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Clasificación celular activada magnéticamente (MACS): Aislamiento de linfocitos T del timo

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Immunology

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Magnetic Activated Cell Sorting (MACS): Isolation of Thymic T Lymphocytes

5.1: Flow Cytometry and Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS): Isolation of Splenic B Lymphocytes

5.3: ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

22,381 Views

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11:35 min

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April 30, 2023

Overview

Fuente: Meunier Sylvain^1,2,3, Perchet Thibaut^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
¹ Unidad de Linfopoyesis, Departamento de Inmunología, Instituto Pasteur, París, Francia
² INSERM U1223, París, Francia
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, París, Francia
⁴ Flow Cytometry Platfrom, Citometría y Biomarcadores UtechS, Centro de Ciencias Traslacionales, Instituto Pasteur, París, Francia

La defensa contra los patógenos depende de la vigilancia del sistema inmunitario. Este sistema es complejo y comprende muchos tipos de celdas, cada uno con funciones específicas. Esta compleja composición permite respuestas inmunitarias a una gran diversidad de patógenos y lesiones. La inmunidad adaptativa permite respuestas específicas contra patógenos específicos. La mayoría de las células responsables de este tipo de inmunidad son los linfocitos (células B y células T). Por lo general, las células B responden a infecciones extracelulares (como infecciones bacterianas) y las células T responden a infecciones intracelulares (como infecciones virales). Los diferentes tipos de células en las poblaciones de linfocitos se pueden caracterizar por la combinación de proteínas de superficie celular que expresan y/o por un panel de citoquinas secretadas.

La clasificación magnética permite el enriquecimiento de las poblaciones celulares objetivo utilizando propiedades magnéticas y la expresión de una o varias proteínas de superficie celular (1, 2). Esta técnica consta de tres pasos. En primer lugar, las células se incuban con cuentas magnéticas que se acoplan con uno o varios anticuerpos monoclonales específicos. Las células que expresan proteínas superficiales que se unen a estos anticuerpos se unen a las cuentas magnéticas. Luego, las poblaciones celulares objetivo son capturadas con un imán. Para terminar, las células objetivo se eluyen del imán. Al final, se obtienen dos productos de clasificación, uno que contiene células sin etiquetar y el segundo que contiene las células diana junto con las cuentas magnéticas. Las columnas se pueden utilizar para mejorar la eficiencia de la clasificación magnética. En la columna, un elemento no magnético alarga la ruta de la celda a través de la columna. Por lo tanto, el flujo celular se ralentiza, facilitando la captura celular por el imán.

Figura 1: Representación esquemática de separación magnética. Los leucocitos timicos están manchados con anticuerpos biotinilados anti-CD3. Después del lavado, las perlas acopladas con estreptavidina (SAV) fijan específicamente la biotina en anticuerpos anti-CD3. (1) Las celdas se transfieren en una columna. (2) El imán no retiene las células sin etiquetar, mientras que las células CD3-positivas permanecen en la columna. Finalmente, la columna se separa del imán y (3) las células CD3-positivas se eluyen en medio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Existen dos tipos de clasificación magnética (3). En la clasificación positiva, las células de interés se capturan con las cuentas magnéticas. En la clasificación negativa, las células no deseadas se eliminan capturando con las cuentas magnéticas que llevan los anticuerpos apropiados. Esta técnica MACS permite un buen enriquecimiento de células específicas y mejora el porcentaje de células recuperadas de 1-20% a 60-98% en un órgano. Después de la clasificación, es necesario verificar la pureza de la célula y la clasificación por diferentes métodos (por ejemplo, citometría de flujo). La técnica MACS es ideal para enriquecer una población objetivo para otros experimentos como el cultivo celular o el análisis del ciclo celular.

En este ejercicio de laboratorio, demostramos cómo aislar leucocitos timicos y, a partir de entonces, enriquecer las células timómicas CD3-positivas de la mezcla utilizando la técnica de clasificación de células magnéticas.

Procedure

1. Preparación

Antes de comenzar, ponte guantes de laboratorio y ropa protectora adecuada.
Lave todas las herramientas de disección, primero con un detergente y luego con 70% de etanol y luego séquelas con una toalla de papel limpia.
Preparar 200 ml de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene un 2% de suero de becerro fetal (FCS).

