratones son poliestrales, lo que significa que tienen más de un ciclo de celo en un año o en una temporada de reproducción. Cada ciclo dura entre 4 y 5 días y se puede dividir en 4 etapas: metestrus, diestro, proestro y estro. El estro es la fase ovulatoria, lo que significa que si la mujer está en proestro o en fase de celo, está lista para concebir.

Una forma de determinar la etapa del ciclo estral es mediante un examen visual. Sujete manualmente al animal por la cola y con las patas delanteras apoyadas en la tapa de una jaula e inspeccione cuidadosamente el tamaño de la abertura vaginal y el tejido circundante. Durante la fase de proestro, la abertura vaginal es amplia y se caracteriza por la hinchazón del tejido circundante, que es de color rosado y muy húmedo. A menudo hay arrugas o estrías a lo largo de los bordes dorsal y ventral de la abertura. Durante el celo, la hinchazón que rodea la abertura vaginal se reduce y los tejidos no están tan húmedos y rosados. Durante el metesto, la abertura vaginal es mínima y hay una hinchazón insignificante. Durante el diestro, no hay hinchazón de los tejidos alrededor del área vaginal y la abertura es pequeña o cerrada.

Otro enfoque más preciso para determinar la etapa del ciclo estral es la citología vaginal, para la cual las muestras de células se recolectan mediante lavado o hisopado. Para el lavado, coloque una pera de látex en el extremo de una punta estéril de 200 microlitros y extraiga aproximadamente 100 microlitros de agua estéril de doble destilación en la pipeta. A continuación, saca al ratón de la jaula y colócalo en la parte superior de la jaula de barra de alambre con su cola hacia ti. Agarre firmemente la cola y eleve los cuartos traseros del ratón de manera que solo las patas delanteras agarren la tapa. Coloque el extremo de la punta llena en la abertura del canal vaginal sin penetrar el orificio. Presione suavemente la bombilla para expulsar aproximadamente 25-50 microlitros de agua en la abertura vaginal. El líquido se aspirará espontáneamente en el canal sin necesidad de insertar la punta. Libere lentamente la presión ejercida sobre el bulbo y el líquido se retirará de nuevo a la punta. Repita 4-5 veces usando la misma punta, bulbo y líquido para obtener un número suficiente de células en una sola muestra. Coloque el líquido en un portaobjetos de vidrio y deje que el frotis se seque completamente a temperatura ambiente. Una vez secos, estos frotis de celo se pueden almacenar para su uso posterior, o se pueden teñir inmediatamente con el tinte de Wright-Giemsa, que es un frotis de un solo paso y no requiere fijación. El portaobjetos se coloca en la mancha durante 45 a 60 segundos.

Por otro lado, para el hisopado, humedece un aplicador de 2 mm con punta de algodón con solución salina. Inserte la punta del aplicador en la vagina del ratón restringido y gire y rodee suavemente la punta contra la pared vaginal. A continuación, retire el hisopo con cuidado y transfiera las células a un portaobjetos de vidrio seco haciendo rodar el hisopo por el portaobjetos. Este procedimiento se considera estresante y puede causar daños si no se realiza con cuidado, con la sujeción adecuada y con los hisopos de algodón del tamaño correcto. Al igual que el lavado, una vez que el portaobjetos está seco, se puede teñir con el tinte Wright-Giemsa. Después de la tinción, los portaobjetos se pueden examinar bajo un microscopio.

Si la hembra está en celo, las células se ven como grupos de células epiteliales redondas, bien formadas y nucleadas con un núcleo que se tiñe más oscuro que el citoplasma. Si está en fase de celo, la mayoría de las células son células epiteliales escamosas córneas que carecen de núcleo. Son de apariencia angular y se encuentran en grupos densamente agrupados. Si la hembra está en metestro, las células suelen ser glóbulos blancos, específicamente neutrófilos, con algunas células epiteliales escamosas córneas presentes. Durante el diestro, las células presentes son normalmente glóbulos blancos con la presencia de unas pocas células epiteliales nucleadas.

Ahora que ya conoces el ciclo estral de los roedores, vamos a hablar de cómo configurar el apareamiento. El primer paso es la determinación del sexo, que se realiza comparando las distancias anogenitales. En las hembras, la distancia entre el ano y los genitales externos es más corta que en los machos. Según las necesidades de investigación y la eficiencia reproductiva de la cepa, el esquema de apareamiento puede ser monógamo, donde una hembra se cruza con un macho O polígamo, donde dos o más hembras se cruzan con un macho.

En términos de tiempo, dado que el ciclo estral de los roedores es corto (solo 4-5 días), se puede establecer el apareamiento al azar. O pueden establecer un "apareamiento cronometrado", que consiste en introducir a la hembra en la jaula de apareamiento cuando se encuentra en el punto de máxima receptividad y fertilidad, es decir, durante la fase de proestro o celo. En cualquier caso, el apareamiento debe establecerse al final del día, ya que los roedores son nocturnos y tienden a aparearse por la noche. A la mañana siguiente, la hembra es examinada en busca de un tapón copulatorio, una masa blanquecina que consiste en fluido vaginal y semen que persiste durante 12-24 horas después de la cópula. Si el tapón copulador no es visualmente obvio, inserte suavemente la punta de una sonda roma en la abertura vaginal. La presencia de un tapón copulatorio impedirá el avance de la sonda a menos de 0,5 cm de la abertura vaginal. En caso de apareamiento aleatorio, la aparición del tapón copulatorio suele tardar tres días. La presencia de un tapón confirma el apareamiento no garantiza que la hembra esté embarazada.

