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Fuente: Tonya J. Webb1
1 Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland y el Centro Integral del Cáncer Marlene y Stewart Greenebaum, Baltimore, Maryland 21201
ELISPOT es un ensayo estandarizado y reproducible que se utiliza para detectar respuestas inmunitarias celulares. El ensayo utiliza un método basado en el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para detectar respuestas inmunitarias de una sola célula que pueden ser visualizadas por manchas, de ahí el nombre ELISPOT. ELISPOT fue descrito por primera vez en 1983, por Czerkinsky, como un método para enumerar el número de hibridaomas de células B que producen inmunoglobulinas específicas de antígenos (1). El mismo grupo desarrolló el ensayo para medir la frecuencia de los linfocitos T productores de citoquinas. Ahora ELISPOT se ha convertido en un estándar de oro para medir la inmunidad de células T específicas de antígenos en ensayos clínicos y candidatos a vacunas. Por ejemplo, después de la vacunación o durante una infección, las células plasmáticas y las células B de memoria secretan anticuerpos que proporcionan protección. Por lo general, estas respuestas de células B se evalúan midiendo los valoradores séricos de anticuerpos específicos de antígenos. Sin embargo, este tipo de análisis, normalmente medido por ELISA, puede no incluir células de memoria B, que pueden estar presentes incluso en ausencia de niveles de anticuerpos séricos detectables. Además, se ha establecido que las células B de memoria circulante son importantes para la respuesta rápida y protectora de anticuerpos observada después de la reexposición de patógenos, por lo que es fundamental poder detectar estas células. Por lo tanto, para evaluar claramente las respuestas de células B de memoria específica del antígeno, se deben utilizar TANTO ELISA como ELISPOT (2).
El ensayo ELISPOT utiliza una placa que contiene pozos revestidos de membrana que están recubiertos con anticuerpos con el fin de capturar proteínas secretas de interés. Luego, la placa se carga con células y estímulos para inducir la producción de proteínas. Las proteínas secretadas son capturadas por los anticuerpos recubiertos en la superficie. Después del tiempo de incubación adecuado, las células se eliminan y la molécula secretada se detecta mediante el uso de un anticuerpo biotinilado que es específico para un epítopo diferente, en comparación con el anticuerpo de captura. A continuación, se añade la estreptavidina peroxidasa, seguida de la adición de un sustrato que permite la detección de las manchas (Figura 1). La fuerza de este ensayo es que permite cuantificar el número de células que producen la proteína de interés. Es importante destacar que se puede evaluar si hay cambios en el número total de células que producen una proteína específica o si las células individuales dentro de una población están produciendo más proteína. Además, puede proporcionar información sobre la cinética y se puede utilizar para evaluar la activación inmune general (estimulación de mitogenos) en relación con las respuestas específicas del antígeno (simulación de antígeno). El ensayo ELISPOT permitirá la detección de una célula activada entre 300.000 células después de la activación mitogénica o específica del antígeno.
Figura 1: Descripción general del protocolo ELISPOT.
Las principales ventajas de este ensayo son su- a. Simplicidad - el protocolo es relativamente simple y directo. No requiere experiencia técnica, b. Sensibilidad- permite la detección de células inmunitarias a nivel de células únicas y requiere muy pocas células en comparación con otros métodos como la citometría de flujo, c. Funcionalidad- proporciona datos cuantitativos con respecto al inmune Función.
Este ejercicio de laboratorio demuestra el protocolo ELISPOT para la detección de esplenocitos secretos de IFN-o, pero como se mencionó anteriormente este ensayo también se puede utilizar para evaluar la secreción de anticuerpos por células B (3).
1. Configuración
Búferes y reactivos
Equipo
Materiales
Reactivos específicos de ensayo
2. Procedimiento
Capa
Bloqueo
Placado y Activación de Células
Detección
Anticuerpo primario
Anticuerpo secundario
Sustrato
3. Adquisición y Análisis de Datos
Notas:
El ensayo Inmunospot ligado a enzimas, o ELISPOT, es un método para analizar la respuesta inmunitaria a un patógeno o daño celular. Permite cuantificar la activación de diferentes células inmunitarias mediante la detección de proteínas específicas que secretan. Por ejemplo, ELISPOT se utiliza comúnmente para medir las respuestas de las células T al exponerse a un antígeno extraño mediante la detección de citoquinas secretas.
