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Ensayos ELISA: Indirecto, Sándwich y Competitivo

ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

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Immunology

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ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

5.2: Magnetic Activated Cell Sorting (MACS): Isolation of Thymic T Lymphocytes

5.4: ELISPOT Assay: Detection of IFN-γ Secreting Splenocytes

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14:22 min

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April 30, 2023

Overview

Fuente: Whitney Swanson^1,2, Frances V. Sjaastad^2,3y Thomas S. Griffith^1,2,3,4
¹ Departamento de Urología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Centro de Inmunología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Programa de Posgrado en Microbiología, Inmunología y Biología del Cáncer, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Centro De Cáncer Masónico, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se utiliza con frecuencia para medir la presencia y/o concentración de un antígeno, anticuerpo, péptido, proteína, hormona u otra biomolécula en una muestra biológica. Es extremadamente sensible, capaz de detectar bajas concentraciones de antígenos. La sensibilidad de ELISA se atribuye a su capacidad para detectar las interacciones entre un único complejo antígeno-anticuerpo (1). Además, la inclusión de un anticuerpo específico de antígeno conjugado en enzimas permite la conversión de un sustrato incoloro en un producto cromogénico o fluorescente que puede ser detectado y fácilmente cuantificado por un lector de placas. En comparación con los valores generados por cantidades valoradas de un antígeno de interés conocido, se puede determinar la concentración del mismo antígeno en las muestras experimentales. Se han adaptado diferentes protocolos ELISA para medir las concentraciones de antígenos en una variedad de muestras experimentales, pero todos tienen el mismo concepto básico (2). La elección del tipo de ELISA para realizar, indirecta, sándwich o competitiva, depende de una serie de factores, incluyendo la complejidad de las muestras a probar y los anticuerpos específicos de antígeno disponibles para su uso. El ELISA indirecto se utiliza con frecuencia para determinar el resultado de una respuesta inmunológica, como la medición de la concentración de un anticuerpo en una muestra. El sándwich ELISA es el más adecuado para analizar muestras complejas, como sobrenatantes de cultivo de tejido o lysates de tejido, donde el analito, o antígeno de interés, es parte de una muestra mixta. Por último, el ELISA competitivo se utiliza con mayor frecuencia cuando sólo hay un anticuerpo disponible para detectar el antígeno de interés. Los ELISA competitivos también son útiles para detectar un pequeño antígeno con un solo epítopo de anticuerpos que no puede acomodar dos anticuerpos diferentes debido a la obstrucción estaica. El protocolo describirá los procedimientos básicos para los ensayos ELISA indirectos, sándwiches y competitivos.

El ensayo elSAY ELISA indirecto se utiliza comúnmente para medir la cantidad de anticuerpos en suero o en el sobrenadante de un cultivo de hibridato. El procedimiento general para el ensayo elAse indirecto el ISA es:

Capa de pozos con antígenos
Añadir sobrenadante de cultivo de suero o hibrioma que contenga anticuerpos (primarios o anticuerpos de 1o)
Incubar y lavar
Añadir anticuerpos secundarios (o 2o) conjugados enzimáticos
Incubar y lavar
Añadir sustrato

El ensayo el sándwich ELISA difiere del ensayo elISA indirecto en que el método no implica el recubrimiento de las placas con un antígeno purificado. En su lugar, se utiliza un anticuerpo “capturar” para recubrir los pocillos de la placa. El antígeno se “se intercala” entre el anticuerpo de captura y un segundo anticuerpo conjugado enzimático de “detección”, donde ambos anticuerpos son específicos para el mismo antígeno, pero en diferentes epítopos (3). Al unirse al complejo de anticuerpos/antígenos de captura, el anticuerpo de detección permanece en la placa. Los anticuerpos monoclonales o los antisueros policlonales se pueden utilizar como anticuerpos de captura y detección. La principal ventaja del sándwich ELISA es que la muestra no tiene que ser purificada antes del análisis. Además, el ensayo puede ser bastante sensible (4). Muchos kits ELISA disponibles comercialmente son de la variedad sándwich y utilizan pares de anticuerpos probados y emparejados. El procedimiento general para el ensayo ELISA sándwich es:

Pozos de abrigo con anticuerpo de captura
Añadir muestras de prueba que contengan antígeno
Incubar y lavar
Añadir anticuerpode detección conjugado enzimático.
Incubar y lavar
Añadir sustrato

La mayoría de los kits ELISA sándwiches disponibles comercialmente vienen con anticuerpos de detección conjugados enzimáticos. En los casos en que no se dispone de un anticuerpo de detección conjugado enzimático, se puede utilizar un anticuerpo secundario conjugado enzimático específico para el anticuerpo de detección. La enzima del anticuerpo secundario desempeña la misma función, que consiste en convertir el sustrato incoloro en un producto cromogénico o fluorescente. Al mencionado anticuerpo secundario conjugado enzimática le gustaría más ser utilizado en un sándwich “casero” ELISA desarrollado por un investigador que ha generado sus propios anticuerpos monoclonales, por ejemplo. Un inconveniente del uso de un anticuerpo secundario conjugado enzimático es asegurarse de que sólo se une al anticuerpo de detección, y no al anticuerpo de captura unido a la placa. Esto resultaría en un producto medible en todos los pozos, independientemente de la presencia o ausencia de antígeno o anticuerpo de detección.

Por último, el ensayo ELISA competitivo se utiliza para detectar antígenos solubles. Es fácil de realizar, pero sólo es adecuado cuando el antígeno purificado está disponible en una cantidad relativamente grande. El procedimiento general para el ensayo ELISA competitivo es:

Capa de pozos con antígeno
Incubar y lavar
Muestra de prueba de preincubación con anticuerpos primarios conjugados enzimáticos
Agregue la mezcla al pozo
Incubar y lavar cualquier anticuerpo primario conjugado en enzimas sin ataduras
Añadir sustrato

La “competencia” en este ensayo proviene del hecho de que más antígeno en la muestra de prueba utilizada en el paso 3 resultará en menos anticuerpos disponibles para unir se adhieren al antígeno que recubre el pozo. Por lo tanto, la intensidad del producto cromogénico/fluorogénico en el pozo al final del ensayo está inversamente relacionada con la cantidad de antígeno presente en la muestra de ensayo.

