1. preparación
2. Recolección de tejidos
Fuente: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universidad de Notre Dame, en
en 1959 la 3 R ' s fueron introducidos por W.M.S. Russell y R.L. Burch en su libro los principios de técnica Experimental humana. 3 R ' s son reemplazo, reducción y refinamiento del uso de animales en investigación. 1 el uso de líneas celulares y cultivos de tejido que se originaron en animales de investigación es una técnica de reemplazo, ya que permite muchos experimentos llevar a cabo en vitro. Recolección de tejidos y órganos para el uso en cultivos celulares y tejidos requiere una técnica aséptica para evitar la contaminación de los tejidos. Cosecha estéril es también necesaria para el análisis de RNA y proteínas y perfiles metabólicos de los tejidos. Este manuscrito será discutir el proceso de cosecha de órgano estéril en ratas y ratones.
1. preparación
2. Recolección de tejidos
Muchos experimentos exigen la recolección de células del tejido extirpado. En tales casos, es imperativo que el procedimiento de recolección de tejidos se realice de manera estéril. El uso de líneas celulares y cultivos de tejidos que se originan en animales de investigación permite que muchos experimentos se realicen in vitro, lo que a su vez reduce el uso de animales en investigación.
En este video, discutiremos el método aséptico para la recolección de órganos comúnmente extraídos de animales de laboratorio. A esto le seguirá una breve revisión de algunos ejemplos de experimentos que emplean esta técnica estéril para lograr diferentes objetivos de investigación.
Comencemos con los pasos de preparación necesarios para garantizar la esterilidad del espacio, los instrumentos y el personal durante la recolección de tejido animal.
Este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar. Antes del proceso, el ventilador de la campana debe funcionar durante al menos 15 minutos y el área debe desinfectarse con alcohol al 70%. A continuación, coloque algunas toallas de papel en la campana y mójelas con etanol al 70%. Después de eso, cargue el equipo estéril y organícelo por el orden en que se utilizará cada instrumento, generalmente de izquierda a derecha. Esto permite que el flujo de trabajo se produzca de forma unidireccional, evitando la contaminación accidental de la canal del animal.
Se recomienda que un técnico no estéril esté presente para ayudar al técnico estéril. Ambos operarios deberán llevar mascarilla y bouffant. El técnico estéril debe ponerse una bata estéril y dos pares de guantes quirúrgicos estériles. Tenga en cuenta que la bata y los guantes deben cubrir las muñecas para evitar el desprendimiento de células de la piel en la cavidad corporal abierta, placas de Petri o medios estériles.
La persona no estéril abre el paquete de instrumentos estériles sin tocar la superficie interior, de modo que la persona estéril puede extraer la herramienta asépticamente. Por último, el técnico no estéril sacrifica al animal, coloca el cadáver sobre las toallas de papel y lo empapa completamente con alcohol al 70%, para que la persona estéril pueda comenzar la cosecha.
En primer lugar, revisaremos la extracción de los órganos abdominales, como el bazo, el hígado, los riñones, los ovarios y los testículos.
Con un juego de tijeras y pinzas estériles, haga un corte horizontal en la piel justo antes del prepucio en los hombres y del hueso pélvico en las mujeres. Evite cortar la musculatura abdominal. A continuación, coloque el pulgar debajo del corte y agarre el borde craneal del corte. Con la otra mano, sostenga firmemente las extremidades traseras y la cola, mientras tira de la piel hacia la cabeza. La piel se desprenderá del cuerpo justo por encima de las extremidades traseras y se puede voltear al revés sobre la cabeza y las patas delanteras. Esto elimina eficazmente los contaminantes del cabello que podrían interferir con la extracción de órganos estériles. A continuación, vuelve a remojar el cuerpo con alcohol al 70% y quítate los guantes superficiales, que ya no son estériles. También desecha todos los instrumentos que se usaron en la piel.
Para extraer el bazo, coloque el cuerpo en decúbito lateral derecho. El bazo debe ser visible a través del músculo abdominal. Use unas tijeras para hacer un corte directamente sobre el bazo y retraiga suavemente el órgano de la cavidad corporal. Corte todas las uniones entre el bazo y el estómago y el tejido pancreático, pero evite perforar o desgarrar el órgano.
Para extraer todos los demás órganos abdominales, coloque el cuerpo en decúbito dorsal. A continuación, levanta y corta el músculo abdominal dejando una abertura ovalada directamente sobre la cavidad abdominal. Para extraer el hígado, refleje el órgano caudalmente lejos del diafragma. Ahora use unas tijeras para cortar cuidadosamente las membranas entre las dos estructuras. A continuación, haz un corte perpendicular a la columna vertebral a través de los vasos sanguíneos. A continuación, levanta el hígado y refléjalo hacia el diafragma para visualizar las uniones que hay debajo. Habrá membranas delgadas que unirán los lóbulos más pequeños del hígado al estómago y al intestino delgado. Agarre el ganglio fibroso en el centro del hígado en la parte inferior y levante el órgano para encontrar todas las uniones. Ahora separe el órgano de los tejidos subyacentes. Tenga en cuenta que el hígado es frágil y puede perforarse fácilmente, lo que resulta en una liberación excesiva de sangre. Por lo tanto, debe manejarse con cuidado.
Para extraer los riñones, empuje los intestinos hacia la izquierda para exponer el riñón derecho o hacia la derecha para exponer el riñón izquierdo. Ahora use las hojas de las pinzas para agarrar debajo del riñón y con unas tijeras corte debajo de las pinzas, extrayendo el órgano del cuerpo.