Una vez que se observa un tapón copulatorio, la hembra debe ser monitoreada para detectar signos de embarazo, como aumento de peso. Si la hembra taponada está embarazada, entonces el día en que se encontró el tapón es el día cero embrionario o E0 y el día siguiente se considera como el primer día de gestación, o E1, y así sucesivamente hasta el parto, es decir, el parto, que es entre 19 y 21 días. Aproximadamente 20-24 horas después del parto, tanto las ratas como los ratones hembra se someten a un celo y pueden concebir de nuevo.

En un esquema de cría intensiva, que se usa comúnmente para animales con una vida reproductiva corta debido a una mutación genética, los animales machos se dejan en la jaula con la hembra y las crías, para que la hembra pueda concebir otra camada de inmediato. Este esquema puede ser estresante para la hembra, ya que está continuamente amamantando y gestando. Por el contrario, el esquema de cría no intensiva consiste en separar a la hembra una vez que está visiblemente preñada, y no devolverla a la jaula del macho hasta que su camada haya sido destetada, lo que hace que este sea un esquema de cría menos exigente.

Hay muchos factores que pueden influir en el rendimiento reproductivo de ratones y ratas. Repasemos algunos de ellos, que surgen con más frecuencia. El vigor de las hembras reproductoras depende en gran medida del nivel de endogamia. Los animales que se cruzan son mucho más resistentes y vigorosos, por lo que producen camadas más grandes y fuertes. Otro factor que puede afectar el rendimiento de la cría es el comportamiento agresivo. Algunas cepas comúnmente utilizadas, como los ratones C57BL/6, tienen tendencia a mostrar agresividad, lo que puede interferir con la reproducción. Al criar una cepa agresiva, todas las camadas deben ser vigiladas de cerca. Los animales de una camada que contenga cachorros agresivos no deben usarse para la cría. Las fluctuaciones de temperatura, humedad e iluminación pueden causar disminuciones en la eficiencia de la reproducción. También se ha demostrado que el ruido y las vibraciones dentro de las salas de cría causan efectos nocivos. Los animales con modificaciones genéticas tienden a ser menos resistentes y fértiles, y algunas de las mutaciones pueden resultar en letalidad de las crías antes o poco después del nacimiento.

Ahora repasemos brevemente cómo destetar a las crías de estos animales de laboratorio. El momento de iniciar el destete difiere según el esquema de cría. En caso de cría no intensiva, las crías pueden ser destetadas a los 21-28 días de edad. Pero en caso de cría intensiva, las crías de cada camada se destetan el día 20 para evitar que las crías más viejas estén presentes cuando nazca la próxima camada. Dado que los roedores pueden comenzar a aparearse a partir de las 8 semanas, las crías macho y hembra se separan al destete. Siempre que sea posible, los cachorros recién destetados no deben alojarse solos.

Si una camada contiene solo una cría de un sexo determinado, se debe intentar alojar a esta cría con crías del mismo sexo de otra camada. Las posibles opciones de alojamiento para el destete de los cachorros se enumeran en el manuscrito a continuación. Los ratones y ratas destetados deben ser revisados diariamente para asegurarse de que estén prosperando. Para el suministro de alimentos, se debe colocar una pequeña cantidad de alimento, un pellet por ratón, en el suelo de la jaula durante los primeros 7-10 días, con comida adicional en la parte superior de la jaula. Esto animará a los animales a hacer la transición a comer roedores como su única fuente de alimento. Para el suministro de agua, se debe agregar una botella incluso si los animales están alojados en bastidores con sistema de riego automático. Esto es para prevenir la deshidratación.

Por último, veamos cómo los científicos están utilizando el enfoque de cría interna en su beneficio. Una de las aplicaciones más comunes de la configuración del apareamiento es el desarrollo de ratones con genotipo alterado. Para estudiar la función de un gen, los investigadores a menudo alteran su código genético. Sin embargo, estos animales, al igual que los humanos, son diploides y, por lo tanto, tienen dos copias del mismo gen. Por lo tanto, con el fin de interrumpir el gen por completo, los ratones alterados necesitan ser criados para producir un animal con ambas copias disfuncionales, en otras palabras, un knockout homocigótico. Los ratones con una copia disfuncional se denominan heterocigotos o hets.

La otra ventaja de establecer un apareamiento interno es probar el efecto de la exposición prenatal a los compuestos de prueba. Por ejemplo, en este caso, los investigadores proporcionaron a una mujer embarazada una dieta líquida que contenía alcohol de E7 a E13. Luego, en E13, diseccionaron a la hembra embarazada, obtuvieron cerebros fetales y los cortaron en secciones delgadas. Por último, la tinción de los portaobjetos reveló que la exposición prenatal al alcohol aumentaba la muerte celular en el tejido neural.

Por último, la cría interna también permite el estudio de los trastornos posteriores al embarazo, como la depresión posparto. En este estudio, los científicos primero alejaron a la camada de la madre durante el período de lactancia. Luego, 60 minutos después, reintrodujo a los cachorros en la madre. Y para inducir estrés en la hembra, se añadió un nuevo intruso macho a la jaula. Luego, los investigadores observaron la agresión materna, que incluye atacar y morder al macho intruso, así como para diferentes comportamientos de cuidado materno, como el acicalamiento de los cachorros y la lactancia. Los datos obtenidos revelaron que el estrés tiene un efecto significativo tanto en la agresión materna como en los cuidados posparto.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre los fundamentos de la cría y el destete de ratones y ratas en el laboratorio. Ahora debería tener una mejor comprensión del ciclo de celo de los roedores y también saber cómo determinar la etapa del ciclo y cómo usarla para establecer esquemas de apareamiento exitosos. También revisamos los factores que pueden afectar el comportamiento reproductivo y explicamos cómo y cuándo destetar ratones y cachorros de rata. Como siempre, ¡gracias por mirar!