Un componente clave en cualquier tipo de ELISA son los estándares valorados de concentraciones conocidas que permitirán al usuario determinar la concentración de antígeno presente en las muestras de ensayo. Típicamente, una serie de pozos se designan para crear una curva estándar, donde las cantidades conocidas de una proteína recombinante purificada se agregan a los pozos en cantidades decrecientes. Cuando estos pozos se procesan al mismo tiempo que las muestras de prueba, el usuario puede tener un conjunto de referencia de valores de absorbancia obtenidos de un lector de microplacas para que las concentraciones de proteínas conocidas vayan junto con los valores de absorción para las muestras de prueba. A continuación, el usuario puede calcular una curva estándar a la que se pueden comparar las muestras de prueba para determinar la cantidad de proteína de interés presente. La curva estándar también puede determinar el grado de precisión de la fabricación de dilución del usuario.

Por último, el último paso en cada uno de los tipos ELISA enumerados anteriormente requiere la adición de un sustrato. El grado de conversión del sustrato al producto está directamente relacionado con la cantidad de enzima presente en el pozo. La peroxidasa de rábano picante (HRP) y la fosfatasa alcalina (AP) son las enzimas más comunes encontradas conjugadas con los anticuerpos. Como era de esperar, hay una serie de sustratos disponibles específicos para cualquiera de las enzimas que producen un producto cromogénico o fluorescente. Además, los sustratos están disponibles en una gama de sensibilidades que pueden aumentar la sensibilidad general del ensayo. El usuario también debe tener en cuenta el tipo de instrumentación disponible para leer la placa al final del experimento al recoger el tipo de sustrato a utilizar, junto con su correspondiente anticuerpo conjugado enzimático.

Los sustratos cromogénicos de uso común para HRP incluyen 2,2′-Azinobis [3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico]-sal de diamonio (ABTS) y 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB), mientras que p-fosfato de nitrofenilo (PNPP) se utiliza para AP. producir productos de reacción de color verde y azul solubles en agua, respectivamente. El producto verde ABTS tiene dos picos de absorbancia principales, 410 y 650 nm, mientras que el producto azul TMB se detecta mejor a 370 y 652 nm. Los colores de ABTS y TMB cambian a amarillo tras la adición de una solución de parada ácida, que se lee mejor a 450 nm. El desarrollo de color para ABTS es lento, mientras que es rápido para TMB. TMB es más sensible que ABTS, y puede producir una señal de fondo más alta si la reacción enzimática continúa demasiado tiempo. PNPP produce un producto amarillo soluble en agua después de la conversión de AP que absorbe la luz a 405 nm.

Procedure

1. ELISA indirecto

Un ELISA indirecto es aquel en el que el anticuerpo específico del antígeno primario es reconocido por un anticuerpo conjugado secundario. El siguiente protocolo es un ejemplo de un método ELISA indirecto, donde las muestras séricas de ratones infectados por el virus de la gripe A (IAV) se prueban para detectar la presencia de anticuerpos IgG específicos de IAV. Una fortaleza de este ejemplo es que se pueden utilizar diferentes anticuerpos secundarios que reconocen todos los isotipos de anticuerpos o isotipos específicos (por ejemplo, IgG).

Antígeno de recubrimiento a la microplaca

Recubrir los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos con antígeno purificado pipeteando 50 l de antígeno purificado (2 mg/ml del virus purificado De/PR/8 influenza A en un tampón Tris-HCl de 0,05M (pH 9,5)) en cada pocal de la placa.
Cubra la placa con una cubierta adhesiva e incubarla durante la noche a 4oC para permitir que el antígeno se adhiera a la placa.
Una vez completada la incubación, retire la solución de recubrimiento moviendo la placa sobre un fregadero.

Bloqueo

Bloquear los sitios de unión a proteínas restantes en los pozos recubiertos mediante la adición de tampón de bloqueo de 200 l, 5% suero de burro en 1X PBS se utiliza aquí, por pozo. Los reactivos de bloqueo alternativos incluyen un 5% de leche seca sin grasa o BSA en PBS o suero normal de un animal en el que se generó el anticuerpo secundario.
Incubar durante al menos 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC.
Después de la incubación, retire el tampón de bloqueo moviendo la placa y luego lave la placa con PBS que contenga 1% de Tween-20.

Incubación con el anticuerpo primario

Preparar una dilución en serie de la muestra sérica, que contiene el anticuerpo primario, para obtener un rango de dilución de 1 a 204.800, utilizando 1X PBS. Para ello, primero diluir el suero 1:12.5 y luego realizar una dilución 4X (rango de dilución – 1:12.5 a 1:204,800).
Añadir 100 l de las muestras de suero diluidas en serie a los pozos.
Placa de cubierta con tapa adhesiva e incubar a temperatura ambiente durante 1-2 h.
Después de la incubación, mueva la placa sobre un fregadero y lave la placa con PBS que contenga 1% de Tween-20.

Incubación con el anticuerpo secundario

Añadir 100 l de un anticuerpo secundario conjugado en zimdulación, peroxidasa de rábano picante, anti-ratón conjugado con HRP secundario en este experimento, a cada pocto.
Incubar la placa durante 1 hora a temperatura ambiente.
Después de la incubación, mueva la placa sobre un fregadero y luego lave la placa con PBS que contenga 1% de Tween-20.

