Generación de anticuerpos: Producción de anticuerpos monoclonales mediante hibridomas

Nota: La técnica de cultivo celular estéril debe mantenerse al manipular las células del hibrioma y los medios de comunicación de una manera estéril (por ejemplo, en un gabinete de bioseguridad) hasta que la purificación de anticuerpos sea pisada.

1. Descongelar las células de hibrido congelado

1. Incubar el vial que contiene las células de hibrioma congeladas en un baño de agua a 37oC hasta que solo se descongele (aproximadamente 2 minutos).
2. Añadir las células descongeladas a un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de RPMI completo (RPMI complementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, 1 mM de piruvato sódico, 1x aminoácidos no esenciales, 50 M 2-Mercaptoetanol, 10 mM de HEPES).
3. Centrífuga durante 5 min a 1200 RPM para lavar cualquier medio de congelación contaminante.
4. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante líquido y resuspenda el pellet celular en 5 ml de RPMI completo fresco. A continuación, agregue las células a un matraz de cultivo de tejido T75 que contenga 15 ml de RPMI completo (el volumen final de RPMI es de 20 ml).
5. Cultivar las células en una incubadora estándar a 37oC con un 5% de_CO2. Las células no son adherentes mientras están en cultivo.

2. Expansión de Hybridoma

1. Permita que las células se expandan durante aproximadamente 3 días hasta que el matraz sea confluente del 80%.
   Nota: Esta cantidad de tiempo puede variar en función del número inicial de células, así como las diferencias inherentes en las tasas de crecimiento de diferentes células. Es importante que las células estén en la fase de crecimiento exponencial.
2. Una vez que el matraz inicial alcance una confluencia del 80 %, retire las células de este matraz T75 inicial, colóquelas en un tubo centrífugo cónico y gire (1200 RPM durante 5 min) para peletizar las células.
3. Resuspenda las células en 6 ml de RPMI completo y luego distribuya la suspensión celular en tres nuevos matraces T75 (2 ml/matraz que contienen 18 ml de RPMI). Incubar estos tres matraces T75 a 37oC con 5% de_CO2 hasta que sean confluentes del 80% (Esto debe tomar aproximadamente 3 días).

3. Producción de anticuerpos en el medio libre de suero

Nota: En este punto, las células están listas para continuar su crecimiento en un medio libre de suero diseñado para el crecimiento de las líneas celulares de hibrido. En este protocolo, utilizamos el medio líquido basal HB listo para usar y disponible comercialmente que contiene el producto de suplemento HB101.

1. Las células de cada uno de los tres matraces T75 (con una confluencia del 80%) se recogen y centrifugan (1200 RPM durante 5 min).
2. El pellet celular de cada matraz T75 se resuspende en un medio sin suero HB101 suplementado de 10 ml y luego se añade a dos matraces T225 suplementados con HB101 (es decir, suspensión celular de 5 ml en cada uno de 6 matraces que contienen 220-240 ml de HB01 en cada matraz).
3. Continúe cultivando las células en matraces T225 y medios HB101 a 37oC con 5% de_CO2 durante tres semanas, o hasta que las células comiencen a morir. Las células están produciendo mAb durante estas 3 semanas y secretándolo en el medio de cultivo. Una vez que las células están empezando a morir, ya no están produciendo ningún mAb.

4. Purificación de anticuerpos - Día 1

Nota: En este punto, no es necesario mantener la esterilidad, por lo que no es necesario manipular los medios de forma estéril (por ejemplo, en un gabinete de bioseguridad). Además, los hibriomas no se consideran un agente de "nivel BSL2".

