Ensayos ELISA: Indirecto, Sándwich y Competitivo

El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas, o ELISA, es un ensayo cuantitativo de alta sensibilidad que se usa comúnmente para medir la concentración de un analito como citocinas y anticuerpos en una muestra biológica. El principio general de este ensayo implica tres pasos: comenzando con la captura, o inmovilización, del analito objetivo en una microplaca, seguido de la detección del analito mediante proteínas de detección específicas del objetivo y, por último, la reacción enzimática, donde una enzima conjugada convierte su sustrato en un producto coloreado. Basado en diferentes métodos de captura y detección, ELISA puede ser de cuatro tipos: directo, indirecto, sándwich y competitivo.

En el ELISA directo, el antígeno diana se une primero a la placa y, a continuación, es detectado por un anticuerpo de detección específico. Este método se usa comúnmente para detectar anticuerpos para un antígeno específico. El ELISA indirecto se utiliza para detectar anticuerpos en una muestra con el fin de cuantificar las respuestas inmunitarias. La placa se recubre primero con un antígeno de captura específico, que inmoviliza el anticuerpo diana, y este complejo antígeno-anticuerpo se detecta utilizando un segundo anticuerpo.

En el caso del ELISA sándwich, el analito objetivo es un antígeno, que se captura en la placa utilizando un anticuerpo de captura y luego es detectado por el anticuerpo de detección, formando así un sándwich anticuerpo-antígeno-anticuerpo. Este método es útil para medir la concentración de un antígeno en una muestra mixta.

El ELISA competitivo se utiliza cuando solo hay un anticuerpo disponible para un antígeno diana de interés. La placa se recubre primero con el antígeno purificado. Mientras tanto, la muestra que contiene el antígeno se preincuba con el anticuerpo y luego se agrega a la placa, para permitir que las moléculas de anticuerpo libres se unan al antígeno inmovilizado. Cuanto mayor sea la señal de la placa, menor será la concentración de antígeno en la muestra. En los cuatro tipos de ELISA, directo, indirecto, sándwich y competitivo, el anticuerpo de detección se conjuga directamente con la enzima o se puede vincular indirectamente a ella a través de otro anticuerpo o proteína.

Las enzimas comúnmente utilizadas para la reacción son la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina con sus respectivos sustratos, ambas produciendo un producto soluble y coloreado que se puede medir y cuantificar utilizando un lector de placas. En este vídeo, observará cómo realizar ELISA indirecto, ELISA sándwich y ELISA competitivo, seguido de ejemplos de cuantificación del analito objetivo a partir de los métodos ELISA indirecto y sándwich.

El primer experimento demostrará cómo utilizar ELISA indirecto para determinar la presencia de anticuerpos contra el virus de la gripe en suero obtenido de ratones infectados con gripe.

Para comenzar, agregue 50 microlitros de antígeno purificado, en este caso, 2 miligramos por mililitro de virus de influenza A A/PR/8 purificado, a cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos. A continuación, cubra la placa con una cubierta adhesiva e incube durante la noche a 4 grados centígrados para permitir que el antígeno se una a la placa. Al día siguiente, retire la solución de recubrimiento moviendo el plato sobre un fregadero. A continuación, bloquee los sitios de unión a proteínas restantes en los pocillos recubiertos agregando 200 microlitros de un tampón de bloqueo (en este caso, suero de burro al 5% en 1X PBS) a cada pocillo. Deje incubar la placa durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el tampón de bloqueo y luego lave la placa agregando 200 microlitros de 1X PBS que contenga 1% de Tween-20. Pasa el plato sobre el fregadero una vez más para eliminar el lavado.

Luego, prepare las muestras de prueba agregando 460 microlitros de PBS a un tubo nuevo y luego agregue 40 microlitros de suero para hacer una dilución de 1 a 12.5. Luego, agregue 300 microlitros de PBS a un segundo tubo y luego agregue 100 microlitros de la primera dilución. Continúe este rango de dilución en serie hasta obtener una muestra final con una dilución de 1 a 204.800. Agregue las muestras de suero diluidas en serie por triplicado a los pocillos. Cubra la placa con una cubierta adhesiva e incube a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, retire las muestras moviendo la placa en el fregadero y luego lave la placa agregando 200 microlitros de 1X PBS que contenga 1% de Tween-20. Una vez más, agite la placa para eliminar el lavado.

Ahora, agregue 100 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado con enzimas, que en este experimento es una peroxidasa de rábano picante, o HRP, secundaria anti-ratón conjugada de burro, a cada pocillo. Incuba la placa durante una hora a temperatura ambiente y agita la placa para eliminar el exceso de líquido. Lave la placa con 1X PBS que contenga 1% de Tween-20 y luego aplique 100 microlitros del sustrato indicador a una concentración de un miligramo por mililitro en cada pocillo. Incubar la placa con el sustrato durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente. En este ejemplo, el sustrato incoloro de 3,3', 5,5' - tetrametilbencidina o TMB, se vuelve de color azul cuando HRP está presente. Después de 10 minutos, detenga la reacción enzimática agregando 100 microlitros de ácido sulfúrico 2N. Las muestras se volverán de color amarillo.

Dentro de los 30 minutos posteriores a la adición de la solución de parada, inserte la placa en un lector de microplacas y lea la placa a la longitud de onda adecuada para el sustrato para determinar la absorbancia de los pocillos.

Para comenzar el sándwich ELISA, la placa debe estar recubierta con un anticuerpo de captura purificado. Para hacer esto, agregue 100 microlitros del anticuerpo de captura a una concentración dentro del rango de 1 a 10 microgramos por mililitro, a cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos. A continuación, cubra la placa con una cubierta adhesiva para placas y luego incube la placa durante la noche a 4 grados centígrados. Después de la incubación, retire la solución de recubrimiento moviendo la placa sobre un fregadero.