2. Disección

Ancle un ratón eutanasiado en una placa de disección en la posición supina.
Usando tijeras y fórceps realizar una laparotomía longitudinal para acceder a la cavidad torácica.
Retire el corazón para acceder al timo, que se encuentra por encima del corazón. Luego, identifica el timo, que se compone de dos lóbulos blancos y se encuentra en la cavidad torácica por encima del corazón.
Usando fórceps separa cuidadosamente el timo y colócalo en el plato Petri con 5 ml de HBSS 2% FCS.

3. Aislamiento de células inmunes

Coloque el timo en un colador de células de 40 m sobre el mismo plato de Petri. Aplastar el timo con un émbolo para disociarlo en el mismo plato.
Transfiera el timo disociado y el líquido a un tubo centrífugo de 15 ml.
Lavar el plato Petri con 5 ml de HBSS 2% FCS y transferir el medio lavado también en el mismo tubo centrífugo.
Centrifugar el tubo a 370 x g durante 7 min a 20oC y desechar el sobrenadante evitando el pellet.
Resuspenda el pellet en 2 ml de acetato de potasio para lisar los eritrocitos. Espere 2 minutos y luego suba el volumen hasta 14 ml usando HBSS 2% FCS.
Centrifugar el tubo de nuevo a 370 x g durante 7 min a 20oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 5 ml de HBSS 2% FCS.
Calcule la concentración celular utilizando el ensayo de tinción azul trypan y ajuste la concentración celular final a 10⁷ células/ml utilizando el volumen apropiado de HBSS 2% FCS.

4. Etiquetado magnético de las células inmunitarias

Tome dos tubos FACS. Etiquetar un tubo, “células T no enriquecidas”, y el otro tubo, “células T enriquecidas”, que se separarán mediante etiquetado magnético.
Distribuir la solución celular en cada uno de los dos tubos FACS.
Centrifugar el tubo de “células T enriquecidas” a 370 x g durante 3 min a 20oC y desechar el sobrenadante evitando el pellet.
Resuspenda el pellet en 250 ml de mezcla de anticuerpos biotinilados anti-CD3 (Tabla 1, Mezcla 1).

Mezcla	Reactivos de etiquetado	Dilución
1	Anticuerpo biotinylato anti-CD3	1/400 (en HBSS 2% FCS)
2	Abalorios acoplados de Streptavidin	1/5 (en HBSS 2% FCS)
3	Anti-CD3 BV421	1/200 (en HBSS 2% FCS)

Tabla 1: Los anticuerpos mezclan composición. Las mezclas 1 y 2 se utilizan para la separación magnética. Mix 3 se utiliza para evaluar el enriquecimiento celular después de la separación magnética.

Incubar la mezcla de anticuerpos de suspensión celular durante 15 minutos a 4oC en la oscuridad.
Añadir 3 ml de HBSS 2% FCS a ambos tubos y centrifugarlos de nuevo a 370 x g durante 3 min a 20oC.
Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en perlas acopladas con estreptavidina de 250 ol (Tabla 1, Mezcla 2).
Incubar la mezcla celular y las cuentas durante 20 minutos sobre hielo.
A continuación, añadir 3 ml de HBSS 2% FCS y mezclar bien y centrifugar de nuevo a 370 x g durante 3 min a 20 oC.
Resuspenda el pellet en 2 ml de HBSS 2% FCS.

5. Separación magnética de células CD3-positivas

Coloque la columna en el imán y agregue 3 ml de HBSS 2% FCS para humidificar el sistema. Espera 5 minutos.
A continuación, clasifique las celdas etiquetadas en la columna.
Después de que la suspensión celular pase a través de la columna, lave la columna X3 veces con 3 ml de HBSS 2% FCS.
A continuación, retire la columna del imán y colóquela en un tubo de recogida de 15 ml.
Para eluir las celdas de destino, agregue 5 ml de HBSS 2% FCS a la columna y enjuague la columna con el émbolo.
Repita el paso de elución con otros 5 ml de HBSS 2% FCS.