Detección

Añadir 100 l del sustrato del indicador (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB)) a una concentración de 1 mg/ml a cada pocal.
Incubar la placa con el sustrato durante 5-10 min a temperatura ambiente.
Después de 10 min, detenga la reacción enzimática añadiendo ácido sulfúrico de 100 l 2N (H₂SO₄).
Dentro de 30 minutos de la adición de la solución de parada, lea la placa utilizando un lector de microplacas a 405 nm para determinar la absorbancia de los pozos.

2. Sandwich ELISA

En esta versión DE ELISA, la muestra experimental se “se intercala” entre un anticuerpo de captura no conjugado y un anticuerpo de detección conjugado, ambos específicos de la misma proteína pero en diferentes epítopos. En el siguiente ejemplo de ELISA sándwich, la concentración de TNF humano se determinó en una muestra desconocida utilizando una curva estándar generada a partir de una dilución en serie 2.5X de un TNF humano recombinante estándar conocido (indicando a una concentración de 75 pg/ml).

Recubrimiento captura de anticuerpos en la microplaca

Recubrir los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos con anticuerpo de captura purificado añadiendo 100 s de anticuerpo de captura (rango de 1-10 g/ml) a cada pocil de la placa.
Cubra la placa con una cubierta adhesiva de la placa e incubarla durante la noche a 4oC.
Después de la incubación, retire la solución de recubrimiento de la placa moviendo la placa sobre un fregadero.

Bloqueo

Bloquear los sitios de unión a proteínas restantes en los pozos recubiertos de anticuerpos añadiendo una solución de bloqueo de 200 ol, un 5% de leche seca sin grasa que contenga PBS, a los pozos.
Incubar durante al menos 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC.
Después de la incubación, retire el tampón de bloqueo moviendo la placa y luego lave la placa con PBS que contenga 1% de Tween-20.

Añadir antígeno que contenga muestras de prueba

Añadir 100 l de la muestra de prueba a los pozos. Selle la placa con una cubierta adhesiva.
Incubar durante 1-2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC.
Después de la incubación, retire las muestras moviendo la placa sobre el fregadero y luego lave los pozos con 200 S 1X PBS que contengan 1% De entre 20.

Añadir anticuerpo de detección conjugado enzimático

Añadir 100 l de anticuerpo de detección conjugado enzimático a los pozos a una concentración preoptimizada.
Sellar la placa con una cubierta adhesiva e incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
Retire el anticuerpo de detección sin ataduras moviendo la placa sobre un fregadero y lave los pozos con 200 s 1X PBS que contengan 1% de Tween-20.

Detección

Añadir 100 l del sustrato del indicador a una concentración de 1 mg/ml. Cualquier anticuerpo de detección conjugado enzimático unido convertirá el sustrato en una señal detectable.
Incubar la placa durante 5-10 min a temperatura ambiente.
Después de 5-10 min, detenga la reacción enzimática añadiendo 100 s 2N H₂SO₄ a los pozos. Dentro de los 30 minutos de la adición de la solución de parada, lea la placa utilizando un lector de microplacas para determinar la absorbancia de los pozos.

3. ELISA competitivo

Los pasos de un ELISA competitivo son diferentes de los utilizados en ELISA indirecto y sándwich, siendo la principal diferencia el paso de unión competitivo entre el antígeno de muestra y el antígeno “add-in”. El antígeno de la muestra se incuba con el anticuerpo primario sin etiquetar. Estos complejos de anticuerpos y antígenos se añaden a la placa ELISA, que ha sido pre-revestida con el mismo antígeno. Después de un período de incubación, cualquier anticuerpo no unido se lava. Existe una correlación inversa entre la cantidad de anticuerpos libres disponibles para unir el antígeno en el pozo y la cantidad de antígeno en la muestra original. Por ejemplo, una muestra con antígeno abundante tendría más complejos de anticuerpos antigen primarios, dejando poco anticuerpo sin ataduras para unirse a la placa ELISA. Luego se añade a los pozos un anticuerpo secundario conjugado en zimdo específico para el anticuerpo primario, seguido por el sustrato.

Antígeno de recubrimiento a la microplaca

Recubrir los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos con 100 ml de antígeno purificado a una concentración de 1-10 g/ml.
Cubra la placa con una cubierta adhesiva de la placa e incubar la placa durante la noche a 4oC.
Después de la incubación, retire la solución de antígeno sin ataduras de los pozos moviendo la placa sobre un fregadero.

Bloqueo

Bloquear los sitios de unión a proteínas restantes en los pozos recubiertos añadiendo 200 l de tampón de bloqueo a cada poca, que puede ser un 5% de leche seca no grasa o BSA en PBS.
Incubar la placa durante al menos 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC.

Muestra de incubación (antígeno) con el anticuerpo primario

Mientras bloquea los pozos, prepare la mezcla de antígeno-anticuerpo mezclando antígeno de muestra de 150 ml y 150 ml de anticuerpo primario para cada pocaen en el ensayo.
Incubar esta mezcla durante 1 h a 37oC.

Añadir mezcla antígeno-anticuerpo al pozo

Ahora, retire el búfer de bloqueo de los pozos moviendo la placa sobre un fregadero.
Luego, lave los pozos con 1X PBS que contenga Tween-20.
Añadir 100 l de la mezcla de anticuerpos primarios de antígeno de muestra.
Incubar la placa a 37oC durante 1 h.
Retire la mezcla de muestra moviendo la placa sobre un fregadero.
Luego, lave los pozos con 1X PBS que contenga 1% de Tween-20 para eliminar cualquier anticuerpo no unido.

Añadir el anticuerpo secundario

Añadir 100 l de un anticuerpo secundario conjugado enzimático, que en este caso es un anticuerpo conjugado AP, a cada poca.
Incubar la placa durante 1 h a 37oC.
Después de la incubación, lave la placa con 1X PBS que contenga 1% de Tween-20.