Ahora, bloquee los sitios de unión a proteínas restantes en los pocillos recubiertos agregando 200 microlitros de leche en polvo descremada al 5% a los pocillos. Incubar la placa a temperatura ambiente durante al menos 2 horas. A continuación, retire el tampón de bloqueo y, a continuación, lave los pocillos con 1X PBS que contenga 1% de Tween-20. Retire el lavado moviendo la placa sobre el fregadero. Ahora, agregue 100 microlitros de la muestra de prueba a los pocillos, selle la placa con una cubierta adhesiva y luego incube a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la incubación, retire las muestras moviendo la placa sobre el fregadero y luego lave los pocillos con 200 microlitros de 1X PBS que contengan 1% de Tween-20. Pase el plato sobre el fregadero para eliminar el lavado y luego agregue 100 microlitros de anticuerpo de detección conjugado con enzimas a los pocillos.

Selle la placa con una cubierta adhesiva. Deje que la placa se incube a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la incubación, retire el anticuerpo de detección no unido moviendo la placa sobre un fregadero y lave los pocillos con 200 microlitros de 1X PBS que contengan 1% de Tween-20. A continuación, agregue 100 microlitros del sustrato indicador a una concentración de 1 miligramo por mililitro e incube la placa durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, detenga la reacción enzimática agregando 100 microlitros de ácido sulfúrico 2N a los pocillos y luego lea la placa dentro de los 30 minutos posteriores a la adición de la solución de parada en un lector de microplacas.

Para realizar un ELISA competitivo, primero recubra los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos con 100 microlitros de antígeno purificado a una concentración de 1-10 microgramos por mililitro. Cubra la placa con una cubierta adhesiva para placas y luego cocine durante la noche a 4 grados centígrados. Después de esto, retire la solución de antígeno no unida de los pocillos moviendo la placa sobre un fregadero.

A continuación, bloquee los sitios de unión a proteínas restantes en los pocillos recubiertos agregando 200 microlitros de tampón de bloqueo a cada pocillo: en este caso, leche en polvo descremada al 5% en PBS. Incubar la placa durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. Mientras bloquea los pocillos, prepare la mezcla de antígeno y anticuerpo en un 1. Tubo de 5 mililitros añadiendo 150 microlitros de antígeno de muestra a 150 microlitros de anticuerpo primario para cada pocillo del ensayo. Incubar esta mezcla durante 1 hora a 37 grados centígrados. Ahora, retire el tampón de bloqueo de los pozos moviendo el plato sobre un fregadero. A continuación, lavar los pocillos con 1X PBS que contenga Tween 20 y, a continuación, añadir 100 microlitros de la mezcla de antígeno y anticuerpo primario de la muestra.

Deje incubar la placa a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, retire la mezcla de muestra moviendo el plato sobre un fregadero y luego lave los pocillos con 1X PBS que contenga 1% de Tween-20 para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Agregue 100 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado con enzimas a cada pocillo e incube la placa durante una hora a 37 grados centígrados. A continuación, lave la placa con 1X PBS que contenga 1% de Tween-20 y luego agregue 100 microlitros de la solución de sustrato a cada pocillo. Espere de 5 a 10 minutos. Después de 10 minutos, detenga la reacción enzimática agregando 100 microlitros de ácido sulfúrico 2N y luego mida la absorbancia en un lector de microplacas dentro de los 30 minutos posteriores a la adición de la solución de parada.

Para el ensayo ELISA indirecto semicuantitativo, se determinó la presencia de anticuerpos contra el virus de la influenza A en muestras diluidas en serie de suero de ratones infectados con influenza A mediante la lectura de la absorbancia de cada pocillo a 405 nanómetros en un lector de placas. Estos datos brutos se exportan a una hoja de cálculo con fines de cálculo. En este experimento, las muestras de suero diluidas en serie, que van desde 1 - 12,5 hasta 1 - 204.800, se repitieron por triplicado.

Por lo tanto, para analizar los datos, se calcula el valor medio de absorbancia para cada conjunto de triplicados sumando todos los valores de cada dilución y dividiendo la suma por 3. Una vez que se determina la media de cada conjunto de triplicados, las lecturas medias de OD450 se trazan frente a las diluciones seriadas. Las lecturas de OD disminuyen a medida que el suero se diluye, lo que indica que se encuentran menos anticuerpos en las muestras más diluidas. En el ELISA sándwich cuantitativo, se añadieron diluciones de patrón conocido, en este caso TNFalfa humano recombinante, a una placa de 96 pocillos y se leyeron junto con las muestras desconocidas.

Para crear la curva estándar, se calculó el valor medio de absorbancia para cada conjunto de lecturas de las concentraciones conocidas. A continuación, se trazó el valor medio de absorbancia en el eje y, frente a las concentraciones de proteínas conocidas en el eje x. Se agrega una curva de mejor ajuste a través de los puntos del gráfico.

Una vez generada la curva estándar, la cantidad de proteína TNFalfa en la muestra de ensayo puede determinarse calculando primero el valor medio de absorbancia de la muestra de ensayo. En este ejemplo, las muestras de prueba dieron lecturas de OD450 de 0,636 y 0. 681. Si se suman estos valores y se divide la suma por 2, se obtiene un promedio de 0,659. Desde el eje Y en el gráfico de curva estándar, extienda una línea horizontal desde este valor de absorbancia hasta la curva estándar. En el punto de intersección, extienda una línea vertical hasta el eje x y lea la concentración correspondiente que, en esta muestra de prueba, corresponde a una concentración de TNFalfa de 38,72 picogramos por mililitro.