6. Evaluación del enriquecimiento de células objetivo por citometría de flujo

Transfiera 500 l de suspensión celular eluida a un tubo FACS etiquetado como “células T enriquecidas”. Transfiera 200 l de suspensión de “células T no enriquecidas” a un segundo FACS.
A continuación, centrifugar ambos tubos a 370 x g durante 7 min a 20oC.
Deseche el sobrenadante y, a continuación, añada 100 ml de anticuerpo fluorescente Mix 3 (ver Tabla 1) a ambos tubos.
Incubar ambos tubos durante 20 min a 4oC en la oscuridad.
A continuación, añadir 3 ml de HBSS 2% FCS a los tubos y centrifugarlos a 370 x g durante 3 min a 20oC.
Deseche el sobrenadante y, a continuación, vuelva a suspender cada tubo en 250 ml de HBSS 2% FCS.
Ahora, evalúe la tasa de enriquecimiento celular CD3-positiva por citometría de flujo.

7. Análisis de datos

Abra el icono ‘FlowJo’ y arrastre los archivos para cada tubo en la ventana“Toda la muestra”.
Haga doble clic en el archivo “células T enriquecidas” para mostrar la gráfica de puntos que muestra la dispersión hacia delante (FSC-A) en el eje X y la dispersión lateral (SSC-A) en el eje Y.
Haga clic en“Polígono”para rodear las poblaciones de linfocitos.
A continuación, haga doble clic en la población en círculos para crear una nueva ventana.
Seleccione “FSC-W” en el eje Y y “FSC-A” en el eje X, y circule las celdas negativas FSA-W. En la ventana“Identificación de subpoblación”,asigne a la población de células el nombre “células únicas”.
Haga doble clic en la población en círculos para crear una nueva ventana. Seleccione “CD3″en el eje Y y circule las celdas con título CD3. En la ventana“Identificación de subpoblación”nombre su población celular “células T”.
Repita con las “células T no enriquecidas”.
Para visualizar la población de celdas, haga clic en ” Editor dediseño” y arrastre la población“Células T”de “células T enriquecidas” y “células T no enriquecidas” a la pestaña.
Aparecerán gráficas de puntos que representan linfocitos CD3+. Las células CD3+ solo deben aparecer en la población de interés en el tubo enriquecido CD3+.
Para evaluar el enriquecimiento de linfocitos CD3+ en las células ordenadas, haga clic en“Editorde tablas”, y luego arrastre la población de “células T” de “células T enriquecidas” y “células T no enriquecidas” a la tabla.
En el menú“Estadística”,seleccione“Frecuencia de linfocitos” célulaspara comprobar el porcentaje de células CD3+ en todos los linfocitos, luego haga clic en“Crear tabla”.
Los valores de parámetro aparecerán en una nueva tabla. Para las “células T enriquecidas”, la frecuencia de las células CD3+ debe ser de alrededor del 80%.

La clasificación celular activada magnéticamente, o MACS, es una técnica que permite a los investigadores separar las células en función de epítopos específicos expresados en sus superficies.

El proceso generalmente comienza con la extracción de un órgano o tejido, como el timo. Luego, las células se separan mecánicamente, generalmente por aplastamiento, hasta que el tejido se disocia en células individuales. Las células no deseadas se pueden eliminar en esta etapa a través de la adición de productos químicos. Por ejemplo, el amonio-cloruro-potasio, o tampón ACK, se puede utilizar para lise eritrocitos no deseados.

A continuación, un anticuerpo conjugado con una molécula llamada biotina se añade a la suspensión, y estos complejos se unen a los epítopos de la superficie de las células diana. La biotina tiene una alta afinidad por otra molécula llamada streptavidina. En el siguiente paso, las moléculas de estreptavidina fusionadas con cuentas magnéticas se añaden a las células etiquetadas como anticuerpos. Cuando la biotina y la estreptavidina entran en contacto, se unen firmemente. El resultado es que las células de interés están recubiertas con cuentas magnéticas. Este complejo se conoce a veces como un sándwich. En este caso, CD3 en la membrana celular en la parte inferior, luego anti-CD3 conjugado a la biotina, y finalmente, la esptavidina conjugada con cuentas magnéticas.