Detección

Añadir 100 l de la solución de sustrato a cada poca.
Espere 5-10 min.
Después de 10 min, detenga la reacción enzimática añadiendo ácido sulfúrico de 100 l 2N a los pozos. A continuación, mida la absorbancia en un lector de microplacas dentro de los 30 minutos de agregar la solución de parada

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, o ELISA es un ensayo cuantitativo altamente sensible comúnmente utilizado para medir la concentración de un analito como citoquinas y anticuerpos en una muestra biológica. El principio general de este ensayo implica tres pasos: a partir de la captura, o inmovilización, del analito objetivo en una microplaca, seguido de la detección del analito por proteínas de detección específicas de la diana, y por último, la reacción enzimática, donde un enzima conjugada convierte su sustrato en un producto de color. Basado en diferentes métodos de captura y detección, ELISA puede ser de cuatro tipos: directo, indirecto, sándwich y competitivo.

Para ELISA directo, el antígeno objetivo se une primero a la placa y, a continuación, es detectado por un anticuerpo de detección específico. Este método se utiliza comúnmente para detectar anticuerpos para un antígeno específico. El ELISA indirecto se utiliza para detectar anticuerpos en una muestra con el fin de cuantificar las respuestas inmunitarias. La placa se recubre primero con un antígeno de captura específico, que inmoviliza el anticuerpo objetivo, y este complejo antígeno-anticuerpo se detecta utilizando un segundo anticuerpo.

En el caso del sándwich ELISA, el analito objetivo es un antígeno, que se captura en la placa utilizando un anticuerpo de captura y luego se detecta por el anticuerpo de detección, por lo tanto, formando un sándwich de anticuerpos anticuerpos. Este método es útil para medir la concentración de un antígeno en una muestra mixta.

ElISA competitivo se utiliza cuando solo hay un anticuerpo disponible para un antígeno objetivo de interés. La placa se recubre primero con el antígeno purificado. Mientras tanto, la muestra que contiene el antígeno se preincuba con el anticuerpo y luego se añade a la placa, para permitir que cualquier molécula de anticuerpo libre se una al antígeno inmovilizado. Cuanto mayor sea la señal de la placa, menor será la concentración de antígeno en la muestra. En los cuatro tipos de ELISA, directo, indirecto, sándwich y competitivo, el anticuerpo de detección se conjuga directamente con la enzima o puede estar indirectamente vinculado a ella a través de otro anticuerpo o proteína.

Las enzimas comúnmente utilizadas para la reacción son la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina con sus respectivos sustratos, ambos produciendo un producto soluble y coloreado que se puede medir y cuantificar utilizando un lector de placas. En este vídeo, observará cómo realizar ELISA indirecto, ELISA sándwich y ELISA competitivo, seguido de ejemplos de cuantificación del analito objetivo a partir de los métodos ELISA indirectos y sándwiches.

El primer experimento demostrará cómo utilizar ELISA indirecto para determinar la presencia de anticuerpos contra el virus de la gripe en suero obtenido de ratones infectados por la gripe.

Para empezar, añadir 50 microlitros de antígeno purificado – en este caso, 2 miligramos por mililitro de virus purificado A/PR/8 gripe A- a cada pozo de una placa ELISA de 96 pocillos. A continuación, cubra la placa con una cubierta adhesiva e incubarla durante la noche a 4 grados centígrados para permitir que el antígeno se adhiera a la placa. Al día siguiente, retire la solución de recubrimiento moviendo la placa sobre un fregadero. A continuación, bloquee los sitios restantes de unión a proteínas en los pozos recubiertos añadiendo 200 microlitros de un buffer de bloqueo- aquí, 5% suero de burro en 1X PBS- a cada pocto. Deje que la placa se incuba durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el tampón de bloqueo y luego lave la placa agregando 200 microlitros de 1X PBS que contengan 1% de Tween-20. Deslice el plato sobre el fregadero una vez más para quitar el lavado.

Luego, prepare las muestras de prueba agregando 460 microlitros de PBS a un tubo nuevo, y luego agregando 40 microlitros de suero para hacer una dilución de 1 a 12.5. Luego, agregue 300 microlitros de PBS a un segundo tubo, y luego agregue 100 microlitros de la primera dilución. Continúe este rango de dilución en serie hasta obtener una muestra final con una dilución de 1 a 204.800. Agregue las muestras de suero diluidas en serie en triplicado a los pozos. Cubra la placa con una cubierta adhesiva e incubar a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, retire las muestras moviendo la placa en el fregadero y luego lave la placa añadiendo 200 microlitros de 1X PBS que contengan 1% de Tween-20. Una vez más, deslice el plato para quitar el lavado.

Ahora, agregue 100 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado en enzimas, que en este experimento es una peroxidasa de rábano picante, o HRP, conjugada burro anti-ratón secundario, a cada pozo. Incubar la placa durante una hora a temperatura ambiente, y mueva la placa para eliminar cualquier exceso de líquido. Lavar la placa con 1X PBS que contiene 1% de Tween-20 y luego aplicar 100 microlitros del sustrato indicador a una concentración de un miligramo por mililitro a cada pocto. Incubar la placa con el sustrato durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente. En este ejemplo, el incoloro 3,3′, 5,5′ – tetrametilbenzidina, o TMB, sustrato se convierte en un color azul cuando HRP está presente. Después de 10 minutos, detener la reacción enzimática añadiendo 100 microlitros de ácido sulfúrico 2N. Las muestras se tornarán de color amarillo.

Dentro de los 30 minutos de la adición de la solución de parada, inserte la placa en un lector de microplacas y lea la placa en la longitud de onda adecuada para el sustrato para determinar la absorbancia de los pocillos.

Para comenzar el sándwich ELISA, la placa debe estar recubierta con anticuerpo de captura purificado. Para ello, añadir 100 microlitros del anticuerpo de captura a una concentración dentro del rango de 1-10 microgramos por mililitro, a cada pozo de una placa ELISA de 96 pocillos. A continuación, cubra la placa con una cubierta adhesiva de la placa y luego incubar la placa durante la noche a 4 grados centígrados. Después de la incubación, retire la solución de recubrimiento moviendo la placa sobre un fregadero.

