Ensayos ELISA: Indirecto, Sándwich y Competitivo

1. ELISA indirecto

Un ELISA indirecto es aquel en el que el anticuerpo específico del antígeno primario es reconocido por un anticuerpo conjugado secundario. El siguiente protocolo es un ejemplo de un método ELISA indirecto, donde las muestras séricas de ratones infectados por el virus de la gripe A (IAV) se prueban para detectar la presencia de anticuerpos IgG específicos de IAV. Una fortaleza de este ejemplo es que se pueden utilizar diferentes anticuerpos secundarios que reconocen todos los isotipos de anticuerpos o isotipos específicos (por ejemplo, IgG).

Antígeno de recubrimiento a la microplaca

1. Recubrir los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos con antígeno purificado pipeteando 50 l de antígeno purificado (2 mg/ml del virus purificado De/PR/8 influenza A en un tampón Tris-HCl de 0,05M (pH 9,5)) en cada pocal de la placa.
2. Cubra la placa con una cubierta adhesiva e incubarla durante la noche a 4oC para permitir que el antígeno se adhiera a la placa.
3. Una vez completada la incubación, retire la solución de recubrimiento moviendo la placa sobre un fregadero.

Bloqueo

4. Bloquear los sitios de unión a proteínas restantes en los pozos recubiertos mediante la adición de tampón de bloqueo de 200 l, 5% suero de burro en 1X PBS se utiliza aquí, por pozo. Los reactivos de bloqueo alternativos incluyen un 5% de leche seca sin grasa o BSA en PBS o suero normal de un animal en el que se generó el anticuerpo secundario.
5. Incubar durante al menos 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC.
6. Después de la incubación, retire el tampón de bloqueo moviendo la placa y luego lave la placa con PBS que contenga 1% de Tween-20.

Incubación con el anticuerpo primario

7. Preparar una dilución en serie de la muestra sérica, que contiene el anticuerpo primario, para obtener un rango de dilución de 1 a 204.800, utilizando 1X PBS. Para ello, primero diluir el suero 1:12.5 y luego realizar una dilución 4X (rango de dilución - 1:12.5 a 1:204,800).
8. Añadir 100 l de las muestras de suero diluidas en serie a los pozos.
9. Placa de cubierta con tapa adhesiva e incubar a temperatura ambiente durante 1-2 h.
10. Después de la incubación, mueva la placa sobre un fregadero y lave la placa con PBS que contenga 1% de Tween-20.

Incubación con el anticuerpo secundario

11. Añadir 100 l de un anticuerpo secundario conjugado en zimdulación, peroxidasa de rábano picante, anti-ratón conjugado con HRP secundario en este experimento, a cada pocto.
12. Incubar la placa durante 1 hora a temperatura ambiente.
13. Después de la incubación, mueva la placa sobre un fregadero y luego lave la placa con PBS que contenga 1% de Tween-20.

Detección

14. Añadir 100 l del sustrato del indicador (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)) a una concentración de 1 mg/ml a cada pocal.
15. Incubar la placa con el sustrato durante 5-10 min a temperatura ambiente.
16. Después de 10 min, detenga la reacción enzimática añadiendo ácido sulfúrico de 100 l 2N (H₂SO₄).
    Dentro de 30 minutos de la adición de la solución de parada, lea la placa utilizando un lector de microplacas a 405 nm para determinar la absorbancia de los pozos.

2. Sandwich ELISA

En esta versión DE ELISA, la muestra experimental se "se intercala" entre un anticuerpo de captura no conjugado y un anticuerpo de detección conjugado, ambos específicos de la misma proteína pero en diferentes epítopos. En el siguiente ejemplo de ELISA sándwich, la concentración de TNF humano se determinó en una muestra desconocida utilizando una curva estándar generada a partir de una dilución en serie 2.5X de un TNF humano recombinante estándar conocido (indicando a una concentración de 75 pg/ml).

Recubrimiento captura de anticuerpos en la microplaca

1. Recubrir los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos con anticuerpo de captura purificado añadiendo 100 s de anticuerpo de captura (rango de 1-10 g/ml) a cada pocil de la placa.
2. Cubra la placa con una cubierta adhesiva de la placa e incubarla durante la noche a 4oC.
3. Después de la incubación, retire la solución de recubrimiento de la placa moviendo la placa sobre un fregadero.

Bloqueo

4. Bloquear los sitios de unión a proteínas restantes en los pozos recubiertos de anticuerpos añadiendo una solución de bloqueo de 200 ol, un 5% de leche seca sin grasa que contenga PBS, a los pozos.
5. Incubar durante al menos 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC.
6. Después de la incubación, retire el tampón de bloqueo moviendo la placa y luego lave la placa con PBS que contenga 1% de Tween-20.