Estas células etiquetadas ahora se pueden colocar en una columna que contiene una matriz que, asistida por la gravedad, permite que las células pasen lentamente por un imán. A medida que lo hagan, las células con cuentas magnéticas se pegarán al borde del tubo más cercano al imán, mientras que las células no etiquetadas continuarán en un tubo de recolección a continuación. A continuación, las células etiquetadas se pueden eliminar de la columna simplemente quitando el imán, añadiendo una solución eluyente y aplicando una suave presión con un émbolo para eliminarlas de la columna y en un tubo de recolección fresco. En última instancia, este proceso permite una recuperación de 60 a 98% de las células de interés.

En este procedimiento, aislaremos los leucocitos timicos de un ratón y usaremos MACS para ordenar las células T CD3 positivas antes de confirmar la eficiencia de la clasificación utilizando FACS.

Para empezar, ponte cualquier equipo de protección apropiado, incluyendo una capa de laboratorio y guantes. A continuación, lave un par de tijeras dissección y fórceps con 70% de etanol y séquelas con una toalla de papel limpia. A continuación, prepare 200 mililitros de SUERO de becerro fetal HBSS 2% o FCS, mezclando cuatro mililitros de FCS con 196 mililitros de HBSS.

Ancle un ratón eutanasiado en una posición supina en una placa de disección. Con tijeras y fórceps, realice una laparotomía longitudinal para acceder a la cavidad torácica. Primero, quita el corazón para tener acceso al timo, que se encuentra sobre el corazón. Luego identifica el timo, que se compone de dos lóbulos blancos. Usando fórceps, desenganche cuidadosamente el timo y colóquelo en un plato de Petri con cinco mililitros de HBSS 2% FCS.

Para aislar las células inmunitarias, coloque primero el timo en un colador de células de 40 micrómetros en el plato Petri. Aplastar el tejido con un émbolo para disociarlo en el plato. Después de esto, enjuague el émbolo y el colador con HBSS 2% FCS para recuperar las células adheridas. Luego, pipetee las células disociadas del timo y el líquido de la placa Petri en un tubo centrífugo de 15 mililitros. Lave el plato Petri con cinco mililitros de HBSS 2% FCS y transfiera esta solución de lavado al tubo centrífugo de 15 mililitros también.

A continuación, centrifugar el tubo a 370 veces g durante siete minutos a 20 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en dos mililitros de tampón de lising ACK para liciar los eritrocitos. Incubar durante dos minutos a temperatura ambiente en la parte superior del banco. A continuación, llevar el volumen a 14 mililitros con HBSS 2% FCS. Centrifugar el tubo a 370 veces g durante siete minutos a 20 grados centígrados. Luego, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en cinco mililitros de HBSS 2% FCS.

Estimar la concentración celular utilizando una diapositiva De Malassez como se muestra en el protocolo para el aislamiento FACS de linfocitos B y ajustar la concentración celular a 10 a las séptimas células por mililitro con HBSS 2% FCS.

Transfiera 500 microlitros de solución celular en dos tubos FACS. Etiquetar un tubo de células T no enriquecidas y el otro tubo enriquecido de células T, que se separarán mediante etiquetado magnético.

Centrifugar el tubo de células T enriquecidos a 370 veces g durante tres minutos a 20 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 250 microlitros de anticuerpo anti CD3 acoplado a biotina diluido uno de cada 400 en HBSS 2% FCS. Incubar las células durante 20 minutos sobre hielo y en la oscuridad. Añadir tres mililitros de HBSS 2% FCS a los tubos y centrifugardelos de nuevo a 370 veces g durante tres minutos a 20 grados Centígrados. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 250 microlitros de perlas acopladas con estreptavidina diluidas una de cada cinco en HBSS 2% FCS. Incubar la mezcla de células y cuentas durante 20 minutos sobre hielo. A continuación, agregue tres mililitros de HBSS 2% FCS al tubo, pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar, y centrifugar de nuevo a 370 veces g durante tres minutos a 20 grados Centígrados. Resuspenda el pellet en dos mililitros de HBSS 2% FCS.

Coloque la columna en el imán y agregue tres mililitros de HBSS 2% FCS para humidificar el sistema. A continuación, pipetee las celdas manchadas en la columna. Después de que la suspensión celular pase a través de la columna, lave la columna tres veces con tres mililitros de HBSS 2% FCS. A continuación, retire la columna del imán y colóquela en un tubo de 15 mililitros. Para eluir las celdas de destino, agregue cinco mililitros de HBSS 2% FCS a la columna y enjuague la columna con un émbolo. Repita este paso con otros cinco mililitros de HBSS 2% FCS.