Ahora, bloquee los sitios restantes de unión a proteínas en los pozos recubiertos añadiendo 200 microlitros de leche seca sin grasa al 5% de leche seca sin grasa a los pozos. Incubar la placa a temperatura ambiente durante al menos 2 horas. A continuación, retire el búfer de bloqueo y, a continuación, lave los pozos con 1X PBS que contiene 1% Tween-20. Retire el lavado moviendo la placa sobre el fregadero. Ahora, agregue 100 microlitros de la muestra de prueba a los pozos, selle la placa con una cubierta adhesiva y luego incubarla a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la incubación, retire las muestras moviendo la placa sobre el fregadero y luego lave los pozos con 200 microlitros de 1X PBS que contienen 1% de Tween-20. Deslice la placa sobre el fregadero para eliminar el lavado y luego agregue 100 microlitros de anticuerpos de detección conjugados enzimáticos a los pozos.

Selle la placa con una cubierta adhesiva. Deje que el plato se incuba a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la incubación, retire el anticuerpo de detección sin ataduras moviendo la placa sobre un fregadero y lave los pozos con 200 microlitros de 1X PBS que contengan 1% de Tween-20. A continuación, añadir 100 microlitros del sustrato indicador a una concentración de 1 miligramo por mililitro, e incubar la placa durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, detenga la reacción enzimática añadiendo 100 microlitros de ácido sulfúrico 2N a los pozos y luego lea la placa dentro de los 30 minutos de agregar la solución de parada en un lector de microplacas.

Para realizar un ELISA competitivo, primero cubra los pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos con 100 microlitros de antígeno purificado a una concentración de 1-10 microgramos por mililitro. Cubra la placa con una cubierta adhesiva de la placa y luego incubar durante la noche a 4 grados centígrados. Después de esto, retire la solución de antígeno sin ataduras de los pozos moviendo la placa sobre un fregadero.

A continuación, bloquee los sitios restantes de unión a proteínas en los pozos recubiertos añadiendo 200 microlitros de tampón de bloqueo a cada pocal, aquí, 5% de leche seca sin grasa en PBS. Incubar la placa durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. Mientras bloquea los pozos, prepare la mezcla de antígeno-anticuerpo en un 1. Tubo de 5 mililitros añadiendo 150 microlitros de antígeno de muestra a 150 microlitros de anticuerpos primarios para cada pozo en el ensayo. Incubar esta mezcla durante 1 hora a 37 grados centígrados. Ahora, retire el búfer de bloqueo de los pozos moviendo la placa sobre un fregadero. A continuación, lave los pozos con 1X PBS que contenga Tween 20 y luego agregue 100 microlitros de la mezcla de anticuerpos primarios de antígeno de muestra.

Deje que la placa se incuba a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, retire la mezcla de muestra moviendo la placa sobre un fregadero y luego lave los pozos con 1X PBS que contiene 1% de Tween-20 para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Añadir 100 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado en zimgidos a cada pocato e incubar la placa durante una hora a 37 grados centígrados. Después de esto, lave la placa con 1X PBS que contenga 1% de Tween-20 y luego agregue 100 microlitros de la solución de sustrato a cada poca. Espere 5-10 minutos. Después de 10 minutos, detenga la reacción enzimática añadiendo 100 microlitros de ácido sulfúrico 2N y luego mida la absorbancia en un lector de microplacas dentro de los 30 minutos de agregar la solución de parada.

Para el ensayo el ELISA indirecto semicuantitativo, la presencia de anticuerpos del virus de la gripe A en muestras de suero diluidas en serie de suero de ratones infectados por la gripe A se determinó leyendo la absorbancia de cada pocil a 405 nanómetros en un lector de placas. Estos datos sin procesar se exportan a una hoja de cálculo con fines de cálculo. En este experimento, las muestras de suero diluidas en serie, que van de 1 – 12,5, a 1 – 204.800, se repitieron por triplicado.

Para analizar los datos, el valor medio de absorbancia se calcula para cada conjunto de triplicados añadiendo todos los valores para cada dilución y dividiendo la suma por 3. Una vez que se determina la media para cada conjunto de triplicados, las lecturas medias de OD450 se trazan contra las diluciones en serie. Las lecturas de La DO disminuyen a medida que el suero se diluye, lo que indica que se encuentran menos anticuerpos en las muestras más diluidas. En el sándwich cuantitativo ELISA, las diluciones de estándar conocido, en este caso recombinate TNFalpha humano, se añadieron a una placa de 96 pocillos y se leyeron junto con las muestras desconocidas.

Para crear la curva estándar, se calculó el valor medio de absorbancia para cada conjunto de lecturas de las concentraciones conocidas. A continuación, el valor medio de absorbancia se trazaba en el eje Y, frente a las concentraciones de proteína conocidas en el eje X. Se añade una curva de mejor ajuste a través de los puntos del gráfico.

Una vez generada la curva estándar, la cantidad de proteína TNFalpha en la muestra de prueba se puede determinar calculando primero el valor medio de absorbancia para la muestra de prueba. En este ejemplo, las muestras de prueba dieron a OD450 lecturas de 0.636 y 0. 681. Añadir estos valores y dividir la suma por 2 da un promedio de 0,659. Desde el eje Y del gráfico de curva estándar, extienda una línea horizontal desde este valor de absorbancia hasta la curva estándar. En el punto de intersección, extienda una línea vertical al eje X y lea la concentración correspondiente que, en esta muestra de ensayo, corresponde a una concentración de TNFalpha de 38,72 picogramos por mililitro.