Para un ensayo ELISPOT basado en citoquinas, el proceso comienza con el recubrimiento de una microplaca ELISPOT con un anticuerpo de captura, que es específico de la citoquina objetivo. Después del recubrimiento de anticuerpos, las células T se añaden a los pozos y son estimuladas por un agente externo, como el anticuerpo anti-CD3, por ejemplo. Las células entonces secretan la citoquina objetivo, que inmediatamente es inmovilizada por el anticuerpo de captura. Dado que la proteína se captura instantáneamente después de la secreción de células vivas, sin dilución o degradación, este ensayo tiene una alta precisión. Después de inmovilizar la citoquina objetivo, se añade un anticuerpo de detección, que también se une a la citoquina capturada.
La técnica ELISPOT también se puede utilizar para cuantificar las células B de la memoria después de una infección o vacunación mediante el análisis de su producción de anticuerpos específicos. En un ELISPOT basado en anticuerpos, se utiliza un antígeno específico en lugar de un anticuerpo para el paso de captura, donde el antígeno se unirá a la placa, o en el paso de detección, donde el antígeno detecta el anticuerpo objetivo después de la captura. En todas las variaciones del proceso, para las células T o células B, el anticuerpo de detección o antígeno es biotintilado, lo que le permite unirse a una enzima de detección conjugada con estreptavidina, como la peroxidasa de rábano picante. Luego, tras la adición del sustrato de la peroxidasa, se produce un precipitado oscuro e insoluble. Este precipitado marca la ubicación de la proteína capturada, y cada célula secretora da como resultado un punto visible, que se puede cuantificar utilizando un lector ELISPOT o un microscopio. El tamaño de las manchas es una estimación relativa de la cantidad de proteína secretada de cada célula. Este ensayo puede detectar respuestas inmunitarias de células individuales, incluso en subpoblaciones relativamente pequeñas de células secretoras, por lo que es útil para estudiar las respuestas inmunitarias a nivel celular.
En este video, aprenderá cómo realizar un ensayo ELISPOT y luego cuantificar los lugares que representan las células secretoras.
A lo largo del experimento, asegúrese de que las condiciones estériles trabajen en una capucha de flujo laminar y usen guantes.
Todos los cálculos de este protocolo se basan en el volumen necesario para una placa de 96 pocillos.
En primer lugar, diluir el anticuerpo de captura anticitoquina. Para ello, transfiera 10 mililitros de amortiguador a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. A continuación, utilice una pipeta para añadir 10 microlitros de un miligramo por mililitro de anticuerpo monoclonal al tampón para crear una solución con una concentración final de un microgramo por mililitro. A continuación, vierta la solución de anticuerpos de captura en un depósito estéril y, utilizando una pipeta multicanal, distribuya 100 microlitros en cada pocal de una placa ELISPOT de 96 pocillos.
Cubra la placa con una cubierta de placa, séllela para evitar la evaporación e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, descubra la placa ELISPOT en la campana de flujo laminar. Invierta rápidamente la placa en toallitas estériles para eliminar la solución de anticuerpos de captura de cada pocal. A continuación, utilice una pipeta multicanal para agregar 200 microlitros de medio de cultivo celular a cada pocal. Este paso bloqueará el enlace no específico durante el ensayo. Reemplace la cubierta de la placa e incubar en una incubadora de 37 grados Celsius durante dos horas.
Mientras la placa está incubando, prepare una solución de 2X mitogeno agregando un microlitro de PMA y 20 microlitros de ionomicina a 10 mililitros de medio de cultivo celular para lograr una concentración final de 15 nanogramos por mililitro de PMA y una yonomicina micromolar.
Las suspensiones celulares de los splenocitos de ratón también deben prepararse en este momento en una campana estéril. Usando un microscopio y un hemocitómetro, mida la concentración de células y ajuste el volumen total hasta alcanzar una concentración de existencias de dos millones de células por mililitro.
Una vez completada la incubación, invierta rápidamente la placa en toallitas estériles para eliminar el medio de cultivo celular de cada pocal. A continuación, agregue 200 microlitros de la solución de suspensión celular preparada a los pozos de la fila superior de la placa ELISPOT. Configure el experimento en triplicado, de modo que cada tipo de celda probada se cene en un conjunto de tres columnas agrupadas. Debajo de esto, agregue 100 microlitros de medio de cultivo de células simples a las siguientes cinco filas de la placa, debajo de las filas que contienen la solución de stock celular.