Para evaluar la eficacia del aislamiento celular objetivo, primero transfiera 500 microlitros de suspensión celular eluida a un tubo FACS y etiquete las células T enriquecidas. A continuación, centrifugar los tubos enriquecidos y no enriquecidos a 370 veces g durante siete minutos a 20 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y, a continuación, añada 100 microlitros de anticuerpos fluorescentes diluidos uno en 200 en HBSS 2% FCS a ambos tubos. Incubar las células durante 20 minutos sobre hielo y en la oscuridad. A continuación, añadir tres mililitros de HBSS 2% FCS a los tubos y centrifugarlos a 370 veces g durante tres minutos a 20 grados Centígrados. Deseche el sobrenadante y luego resuspenda los pellets en 250 microlitros de HBSS 2% FCS. Ahora, evalúe la velocidad de enriquecimiento de células CD3-positiva usando la citometría de flujo como se muestra en el protocolo FACS.

Ahora, determinaremos la frecuencia de los linfocitos CON positivo CD3 entre todos los timocitos que estaban aislados del timo del ratón. Para empezar, haga doble clic en el icono FlowJo y arrastre los archivos para cada tubo en la ventana de muestra. A continuación, haga doble clic en el archivo de celdas T enriquecidos para mostrar las celdas registradas a partir de esa muestra en una gráfica de puntos que muestra la dispersión hacia delante, FSCA, en el eje X, y dispersión lateral, SSCA, en el eje Y.

Haga clic en polígono para rodear las poblaciones de linfocitos. A continuación, haga doble clic en la población en círculos para crear una nueva ventana. Seleccione FSC-W en el eje Y y FSC-A en el eje X y circule las celdas negativas FSA-W. En la ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a la población de celdas Células únicas. A continuación, haga clic en Aceptar en la ventana de identificación de subpoblación, luego haga doble clic en la población en círculos para crear una nueva ventana. Seleccione CD3 en el eje Y y circule las celdas con positivo CD3. En la ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a las células T de la población celular. Repita con el archivo de celdas T no enriquecidos. Para visualizar el rellenado de celdas, haga clic en Editor de diseño y arrastre la población de celdas T de celdas T enriquecidas y archivos de celdas T no enriquecidos a la pestaña.

Aparecerán gráficas de puntos que representan linfocitos CON positivo CD3. Las células CD3 positivas sólo deben aparecer en la población de interés en el tubo enriquecido cd3 positivo. Para evaluar el enriquecimiento de linfocitos con positivo CD3 en las células ordenadas, haga clic en Editor de tablas y, a continuación, arrastre la población de células T de células T enriquecidas y archivos de células T no enriquecidas a la tabla. En el menú de estadísticas, seleccione Frecuencia de células de linfocitos para comprobar el porcentaje de células con indicadores CD3 en todos los linfocitos. A continuación, haga clic en Crear tabla. Los valores de parámetro aparecerán en una nueva tabla. Para las células T enriquecidas, la frecuencia de las células CON m2 con positivo CD3 debe estar alrededor del 80% o superior.

Results

En este protocolo, las células CD3 positivas se enriquecieron a partir de leucocitos timicos utilizando la clasificación de células magnéticas (Figura 1). Antes del enriquecimiento de células magnéticas, las células CD3 positivas representaban el 53,6% del total de células timicas (Figura 2, paneles superiores). Después del enriquecimiento de células magnéticas, el porcentaje de células con positivo CD3 aumentó al 95% (Figura 2, paneles inferiores). Por lo tanto, MACS es una técnica de enriquecimiento celular simple, rápida y eficiente para enriquecer las poblaciones celulares deseadas a partir de una mezcla de suspensión celular.