Results

En el siguiente ejemplo de ELISA indirecto, se determinó la presencia de IgG específico del virus de la gripe A (IAV) en el suero de ratones infectados por el IAV. Los ratones C57Bl/6 fueron infectados con el virus de la gripe A (A/PR/8; 10⁵ PFU en 100 l de PBS i.p.) y el suero se recogió 28 días después. Para cuantificar la cantidad de IgG específica de la IAV en el suero, las placas ELISA de 96 pocillos se recubriron con el virus purificado A/PR/8 de la gripe A (50 l/bien de 2 mg/ml de virus PBS) durante la noche a 4 oC. Las placas recubiertas se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con un 5% de suero de burro normal en PBS, seguido de la incubación con muestras de suero diluidas de ratones con problemas de IAV durante la noche a 4oC. El suero se diluyó inicialmente 1:12.5, seguido de diluciones 1:4 (rango de dilución – 1:12.5 a 1:204,800). Después del lavado, las placas fueron incubadas con un igG anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina (AP) durante 1 h. Las placas se lavaron, y luego se añadió p-Fosfato de nitrofenilo (PNPP; 1 mg/ml, 100 l/bien). La solución PNPP incolora se convierte en un color amarillo cuando AP está presente. Después de 5-10 min, la reacción enzimática se detuvo añadiendo 100 l/bien 2N H₂SO₄. La placa se leyó en un lector de microplacas a 405 nm. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1 y la Figura 1.

Muestra	Pozos	OD₄₀₅	Decir
Suero 1:12.5	A1	2.163	2.194
	B1	2.214
	C1	2.204
Suero 1:50	A1	1.712	1.894
	B1	2.345
	C1	1.624
Suero 1:200	A1	1.437	1.541
	B1	1.73
	C1	1.456
Suero 1:800	A1	1.036	0.957
	B1	0.912
	C1	0.923
Suero 1:3200	A1	0.579	0.48
	B1	0.431
	C1	0.429
Suero 1:12800	A1	0.296	0.281
	B1	0.312
	C1	0.236
Suero 1:51200	A1	0.308	0.283
	B1	0.299
	C1	0.243
Suero 1:204800	A1	0.315	0.303
	B1	0.298
	C1	0.297

Tabla 1: Datos indirectos del ensayo ELISA. Diluciones séricas (de 1:12.5 a 1:204.800), de ratones infectados por el virus de la gripe A (IAV) que contienen IgG específico según el IAV, valores de densidad óptica (OD) (405 nm) y valores medios de OD_405.

Figura 1: Gráfica indirecta de dispersión del ensayo ELISA de valores medios de OD₄₀₅ (+ S. D.) y diluciones séricas (de 1:12.5 a 1:204.800), de IgG específica del virus de la gripe A (IAV) en el suero de ratones infectados por el IAV. Los valores de OD₄₀₅ pueden correlacionarse inversamente con las diluciones séricas.

En el siguiente ejemplo de un sándwich ELISA, se añadió a los pozos indicados una dilución 1:2.5 de las normas de TNF humanas recombinantes (a partir de una concentración de 75 pg/ml) a los pozos indicados de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Estas normas dieron lugar a un cambio correspondiente de 2,5 veces en las lecturas de absorbancia.

Muestra	Concentración (pg/mL)	Pozos	Valores	Valor medio	Cálculo de la concentración posterior	Promedio
Estándar 1	75	A1	1.187	1.169	76.376	75.01
		A2	1.152		73.644
Estándar 2	30	B1	0.534	0.52	30.827	29.962
		B2	0.506		29.098
Estándar 3	12	C1	0.23	0.217	12.838	12.105
		C2	0.204		11.372
Estándar 4	4.8	D1	0.09	0.084	5.055	4.726
		D2	0.078		4.398
Estándar 5	1.92	E1	0.033	0.031	1.941	1.86
		E2	0.03		1.778
Estándar 6	0.768	F1	0.009	0.011	0.626	0.764
		F2	0.014		0.901
Estándar 7	0.307	G1	0.002	0.004	0.238	0.377
		G2	0.007		0.516

Tabla 2: Datos de curva estándar el ELISA del sándwich TNF. Una dilución de 1:2.5 de las normas de TNF humanas recombinantes (75 a 0,3 pg/ml), valores de Do (450 nm), valores medios de₄₅₀ OD, cálculos de concentración posterior y sus promedios.

Figura 2: Curva estándar para el sándwich TNF ELISA. Se analizó una dilución de 1:2.5 de las normas de TNF humanas recombinantes (75 a 0,3 pg/ml) utilizando el sándwich ELISA. Los valores de OD₄₅₀ se pueden correlacionar directamente con las concentraciones de dilución estándar. La cantidad de proteína TNF en la muestra de ensayo se determinó utilizando la curva estándar, que corresponde a una concentración de 38,72 pg/ml.

Una vez generada la curva estándar, se determinó la cantidad de proteína TNF en la muestra de prueba. En este ejemplo de el sándwich ELISA, las muestras de prueba dieron₄₅₀ lecturas de OD de 0,636 y 0,681, que dan un promedio de 0,6585. Al trazar esta lectura OD450 en el gráfico anterior, esto corresponde a una concentración de TNF de 38,72 pg/ml.