Añadir antígeno que contenga muestras de prueba

7. Añadir 100 l de la muestra de prueba a los pozos. Selle la placa con una cubierta adhesiva.
8. Incubar durante 1-2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC.
9. Después de la incubación, retire las muestras moviendo la placa sobre el fregadero y luego lave los pozos con 200 S 1X PBS que contengan 1% De entre 20.

Añadir anticuerpo de detección conjugado enzimático

10. Añadir 100 l de anticuerpo de detección conjugado enzimático a los pozos a una concentración preoptimizada.
11. Sellar la placa con una cubierta adhesiva e incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
12. Retire el anticuerpo de detección sin ataduras moviendo la placa sobre un fregadero y lave los pozos con 200 s 1X PBS que contengan 1% de Tween-20.

Detección

13. Añadir 100 l del sustrato del indicador a una concentración de 1 mg/ml. Cualquier anticuerpo de detección conjugado enzimático unido convertirá el sustrato en una señal detectable.
14. Incubar la placa durante 5-10 min a temperatura ambiente.
15. Después de 5-10 min, detenga la reacción enzimática añadiendo 100 s 2N H₂SO₄ a los pozos. Dentro de los 30 minutos de la adición de la solución de parada, lea la placa utilizando un lector de microplacas para determinar la absorbancia de los pozos.

3. ELISA competitivo

Los pasos de un ELISA competitivo son diferentes de los utilizados en ELISA indirecto y sándwich, siendo la principal diferencia el paso de unión competitivo entre el antígeno de muestra y el antígeno "add-in". El antígeno de la muestra se incuba con el anticuerpo primario sin etiquetar. Estos complejos de anticuerpos y antígenos se añaden a la placa ELISA, que ha sido pre-revestida con el mismo antígeno. Después de un período de incubación, cualquier anticuerpo no unido se lava. Existe una correlación inversa entre la cantidad de anticuerpos libres disponibles para unir el antígeno en el pozo y la cantidad de antígeno en la muestra original. Por ejemplo, una muestra con antígeno abundante tendría más complejos de anticuerpos antigen primarios, dejando poco anticuerpo sin ataduras para unirse a la placa ELISA. Luego se añade a los pozos un anticuerpo secundario conjugado en zimdo específico para el anticuerpo primario, seguido por el sustrato.

Antígeno de recubrimiento a la microplaca

1. Recubrir los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos con 100 ml de antígeno purificado a una concentración de 1-10 g/ml.
2. Cubra la placa con una cubierta adhesiva de la placa e incubar la placa durante la noche a 4oC.
3. Después de la incubación, retire la solución de antígeno sin ataduras de los pozos moviendo la placa sobre un fregadero.

Bloqueo

4. Bloquear los sitios de unión a proteínas restantes en los pozos recubiertos añadiendo 200 l de tampón de bloqueo a cada poca, que puede ser un 5% de leche seca no grasa o BSA en PBS.
5. Incubar la placa durante al menos 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC.

Muestra de incubación (antígeno) con el anticuerpo primario

6. Mientras bloquea los pozos, prepare la mezcla de antígeno-anticuerpo mezclando antígeno de muestra de 150 ml y 150 ml de anticuerpo primario para cada pocaen en el ensayo.
7. Incubar esta mezcla durante 1 h a 37oC.

Añadir mezcla antígeno-anticuerpo al pozo

8. Ahora, retire el búfer de bloqueo de los pozos moviendo la placa sobre un fregadero.
9. Luego, lave los pozos con 1X PBS que contenga Tween-20.
10. Añadir 100 l de la mezcla de anticuerpos primarios de antígeno de muestra.
11. Incubar la placa a 37oC durante 1 h.
12. Retire la mezcla de muestra moviendo la placa sobre un fregadero.
13. Luego, lave los pozos con 1X PBS que contenga 1% de Tween-20 para eliminar cualquier anticuerpo no unido.

Añadir el anticuerpo secundario

14. Añadir 100 l de un anticuerpo secundario conjugado enzimático, que en este caso es un anticuerpo conjugado AP, a cada poca.
15. Incubar la placa durante 1 h a 37oC.
16. Después de la incubación, lave la placa con 1X PBS que contenga 1% de Tween-20.

Detección

17. Añadir 100 l de la solución de sustrato a cada poca.
18. Espere 5-10 min.
19. Después de 10 min, detenga la reacción enzimática añadiendo ácido sulfúrico de 100 l 2N a los pozos. A continuación, mida la absorbancia en un lector de microplacas dentro de los 30 minutos de agregar la solución de parada