Figura 2: Estrategia de gating y clasificación de pruebas de pureza. Las celdas se encerradan primero en función de su morfología (izquierda: FSC-A, SSC-A), y luego las células se trazan contra CD3 (derecha: CD3, SSC-A). El panel superior representa la suspensión de la célula del timo antes del enriquecimiento celular. El panel inferior representa la suspensión de la célula del timo después de la clasificación de células magnéticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Applications and Summary

La tecnología de separación magnética es un método común para clasificar fácil y rápidamente una población celular objetivo. Usando células T anticuerpos específicos y cuentas magnéticas enriquecimos la frecuencia de las células T en nuestra muestra. La tasa de pureza al final del experimento depende del porcentaje de células diana en la suspensión celular inicial. Las células obtenidas después de la clasificación de células magnéticas se pueden utilizar para diversos propósitos, como la transferencia celular o el análisis del ciclo celular. Otro método de clasificación, utilizando citometría de flujo, se puede utilizar para enriquecer las celdas. Esta técnica produce una tasa de pureza muy alta después de la clasificación celular, sin embargo, requiere más pasos y toma más tiempo.

References

Owen, C. S. and Sykes, N. L. Magnetic labeling and cell sorting. Journal of Immunological Methods. 73 (1), 41-48 (1984).
Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W. and Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
Plouffe, B. D., Murthy, S. K. and Lewis, L. H. Fundamentals and application of magnetic particles in cell isolation and enrichment: a review. Reports on Progress in Physics. 78 (1), (2014).

Transcript

Magnetic-activated cell sorting, or MACS, is a technique that allows researchers to separate cells based on specific epitopes expressed on their surfaces.

The process typically begins with extraction of an organ or tissue, such as the thymus. Then, the cells are mechanically separated, usually by crushing, until the tissue is dissociated into single cells. Unwanted cells can be removed at this stage via the addition of chemicals. For example, ammonium-chloride-potassium, or ACK buffer, can be used to lyse unwanted erythrocytes.

Next, an antibody conjugated to a molecule called biotin is added to the suspension, and these complexes bind to the epitopes of the surface of the target cells. Biotin has a high affinity for another molecule called streptavidin. In the next step, streptavidin molecules fused to magnetic beads are added to the antibody labeled cells. When the biotin and streptavidin come into contact, they tightly bind. The result is that the cells of interest are coated with magnetic beads. This complex is sometimes referred to as a sandwich. In this case, CD3 on the cell membrane on the bottom, then anti-CD3 conjugated to biotin, and finally, streptavidin conjugated to magnetic beads.

These labeled cells can now be placed into a column containing a matrix which, assisted by gravity, allows the cells to pass slowly by a magnet. As they do so, the magnetic bead-labeled cells will stick to the edge of the tube nearest the magnet, while the non-labeled cells will continue on into a collection tube below. Next, the labeled cells can be removed from the column by simply removing the magnet, adding an eluent solution, and applying gentle pressure with a plunger to flush them out of the column and into a fresh collection tube. Ultimately, this process allows for 60 to 98% retrieval of the cells of interest.

In this procedure, we will isolate thymic leukocytes from a mouse and use MACS to sort out CD3-positive T-cells before confirming the efficiency of sorting using FACS.

To begin, put on any appropriate protective equipment including a lab coat and gloves. Next, wash a pair of dissecting scissors and forceps with 70% ethanol and dry them with a clean paper towel. Then prepare 200 milliliters of HBSS 2% fetal calf serum, or FCS, by mixing four milliliters of FCS with 196 milliliters of HBSS.

Pin a euthanized mouse in a supine position on a dissection plate. Using scissors and forceps, perform a longitudinal laparotomy to access the chest cavity. First, remove the heart to gain access to the thymus, which is located above the heart. Then identify the thymus, which is composed of two white lobes. Using forceps, carefully detach the thymus and place it on a Petri dish with five milliliters of HBSS 2% FCS.

To isolate the immune cells, first place the thymus on a 40 micrometer cell strainer in the Petri dish. Crush the tissue with a plunger to dissociate it into the dish. After this, rinse the plunger and strainer with HBSS 2% FCS to recover any adhered cells. Then, pipette the dissociated thymus cells and fluid from the Petri dish into a 15 milliliter centrifuge tube. Wash the Petri dish with five milliliters of HBSS 2% FCS and transfer this wash solution to the 15 milliliter centrifuge tube also.

Next, centrifuge the tube at 370 times g for seven minutes at 20 degrees Celsius. Discard the supernatant and resuspend the pellet in two milliliters of ACK lysing buffer to lyse the erythrocytes. Incubate for two minutes at room temperature on the bench top. Then, bring the volume to 14 milliliters with HBSS 2% FCS. Centrifuge the tube at 370 times g for seven minutes at 20 degrees Celsius. Then, discard the supernatant and resuspend the cells in five milliliters of HBSS 2% FCS.