Applications and Summary

Como se ha demostrado, una gama de inmunoensayos (con ligera variación en los protocolos) se enmarcan dentro de la familia técnica ELISA. Determinar qué versión de ELISA utilizar depende de una serie de factores, incluyendo qué antígeno se está detectando, el anticuerpo monoclonal disponible para un antígeno en particular y la sensibilidad deseada del ensayo (5). Algunas fortalezas y debilidades de las diferentes ELISA descritas en este documento son:

Elisa	Fortalezas	Debilidades
Indirecta	1) Alta sensibilidad debido al hecho de que múltiples anticuerpos secundarios conjugados en enzimas pueden unirse al anticuerpo primario	1) La señal de fondo alta puede ocurrir porque el recubrimiento del antígeno de interés a la placa no es específico (es decir, todas las proteínas de la muestra recubrirán la placa)
	2) Muchos anticuerpos primarios diferentes pueden ser reconocidos por un único anticuerpo secundario conjugado en enzimas que da al usuario la flexibilidad de usar el mismo anticuerpo secundario conjugado en enzimas en muchos ELISA diferentes (independientemente del antígeno que se detecte)
	3) La mejor opción cuando sólo un solo anticuerpo para el antígeno de interés está disponible
Sándwich	1) El uso de anticuerpos monoclonales de captura y detección específicos de antígenos aumenta la sensibilidad y especificidad del ensayo (en comparación con el ELISA indirecto)	1) Optimizar las concentraciones de los anticuerpos monoclonales de captura y detección puede ser difícil (especialmente para kits no comerciales)
	2) La mejor opción para detectar una proteína grande con múltiples epítopos (como una citoquina)
Competitivo	1) Se pueden utilizar muestras impuras	1) Requiere una gran cantidad de antígeno altamente puro para ser utilizado para recubrir la placa
	2) Menos sensibilidad a los efectos de dilución de reactivos
	3) Ideal para detectar moléculas pequeñas (como un hapten)

Tabla 3: Resumen. Un resumen de las fortalezas y debilidades de las diferentes técnicas elISA.

Si bien es una técnica simple y útil, también hay algunos inconvenientes para cualquier ELISA. Una es la incertidumbre de la cantidad de la proteína de interés en las muestras de prueba. Si la cantidad es demasiado alta o demasiado baja, los valores de absorbancia obtenidos por el lector de microplacas pueden caer por encima o por debajo de los límites de la curva estándar, respectivamente. Esto hará que sea difícil determinar con precisión la cantidad de proteína presente en las muestras de prueba. Si los valores son demasiado altos, la muestra de prueba se puede diluir antes de añadir a los pozos de la placa. Los valores finales tendrían que ajustarse de acuerdo con el factor de dilución. Como se mencionó, los kits caseros a menudo requieren una optimización cuidadosa de las concentraciones de anticuerpos utilizados para producir una alta relación señal-ruido.

References

Porstmann, T. and Kiessig S.T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
Suleyman Aydin. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides, 72, 4-15 (2015).
Gan. S. D. and Patel K. R. Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Investigative Dermatology, 133 (9), 1-3 (2013).
Kohl, T. O. and Ascoli C.A. Immunometric Antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Cold Spring Harbor Protocols, 1 (6), (2017).
Sakamoto, S., Putalun, W., Vimolmangkang, S., Phoolcharoen, W., Shoyama, Y., Tanaka, H., and Morimoto S. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of natural medicines, 72 (1), 32-42 (2018).

Transcript

Enzyme-linked Immunosorbent Assay, or ELISA is a highly sensitive quantitative assay commonly used to measure the concentration of an analyte like cytokines and antibodies in a biological sample. The general principle of this assay involves three steps: starting with capture, or immobilization, of the target analyte on a micro plate, followed by the detection of the analyte by target-specific detection proteins, and lastly, enzyme reaction, where a conjugated enzyme converts its substrate to a colored product. Based on different methods of capture and detection, ELISA can be of four types: direct, indirect, sandwich, and competitive.

For direct ELISA, the target antigen is first bound to the plate, and is then detected by a specific detection antibody. This method is commonly used for screening antibodies for a specific antigen. Indirect ELISA is used for detecting antibodies in a sample in order to quantify immune responses. The plate is first coated with a specific capture antigen, which immobilizes the target antibody, and this antigen-antibody complex is then detected using a second antibody.

In the case of sandwich ELISA, the target analyte is an antigen, which is captured on the plate using a capture antibody and then detected by the detection antibody, hence forming an antibody-antigen-antibody sandwich. This method is useful for measuring the concentration of an antigen in a mixed sample.

Competitive ELISA is used when only one antibody is available for a target antigen of interest. The plate is first coated with the purified antigen. Meanwhile, the sample containing the antigen is pre-incubated with the antibody and then added to the plate, to allow any free antibody molecules to bind to the immobilized antigen. The higher the signal from the plate, the lower the antigen concentration in the sample. In all of the four types of ELISA, direct, indirect, sandwich, and competitive, the detection antibody is either directly conjugated to the enzyme or can be indirectly linked to it through another antibody or protein.

The enzymes commonly used for the reaction are horseradish peroxidase or alkaline phosphatase with their respective substrates, both producing a soluble, colored product that can be measured and quantified using a plate reader. In this video, you will observe how to perform indirect ELISA, sandwich ELISA, and competitive ELISA, followed by examples of quantification of the target analyte from the indirect and sandwich ELISA methods.

The first experiment will demonstrate how to use indirect ELISA to determine the presence of anti-influenza virus antibodies in serum obtained from influenza-infected mice.

To begin, add 50 microliters of purified antigen – in this case, 2 milligrams per milliliter of purified A/PR/8 Influenza A virus- to each well of a 96-well ELISA plate. Next, cover the plate with an adhesive cover and incubate it overnight at 4 degrees celsius to allow the antigen to bind to the plate. The following day, remove the coating solution by flicking the plate over a sink. Next, block the remaining protein-binding sites in the coated wells by adding 200 microliters of a blocking buffer- here, 5% donkey serum in 1X PBS- to each well. Leave the plate to incubate for at least 2 hours at room temperature. Following the incubation, remove the blocking buffer and then wash the plate by adding 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Flick the plate over the sink once more to remove the wash.

Then, prepare the test samples by adding 460 microliters of PBS to a fresh tube, and then adding 40 microliters of serum to make a 1 to 12.5 dilution. Then, add 300 microliters of PBS to a second tube, and then add 100 microliters of the first dilution. Continue this serial dilution range until obtaining a final sample with a dilution of 1 to 204,800. Add the serially diluted serum samples in triplicate to the wells. Cover the plate with an adhesive cover and incubate at room temperature for an hour. Next, remove the samples by flicking the plate into the sink and then wash the plate by adding 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Once again, flick the plate to remove the wash.