A continuación, realice una dilución en serie pipeteando 100 microlitros de la suspensión celular desde la fila superior en la fila directamente debajo, pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo para distribuir uniformemente las células. Repita este proceso para las filas restantes, moviendo 100 microlitros de la fila anterior a la fila de abajo en cada paso, continuando hasta que la quinta fila se haya diluido en serie. Deje la sexta fila con solo medio de cultivo celular, para servir como un control. Para estimular las células en los pozos experimentales de la placa, añadir 100 microlitros de la solución de mitón preparado a las suspensiones celulares en cada pozo de las filas uno a cinco. Asegúrese de dejar la sexta fila, que servirá como el control, sin estimular. Reemplace la tapa e incubar la placa a 37 grados Centígrados y 5% de CO2 durante 24 a 48 horas.
Preparar el anticuerpo anticitoquina biotinilado diluido. Primero, preparar 50 mililitros de diluyente de ensayo añadiendo 5 mililitros de 10% de suero bovino fetal a 45 mililitros de PBS. A continuación, diluir el anticuerpo de detección a una concentración de 2 microgramos por mililitro en diluyente de ensayo. Además, prepare de 20 a 25 mililitros de tampón de lavado en este momento, mezclando .05% Tween-20 y PBS.
Una vez completada la incubación, destapa rallar la placa e invertirla rápidamente para eliminar todo el líquido de los pocillos. Lave la placa añadiendo alrededor de 200 microlitros de tampón de lavado a cada poca. Expulse este líquido invirtiendo y deslizando rápidamente la placa sobre un fregadero. Repita este proceso cuatro veces más para un total de cinco lavados. A continuación, añadir 100 microlitros de la solución de anticuerpos de detección diluida a cada pocil, reemplazar la tapa e incubar a temperatura ambiente durante dos horas. Después de la incubación, expulsar la solución de anticuerpos de detección de los pozos de la placa invirtiendo y moviendo la placa sobre el fregadero.
Como antes, lave el plato cinco veces con tampón de lavado, expulsando el líquido entre cada lavado. Después del lavado final, preparar la solución de peroxidasa de estreptavidina-rábano diluyéndola de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, con los pozos de la placa vacíos, añadir 100 microlitros de estreptavidina diluida- solución de peroxidasa de rábano picante a cada pocal. Vuelva a colocar la tapa en la placa e incubar a temperatura ambiente durante dos horas.
Después de la incubación, no más de 15 minutos antes de su uso, active la solución de sustrato AEC prefabricada. Deseche el contenido de los pozos y lave el plato cinco veces con tampón de lavado, como antes. A continuación, agregue inmediatamente 100 microlitros de solución de sustrato AEC preparada en cada poca. Deje que la placa a temperatura ambiente se desarrolle durante aproximadamente 10 a 20 minutos, mientras supervisa el desarrollo del punto. Estas manchas aparecerán como pequeñas círculos oscurecidas en la superficie de los pozos. A continuación, detenga la reacción encerrando la placa con agua y golpeándola sobre el fregadero. Soplar la placa sobre toallas de papel y dejar secar al aire durante la noche o hasta que esté completamente seca. Extracción de la bandeja de plástico debajo de la placa facilitará el secado. Después del secado, las manchas están listas para ser contadas con un lector de placas automatizado.
Aquí, se utiliza el lector CTL ImmunoSpot, pero este protocolo se puede adaptar para cualquier lector. A continuación, abra el programa CTL y haga clic en Scan Count. Empuje la expulsión para que la bandeja se extienda desde la máquina. A continuación, retire el adaptador de plástico y alinee la fila A en la placa ELISPOT y el adaptador. Elija un nombre de archivo y una ubicación para el archivo que se va a guardar y cargue la placa y el adaptador en la bandeja. Haga clic en Cargar en el software y cierre la puerta en el lateral de la máquina. A continuación, pulse Iniciar después de contar. Asegúrese de que el archivo está guardado y, a continuación, abra el software Control de calidad QC para analizar los datos y contar el número de puntos. Exporte estos datos como un archivo de Excel. Una vez completado el análisis, haga clic en Expulsar para recuperar la placa.
En este experimento, las células de los ratones de tipo salvaje y tumoral fueron chapadas y analizadas para la gamma IFN. Observe que el número de manchas disminuye con la disminución de la concentración celular. Normalmente, los datos ELISPOT se presentan como el número de recuentos de puntos por número de celdas chapadas. En este ejemplo, el número de puntos se mostraron en un gráfico de barras, con cada concentración celular respectiva listada en el eje X. Observe que el número de puntos indica el número de celdas activadas por número total de celdas en un población determinado.
El ensayo Enzyme-linked Immunospot, o ELISPOT, es un método para analizar la respuesta inmunitaria a un patógeno o al daño celular. Permite cuantificar la activación de diferentes células inmunitarias mediante la detección de proteínas específicas que segregan. Por ejemplo, ELISPOT se usa comúnmente para medir las respuestas de las células T ante la exposición a un antígeno extraño mediante la detección de citocinas secretadas.