Estimate the cell concentration using a Malassez slide as shown in the protocol for FACS isolation of B lymphocytes and adjust the cell concentration to 10 to the seventh cells per milliliter with HBSS 2% FCS.

Transfer 500 microliters of cell solution into two FACS tubes. Label one tube non-enriched T-cells and the other tube enriched T-cells, which will be separated using magnetic labeling.

Centrifuge the enriched T-cells tube at 370 times g for three minutes at 20 degrees Celsius. Discard the supernatant and resuspend the pellet in 250 microliters of biotin coupled anti CD3 antibody diluted one in 400 in HBSS 2% FCS. Incubate the cells for 20 minutes on ice and in the dark. Add three milliliters of HBSS 2% FCS to the tubes and centrifuge them again at 370 times g for three minutes at 20 degrees Celsius. Discard the supernatant and resuspend the pellet in 250 microliters of streptavidin-coupled beads diluted one in five in HBSS 2% FCS. Incubate the mixture of cells and beads for 20 minutes on ice. Next, add three milliliters of HBSS 2% FCS to the tube, pipette up and down to mix, and centrifuge again at 370 times g for three minutes at 20 degrees Celsius. Resuspend the pellet in two milliliters of HBSS 2% FCS.

Place the column on the magnet and add three milliliters of HBSS 2% FCS to humidify the system. Then, pipette the stained cells into the column. After the cell suspension passes through the column, wash the column three times with three milliliters of HBSS 2% FCS. Next, remove the column from the magnet and place it in a 15 milliliter tube. To elute the target cells, add five milliliters of HBSS 2% FCS to the column and flush the column with a plunger. Repeat this step with another five milliliters of HBSS 2% FCS.

To evaluate the effectiveness of target cell isolation, first transfer 500 microliters of eluted cell suspension to a FACS tube and label it enriched T-cells. Then, centrifuge both the enriched and non-enriched tubes at 370 times g for seven minutes at 20 degrees Celsius. Discard the supernatant, then add 100 microliters of fluorescent antibody diluted one in 200 in HBSS 2% FCS to both tubes. Incubate the cells for 20 minutes on ice and in the dark. Next, add three milliliters of HBSS 2% FCS to the tubes and centrifuge them at 370 times g for three minutes at 20 degrees Celsius. Discard the supernatant, then resuspend the pellets in 250 microliters of HBSS 2% FCS. Now, evaluate the CD3-positive cell enrichment rate using flow cytometry as shown in the FACS protocol.

Now, we will determine the frequency of CD3-positive lymphocytes among all thymocytes that were isolated from the mouse thymus. To start, double click on the FlowJo icon and drag the files for each tube in the all sample window. Then, double click on the enriched T-cells file to display the cells recorded from that sample on a dot plot that displays forward scatter, FSCA, on the x-axis, and side scatter, SSCA, on the y-axis.

Click on polygon to circle the lymphocyte populations. Next, double click on the circled population to create a new window. Select FSC-W on the y-axis, and FSC-A on the x-axis and circle the FSA-W negative cells. In the sub population identification window, name your cell population Single Cells. Next, click on OK on the sub population identification window, then double click on the circled population to create a new window. Select CD3 on the y-axis, and circle the CD3-positive cells. In the sub population identification window, name your cell population T-cells. Repeat with the non-enriched T-cells file. To visualize your cell population, click Layout Editor and drag the T-cell population from enriched T-cells and non-enriched T-cells files into the tab.

Dot plots representing CD3-positive lymphocytes will appear. CD3-positive cells should only appear in the population of interest in the CD3-positive enriched tube. To evaluate the enrichment of CD3-positive lymphocytes in the sorted cells, click on Table Editor and then drag the T-cells population from enriched T-cells and non-enriched T-cells files into the table. On the statistic menu, select Frequency of Lymphocyte Cells to check the percentage of CD3-positive cells in all lymphocytes. Then, click on Create Table. Parameter values will appear in a new table. For the enriched T-cells, the frequency of CD3-positive cells should be around 80% or above.

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