Now, add 100 microliters of an enzyme-conjugated secondary antibody, which in this experiment is a horseradish peroxidase, or HRP, conjugated donkey anti-mouse secondary, to each well. Incubate the plate for one hour at room temperature, and flick the plate to remove any excess liquid. Wash the plate with 1X PBS containing 1% Tween-20 and then apply 100 microliters of the indicator substrate at a concentration of one milligram per milliliter to each well. Incubate the plate with the substrate for 5 to 10 minutes at room temperature. In this example, the colorless 3,3′, 5,5′ – tetramethylbenzidine, or TMB, substrate turns a blue color when HRP is present. After 10 minutes, stop the enzymatic reaction by adding 100 microliters of 2N sulfuric acid. The samples will turn a yellow color.

Within 30 minutes of adding the stop solution, insert the plate into a microplate reader and read the plate at the appropriate wavelength for the substrate to determine the absorbance of the wells.

To begin the sandwich ELISA, the plate must be coated with purified capture antibody. To do this, add 100 microliters of the capture antibody at a concentration within the 1-10 microgram per milliliter range, to each well of a 96-well ELISA plate. Next, cover the plate with an adhesive plate cover and then incubate the plate overnight at 4 degrees celsius. After the incubation, remove the coating solution by flicking the plate over a sink.

Now, block the remaining protein- binding sites in the coated wells by adding 200 microliters of 5% nonfat dry milk to the wells. Incubate the plate at room temperature for at least 2 hours. Next, remove the blocking buffer, and then wash the wells with 1X PBS containing 1% Tween-20. Remove the wash by flicking the plate over the sink. Now, add 100 microliters of the test sample to the wells, seal the plate with an adhesive cover, and then incubate it at room temperature for 2 hours. After incubation, remove the samples by flicking the plate over the sink and then wash the wells with 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Flick the plate over the sink to remove the wash and then add 100 microliters of enzyme-conjugated detection antibody to the wells.

Seal the plate with an adhesive cover. Leave the plate to incubate at room temperature for 2 hours. After the incubation, remove the unbound detection antibody by flicking the plate over a sink and wash the wells with 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Next, add 100 microliters of the indicator substrate at a concentration of 1 milligram per milliliter, and incubate the plate for 5 to 10 minutes at room temperature. After 10 minutes, stop the enzymatic reaction by adding 100 microliters of 2N sulfuric acid to the wells and then read the plate within 30 minutes of adding the stop solution in a microplate reader.

To perform a competitive ELISA, first coat the wells of a 96-well ELISA plate with 100 microliters of purified antigen at a concentration of 1-10 micrograms per milliliter. Cover the plate with an adhesive plate cover and then incubate overnight at 4 degrees celsius. Following this, remove the unbound antigen solution from the wells by flicking the plate over a sink.

Next, block the remaining protein-binding sites in the coated wells by adding 200 microliters of blocking buffer to each well- here, 5% nonfat dry milk in PBS. Incubate the plate for at least 2 hours at room temperature. While blocking the wells, prepare the antigen-antibody mixture in a 1. 5 milliliter tube by adding 150 microliters of sample antigen to 150 microliters of primary antibody for each well in the assay. Incubate this mixture for 1 hour at 37 degrees celsius. Now, remove the blocking buffer from the wells by flicking the plate over a sink. Then, wash the wells with 1X PBS containing Tween 20 and then add 100 microliters of the sample antigen- primary antibody mixture.

Leave the plate to incubate at 37 degrees celsius for one hour. Next, remove the sample mixture by flicking the plate over a sink and then wash the wells with 1X PBS containing 1% Tween-20 to remove any unbound antibody. Add 100 microliters of an enzyme-conjugated secondary antibody to each well and incubate the plate for one hour at 37 degrees celsius. Following this, wash the plate with 1X PBS containing 1% Tween-20 and then add 100 microliters of the substrate solution to each well. Wait for 5-10 minutes. After 10 minutes, stop the enzymatic reaction by adding 100 microliters of 2N sulfuric acid and then measure the absorbance in a microplate reader within 30 minutes of adding the stop solution.

For the semi-quantitative indirect ELISA assay, the presence of influenza A virus antibodies in serially diluted samples of serum from influenza A- infected mice was determined by reading the absorbance of each well at 405 nanometers in a plate reader. This raw data is exported to a spread sheet for calculation purposes. In this experiment, the serially diluted serum samples, which range from 1 – 12.5, to 1 – 204,800, were repeated in triplicate.

To analyze the data, the mean absorbance value is therefore calculated for each set of triplicates by adding all the values for each dilution and dividing the sum by 3. Once the mean for each set of triplicates is determined, the mean OD450 readings are plotted against the serial dilutions. The OD readings decrease as the serum is diluted, indicating that less antibodies are found in the more diluted samples. In the quantitative sandwich ELISA, dilutions of known standard, in this case recombinate Human TNFalpha, were added to a 96-well plate and read along with the unknown samples.

To create the standard curve, the mean absorbance value for each set of readings of the known concentrations was calculated. Then, the mean absorbance value was plotted on the y-axis, against the known protein concentrations on the x-axis. A best fit curve is added through the points in the graph.

Once the standard curve is generated, the amount of TNFalpha protein in the test sample can be determined by first calculating the mean absorbance value for the test sample. In this example, the test samples gave OD450 readings of 0.636 and 0. 681. Adding these values and dividing the sum by 2 gives an average of 0.659. From the y-axis on the standard curve graph, extend a horizontal line from this absorbance value to the standard curve. At the point of intersection, extend a vertical line to the x-axis and read the corresponding concentration which, in this test sample, corresponds to a TNFalpha concentration of 38.72 picograms per milliliter.

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