Para extraer los ovarios, mueva los intestinos cranealmente para visualizar el útero. Siga los cuernos uterinos izquierdo y derecho hasta los ovarios. Estos son órganos pequeños y en los animales mayores pueden estar incrustados en la grasa. Deslice las pinzas debajo del ovario para aislarlo del cuerpo y cortarlo para liberarlo de la grasa y la trompa de Falopio.
En los hombres, para extirpar los testículos, agarre suavemente la almohadilla de grasa inguinal y tire hacia atrás. Esto extraerá los testículos del escroto. Una vez que se hacen visibles, corta las uniones al escroto y a los conductos deferentes para liberar estas estructuras del cuerpo.
A continuación, aprendamos a extraer órganos torácicos, como el corazón y los pulmones. El corazón y los pulmones se extirpan juntos más fácilmente. Para abrir la cavidad torácica, comience colocando al animal en decúbito dorsal. Primero, agarre y levante la apófisis xifoides. A continuación, haz un corte a través del músculo abdominal justo caudal a las costillas. Extienda el corte a lo largo de la curva inferior de la caja torácica en ambos lados, exponiendo el diafragma.
A continuación, perfora el diafragma haciendo un pequeño corte en la caja torácica en el punto más lateral posible a cada lado. Luego, corta el diafragma de las costillas. Ahora levanta las costillas a la altura del xifoides para visualizar los órganos torácicos. Extiende el corte lateral hasta la parte superior del esternón en ambos lados para abrir el pecho. A continuación, coloque las pinzas perpendiculares a la tráquea y sujete firmemente la tráquea. Ahora, con unas tijeras, haz un corte perpendicular justo delante de las pinzas. Esto debería cortar la tráquea y el esófago. Sin aflojar el agarre de la tráquea, levántela caudalmente y corte cualquier unión de los pulmones a la superficie espinal en la caja torácica. Continúe hasta que pueda levantar el corazón y los pulmones para liberarlos de la cavidad torácica.
Para extirpar solo el corazón, levante el órgano y corte con cuidado a través del saco pericárdico. A continuación, sujete la aorta con las pinzas y haga un corte distal a las pinzas. A continuación, corte la vena cava anterior, las arterias pulmonares y las venas. Después de eso, debería poder levantar el corazón para liberarlo de la cavidad torácica.
Ahora, repasemos el procedimiento de recolección del cerebro mediante la técnica aséptica. En los casos en los que el cerebro es el único órgano que se recolecta, los pasos de preparación son los mismos.
Para comenzar la cosecha, sature el cuerpo con alcohol y quite la piel del cuerpo como antes, arriba y sobre el cráneo. Esto permite que todo sea estéril a partir de este momento. A continuación, vuelva a empapar al animal con alcohol, quítese los guantes exteriores y deseche los instrumentos utilizados en la piel. Ahora haz un corte en la nuca y extiéndelo a lo largo de la línea media desde la zona cervical dorsal hasta la punta de la nariz.
Ahora, usando un par de tijeras estériles de recolección de cerebro, haga un corte a través de la columna vertebral en la base del cráneo. Para abrir el cráneo, coloque la punta de las tijeras en el foramen magnum y corte a lo largo de la línea media. Tenga en cuenta que durante este procedimiento de extracción de cerebro, una mano se considera no estéril, ya que agarra la piel del cráneo reflejada debajo de la barbilla para estabilizar la cabeza, mientras que la mano estéril se usa para cortar el cráneo. Después de eso, use el borde plano de la hoja de la tijera para alejar los huesos parietales del cerebro. Y con la espátula, rompa con cuidado las uniones nerviosas en el tronco encefálico y el quiasma óptico debajo del cerebro. Por último, deslice las pinzas cerradas hacia delante y rompa las uniones en los bulbos olfativos. Y el cerebro puede ser lanzado desde el cráneo directamente al medio estéril.
Ahora que hemos repasado los aspectos esenciales de la recolección de tejido estéril, analicemos algunos de los muchos usos de este procedimiento en la investigación biomédica.
Los investigadores de células madre neurales utilizan la técnica de recolección estéril para extraer tejido del cerebro neonatal de ratón, para cultivar estas células in vitro. Esto les permite estudiar el papel de las células madre neurales en el desarrollo y la progresión del cáncer.
Otra área activa de investigación que involucra la recolección de tejidos es el perfil metabólico, que implica el estudio de la fisiología de los tejidos mediante el análisis de los diferentes metabolitos en una muestra. En este ejemplo, los científicos, utilizando una técnica aséptica, recogieron biopsias hepáticas de ratones salvajes y libres de gérmenes y utilizaron espectroscopia de resonancia magnética nuclear, o RMN, para dilucidar la diferencia en el perfil metabólico hepático de las dos poblaciones animales.
Por último, los inmunólogos a menudo realizan la recolección de tejido estéril para estudiar la propagación de la infección. En este experimento en particular, los investigadores realizaron una inyección intratraqueal de la bacteria Pseudomonas aeruginosa para inducir una infección pulmonar crónica. Posteriormente, los animales fueron sacrificados y los pulmones fueron extraídos mediante técnica aséptica para determinar la carga bacteriana a los 3, 7, 14 y 28 días después de la infección.
Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la recolección de tejidos de animales de laboratorio mediante la técnica aséptica. Ahora debería tener una mejor idea de los pasos que debe seguir para garantizar que la esterilidad se mantenga durante toda la cosecha. Y debería ser capaz de extraer los órganos abdominales, torácicos y cerebros de estos animales sin causar ningún daño al tejido. Como siempre, ¡gracias por mirar!
Chapters in this video
0:00
Overview
0:57
Prepping for Sterility: Space, Instruments, and Personnel
2:44
Harvesting Abdominal Organs
6:34
Harvesting Thoracic Organs
8:33
Harvesting Brain
10:19
Applications
11:52
Summary
Videos from this collection: