Citometría de flujo y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS): Aislamiento de linfocitos B esplénicos

1. Preparación

1. Antes de comenzar, ponte guantes de laboratorio y la ropa protectora adecuada.
2. Esterilice todas las herramientas de disección, primero con un detergente y luego con 70% de etanol y luego seque bien.
3. Preparar 50 ml de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene un 2% de suero de becerro fetal (FCS).

2. Disección

1. Usando un sistema de administración de dióxido de carbono, eutanasia el ratón por hipoxia. Asegure el ratón eutanasiado en una placa de disección en posición supina y realice una laparotomía longitudinal utilizando tijeras y fórceps.
2. Usando fórceps, mueva los intestinos y el estómago en el lado derecho del abdomen para exponer el estómago y el bazo. El bazo está unido al estómago.
3. Usando fórceps, sepáre cuidadosamente el bazo del estómago y colóquelo en la placa Petri que contiene 5 ml de HBSS 2% FCS.

3. Aislamiento celular inmune

1. Coloque el bazo en un colador de células de 40 m sobre la misma placa De Petri. Aplastar el bazo con un émbolo para disociarlo en el mismo plato.
2. Transfiera el bazo disociado y el líquido a un tubo centrífugo de 15 ml.
3. Centrifugar el tubo a 370 x g durante 7 min a 10oC y desechar el sobrenadante, evitando el pellet.
4. Resuspenda el pellet en 2 ml de acetato de potasio para lisar los eritrocitos. Espere 2 minutos y luego suba el volumen hasta 15 ml usando HBSS 2% FCS.
5. Centrifugar el tubo de nuevo a 370 x g durante 7 min a 10oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 5 ml de HBSS 2% FCS.
6. Cuente las células usando un ensayo de tinción azul trypan y ajuste la concentración celular final a 10⁷ celdas/ml usando el volumen apropiado de HBSS 2% FCS.

4. Tinción celular

1. Transfiera 200 l de la suspensión celular a seis tubos FACS, etiquetados del 1 al 6.
2. Centrifugar los tubos a 370 x g durante 7 min a 10oC y desechar el sobrenadante evitando el pellet.
3. A continuación, prepare seis nuevas mezclas de anticuerpos añadiendo la cantidad adecuada de anticuerpos a 200-L HBSS 2% FCS de acuerdo con la Tabla 1.
4. A continuación, transfiera estas mezclas de anticuerpos a los tubos FACS numerados correspondientes.
5. Incubar las suspensiones celulares mezcladas con los anticuerpos durante 20 minutos sobre hielo en la oscuridad.
6. Añadir 1 ml de HBSS 2% FCS a cada tubo y luego centrifugar de nuevo a 370 x g durante 3 min a 10oC.
7. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 200 s de HBSS 2% FCS.
8. Transfiera los pellets resuspendidos a los nuevos tubos FACS.

Tabla 1: Los anticuerpos mezclan composición. Para el experimento se prepararon seis mezclas de 200 l de HBSS + anticuerpos. Mix 1 es para el ajuste PMT, las mezclas 2 a 5 son para los ajustes de compensación, y la mezcla 6 es para la clasificación de celdas.

5. Calibración FACS

1. En primer lugar, encienda el clasificador y realice"Fluidics Startup."
2. Encienda la secuencia y espere 15 minutos para que la secuencia se estabilice.
3. Ajuste la amplitud de la corriente para obtener la formación de gotas separadas. A continuación, haga clic en"Punto dulce"para completar el ajuste de amplitud.
4. Ponga el filtro de densidad neutra (N.D.) - 1.0 y abra la interfaz "CST" que significa configuración y seguimiento del citometro.
5. Para realizar un control diario de calidad, primero diluir las perlas CST con el medio FACS siguiendo las instrucciones del fabricante y, a continuación, realizar el control CST.
6. Una vez que el control CST esté completo, substituya el filtro N.D. 1.0 por el filtro N.D. 2.0 en el catómetro.
7. A continuación, diluir las perlas de retardo de caída en el medio FACS siguiendo las instrucciones del fabricante y luego cargar en el FACS.
8. Para garantizar una clasificación adecuada, realice Drop Delay-
   1. Primero haga clic en "Voltaje" y luego "Filtro óptico". El cuadrante derecho debe ser igual al 100%. Si es necesario, ajuste el tornillo láser rojo en el citómetro izquierdo o derecho para obtener el 100% en el cuadrante derecho.
   2. A continuación, realice una ordenación de prueba para asegurarse de que la secuencia cae en el tubo de recogida. Para ello, haga clic en"Cajónde residuos" y comience "Ordenar prueba". Compruebe que las corrientes laterales caigan en tubos de recolección. Si no lo hacen, ajuste el voltaje hasta que lo hagan.
   3. Vaya a la plantilla experimental. A continuación, abra el experimento "Accudrop Drop Delay" y haga clic en el"Diseño de clasificación".
   4. Cambie el caudal para obtener de 1000 a 3000 eventos por segundo.
   5. Haga clic en "Voltaje" y luego "Filtro óptico". El cuadrante izquierdo debe ser igual a 0 y el cuadrante derecho a 100.
   6. En la ventana"Ordenar diseño"haga clic en "Ordenar" y luego haga clic en "Cancelar". El cuadrante izquierdo debe ser igual a 100 y el cuadrante derecho a 0. Si el cuadrante izquierdo es inferior a 95, haga clic en "Retardo automático"para ajustarlo automáticamente.

6. Citometría de flujo y control de pureza

1. Comience la citometría de flujo comenzando con el tubo 1 (células no manchadas) para definir la morfología celular y los picos negativos de los fluorocromos. Configure la dispersión hacia delante y hacia los lados y defina los voltajes de cada parámetro fluorescente. Coloque la población negativa en la primera década utilizando las cuadrículas en cada parcela de puntos.
2. A continuación, el tubo de carga 2 (control de un solo color) en el catómetro. Ajuste la superposición espectral hasta que las medianas de población negativas y positivas estén alineadas o utilice el software de cálculo automático. Es importante mantener la señal a escala. Los controles de compensación deben coincidir con la configuración experimental de fluorocromos y detectores. Graba 10.000 eventos.
3. Repita estos pasos con los tubos 3, 4 y 5 (otros controles de color único).
4. A continuación, cargue el tubo 6 (células de varios puntos) y defina las poblaciones celulares de interés mediante una estrategia de gating específica.
5. En la ventana Diseño de ordenación, seleccione el rellenado de celdas de interés. Seleccione el umbral de celda en el "Eventos de destino" y el nivel de precisión en el "Precisión". Aquí sólo se está ordenando una población, sin embargo, cuatro poblaciones diferentes se pueden clasificar al mismo tiempo.
6. Una vez listo, haga clic en "Ordenar" y"Aceptar",a continuación, espere a la ordenación de celdas.
7. Una vez completada la clasificación celular, realice un control de pureza pipeteando por primera vez 10 l de células clasificadas en un nuevo tubo FACS con 90 microlitros de HBSS 2% FCS.
8. A continuación, cargue el tubo del catómetro. Registre y analice los fenotipos de las células para verificar que la estrategia de gating funcionó según lo previsto.

7. Análisis de datos

1. Abra el software 'FlowJo' y arrastre los archivos para cada tubo en la ventana"Todos los muestras".
2. Haga doble clic en un archivo para abrirlo en una nueva ventana.
3. Haga clic en el"Polígono"y vuelva a crear la estrategia de gating utilizada anteriormente.
4. Repita los pasos con todos los demás archivos.
5. Para visualizar las gráficas de puntos, haga clic en " Editor dediseño" y arrastre las poblaciones de interés desde el tubo 6 y el control de pureza en la pestaña editor de diseño.
6. Para comprobar la pureza de los linfocitos B en las células ordenadas, haga clic en"Editorde tablas". Arrastre la población de linfocitos B del tubo 6 y el control de pureza en la tabla.
7. En el menú"Estadística"seleccione la frecuencia de las celdas CD45⁺ para probar la pureza de esta población de células, luego haga clic en"Crear tabla".
8. Los valores de parámetro aparecen en una nueva tabla. En la ventana de control de pureza, compruebe la frecuencia de los linfocitos B dentro de las células CD45^+, que debe ser superior al 98% (ver figura 2, panel inferior).