Para un ensayo ELISPOT basado en citocinas, el proceso comienza con el recubrimiento de una microplaca ELISPOT con un anticuerpo de captura, que es específico de la citocina objetivo. Después del recubrimiento de anticuerpos, las células T se agregan a los pocillos y son estimuladas por un agente externo, como el anticuerpo anti-CD3, por ejemplo. A continuación, las células secretan la citocina diana, que es inmovilizada inmediatamente por el anticuerpo de captura. Dado que la proteína se captura instantáneamente después de la secreción de células vivas, sin dilución ni degradación, este ensayo tiene una alta precisión. Una vez inmovilizada la citocina objetivo, se añade un anticuerpo de detección, que también se une a la citocina capturada.
La técnica ELISPOT también se puede utilizar para cuantificar las células B de memoria después de una infección o vacunación mediante el análisis de su producción de anticuerpos específicos. En un ELISPOT basado en anticuerpos, se utiliza un antígeno específico en lugar de un anticuerpo para la etapa de captura, en la que el antígeno se unirá a la placa, o en la etapa de detección, en la que el antígeno detecta el anticuerpo objetivo después de la captura. En todas las variaciones del proceso, para las células T o las células B, el anticuerpo o antígeno de detección está biotinilado, lo que le permite unirse a una enzima de detección conjugada con estreptavidina, como la peroxidasa de rábano picante. Luego, tras la adición del sustrato de la peroxidasa, AEC, se produce un precipitado oscuro e insoluble. Este precipitado marca la ubicación de la proteína capturada, y cada célula secretora da como resultado una mancha visible, que se puede cuantificar utilizando un lector ELISPOT o un microscopio. El tamaño de las manchas es una estimación relativa de la cantidad de proteína secretada por cada célula. Este ensayo puede detectar respuestas inmunitarias de células individuales, incluso en subpoblaciones relativamente pequeñas de células secretoras, lo que lo hace útil para estudiar las respuestas inmunitarias a nivel celular.
En este vídeo, aprenderá a realizar un ensayo ELISPOT y, a continuación, a cuantificar las manchas que representan las células secretoras.
A lo largo del experimento, asegure las condiciones estériles trabajando en una capucha de flujo laminar y usando guantes.
Todos los cálculos de este protocolo se basan en el volumen necesario para una placa de 96 pocillos.
Primero, diluya el anticuerpo de captura de citocinas. Para hacer esto, transfiera 10 mililitros de tampón a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. A continuación, utilice una pipeta para añadir 10 microlitros de un miligramo por mililitro de anticuerpo monoclonal al tampón para crear una solución con una concentración final de un microgramo por mililitro. A continuación, vierta la solución de anticuerpos de captura en un depósito estéril y, utilizando una pipeta multicanal, distribuya 100 microlitros en cada pocillo de una placa ELISPOT de 96 pocillos.
Cubra la placa con una cubierta de placa, séllela para evitar la evaporación e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, descubra la placa ELISPOT en la campana de flujo laminar. Invierta rápidamente la placa en toallitas estériles para eliminar la solución de anticuerpos de captura de cada pocillo. A continuación, utilice una pipeta multicanal para añadir 200 microlitros de medio de cultivo celular a cada pocillo. Este paso bloqueará la unión no específica durante el ensayo. Vuelva a colocar la tapa de la placa e incube en una incubadora a 37 grados centígrados durante dos horas.
Mientras se incuba la placa, prepare una solución mitógena 2X agregando un microlitro de PMA y 20 microlitros de ionomicina a 10 mililitros de medio de cultivo celular para lograr una concentración final de 15 nanogramos por mililitro de PMA y un micromolar de ionomicina.
Las suspensiones celulares de los esplenocitos de ratón también deben prepararse en este momento en una capucha estéril. Con un microscopio y un hemocitómetro, mida la concentración de células y ajuste el volumen total hasta alcanzar una concentración de dos millones de células por mililitro.
Una vez completada la incubación, invierta rápidamente la placa sobre toallitas estériles para eliminar el medio de cultivo celular de cada pocillo. A continuación, añada 200 microlitros de la solución madre de suspensión celular preparada a los pocillos de la fila superior de la placa ELISPOT. Configure el experimento por triplicado, de modo que cada tipo de celda probado se coloque en un conjunto de tres columnas agrupadas. Debajo de esto, agregue 100 microlitros de medio de cultivo celular simple a las siguientes cinco filas de la placa, debajo de las filas que contienen la solución madre celular.
A continuación, realice una dilución en serie pipeteando 100 microlitros de la suspensión celular desde la fila superior hasta la fila directamente debajo, pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo para distribuir uniformemente las celdas. Repita este proceso para las filas restantes, moviendo 100 microlitros de la fila anterior a la fila de abajo en cada paso, continuando hasta que la quinta fila se haya diluido en serie. Deje la sexta fila con medio de cultivo celular solamente, para que sirva como control. Para estimular las células en los pocillos experimentales de la placa, agregue 100 microlitros de la solución mitógena preparada a las suspensiones celulares en cada pocillo de las filas uno a cinco. Asegúrese de dejar la sexta fila, que servirá como control, sin estimular. Vuelva a colocar la tapa e incube la placa a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 24 a 48 horas.
Prepare el anticuerpo anticitocina biotinilado diluido. Primero, prepare 50 mililitros de diluyente de ensayo agregando 5 mililitros de suero bovino fetal al 10% a 45 mililitros de PBS. A continuación, diluya el anticuerpo detector hasta una concentración de 2 microgramos por mililitro en el diluyente del ensayo. Además, prepare de 20 a 25 mililitros de tampón de lavado en este momento, mezclando .05% Tween-20 y PBS.
Una vez completada la incubación, destape la placa e inviértala rápidamente para eliminar todo el líquido de los pocillos. Lave la placa agregando aproximadamente 200 microlitros de tampón de lavado a cada pocillo. Expulse este líquido invirtiendo rápidamente y moviendo el plato sobre un fregadero. Repite este proceso cuatro veces más para un total de cinco lavados. A continuación, agregue 100 microlitros de la solución diluida de anticuerpos de detección a cada pocillo, vuelva a colocar la tapa e incube a temperatura ambiente durante dos horas. Después de la incubación, expulse la solución de anticuerpos de detección de los pocillos de la placa invirtiendo y moviendo la placa sobre el fregadero.
Al igual que antes, lave la placa cinco veces con tampón de lavado, expulsando el líquido entre cada lavado. Después del lavado final, prepare la solución de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante diluyéndola de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, con los pocillos de la placa vacíos, agregue 100 microlitros de solución diluida de estreptavidina-rábano picante peroxidasa a cada pocillo. Vuelva a colocar la tapa en el plato e incube a temperatura ambiente durante dos horas.
Después de la incubación, no más de 15 minutos antes de su uso, active la solución de sustrato AEC prefabricada. Deseche el contenido de los pocillos y lave el plato cinco veces con tampón de lavado, como antes. Luego, agregue inmediatamente 100 microlitros de solución de sustrato AEC preparada en cada pocillo. Deje la placa a temperatura ambiente para que se revele durante aproximadamente 10 a 20 minutos, mientras monitorea el desarrollo de manchas. Estas manchas aparecerán como pequeños círculos oscuros en la superficie de los pozos. Luego, detenga la reacción enjuagando el plato con agua y pasándolo por encima del fregadero. Seca el plato con toallas de papel y déjalo secar al aire durante la noche o hasta que esté completamente seco. Quitar la bandeja de plástico debajo del plato facilitará el secado. Después del secado, las manchas están listas para ser contadas con un lector de placas automatizado.
En este caso, se utiliza el lector CTL ImmunoSpot, pero este protocolo se puede adaptar a cualquier lector. Luego, abra el programa CTL y haga clic en Recuento de escaneos. Empuje la expulsión para que la bandeja se extienda desde la máquina. A continuación, retire el adaptador de plástico y alinee la fila A en la placa y el adaptador ELISPOT. Elija un nombre de archivo y una ubicación para el archivo que se va a guardar y cargue la placa y el adaptador en la bandeja. Haga clic en Cargar en el software y cierre la puerta en el costado de la máquina. Luego, presione Iniciar después de contar. Asegúrese de que el archivo esté guardado y luego abra el software de control de calidad QC para analizar los datos y contar el número de manchas. Exporte estos datos como un archivo de Excel. Una vez completado el análisis, haga clic en Expulsar para recuperar la placa.
En este experimento, se sembraron células de ratones de tipo salvaje y portadores de tumores y se analizaron para IFN gamma. Observe que el número de manchas disminuye con la disminución de la concentración celular. Normalmente, los datos de ELISPOT se presentan como el número de recuentos puntuales por número de celdas plateadas. En este ejemplo, el número de puntos se mostró en un gráfico de barras, con cada concentración celular respectiva enumerada en el eje x. Observe que el número de puntos indica el número de células activadas por el número total de células en una población determinada.
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