1. Vierta los medios de los matraces en tubos para un rotor de ángulo fijo. Gire los tubos en una centrífuga con un rotor de ángulo fijo a 10.000 RPM durante 8 minutos. Este paso está diseñado para eliminar los desechos celulares del sobrenadante de cultivo.
   Nota: Los tamaños de los tubos pueden variar dependiendo del rotor utilizado. Lo importante a recordar es tener el mismo volumen en los tubos para asegurar que el rotor esté correctamente equilibrado antes de la centrifugación. Es probable que todo el volumen de los medios de comunicación no encaje en la centrífuga a la vez. El resto de los medios se centrifugarán más adelante (paso 4.5) utilizando los mismos tubos.
2. Prepare un vaso de precipitados de plástico 2L con una barra de agitación en un cubo rodeado de hielo. Colocar en un plato de agitación.
3. Coloque una tapa de filtro de 500 ml en una botella de 1L. Coloque la unidad de filtro de la tapa de la botella para albergar el vacío a través de un tubo apropiado.
4. Vierta el sobrenadante del paso 4.1 (que todavía contiene el mAb producido por las células del hibrioma) en la parte superior del filtro.
5. Continúe utilizando el mismo conjunto de tubos para los desechos de células de pellets de los medios (el pellet continuará construyéndose). Espere a ejecutar la aspiradora hasta que la parte superior del filtro esté llena y otro lote de sobrenadante esté listo para verter. No deje que el filtro se seque o el filtrado será muy lento.
6. Cuando la botella de 1L esté casi llena, retire la tapa del filtro y vierta el sobrenadante en el vaso de precipitados 2L preparado en el paso 4.2. Vuelva a colocar la parte superior del filtro. Realice un seguimiento del volumen.
7. Repita los pasos de centrifugación y filtración hasta que se procese todo el medio.
8. Mida 295 g de sulfato de amonio por 1L de sobrenadante filtrado recogido. Mientras se agita, agregue lentamente el sulfato de amonio al sobrenadante durante las próximas horas (25 g cada 15 minutos) para evitar una alta concentración localizada de sal de sulfato de amonio que puede hacer precipitar proteínas no deseadas.
9. Una vez que se haya añadido todo el sulfato de amonio, cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y muévalo con la placa de agitación a 4oC (p. ej., refrigerador a pie o sala fría). Revuelve durante la noche. Se requiere agitación constante de la solución para solubilizar la sal, pero la agitación prolongada puede conducir a la desnaturalización de las proteínas en la solución en la interfaz superficie/aire.
10. Lave los tubos con el rotor de ángulo fijo.

5. Purificación de anticuerpos - Día 2

1. Vierta el sobrenadante que contiene amonio del vaso de precipitados 2L en tubos para un rotor de ángulo fijo. Gire en centrífuga con rotor de ángulo fijo a 6500 RPM durante 20 minutos sin freno.
2. Aspirar aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no chupar el pellet, ya que será suave. Continúe utilizando el mismo conjunto de tubos para recoger el pellet del sobrenadante que contiene amonio-sulfato.
3. Después de la última aspiración, resuspenda cada pellet (que contiene anticuerpos) en PBS de 1 ml.
4. Retire el sulfato de amonio de la solución precipitada de mAb mediante diálisis contra grandes volúmenes de PBS. Para ello, primero corte aproximadamente 1 pulgada de tubería de diálisis (por ejemplo, Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000 Tubo de diálisis de celulosa de corte Dalton) por cada ml de solución de mAb. Humedezca el tubo con dH₂O. Ate un nudo en un extremo del tubo y llene con dH₂O para comprobar que el nudo no se filtre. Vacío dH₂O del tubo.
5. Pipetear la solución de anticuerpos/PBS en el tubo. Enjuague los tubos con 0,25 ml de PBS adicional y transfiera al tubo.
6. Asegure la parte superior del tubo lo más cerca posible de la solución con un clip de diálisis naranja.
7. Pegue la parte superior del tubo en la parte superior exterior de un vaso de precipitados 4L. Deje que la parte llena del tubo cuelgue en el vaso de precipitados. Llene el vaso de precipitados con PBS y agregue una barra de agitación.
8. Revuelva durante la noche durante 8 horas a 4oC.
9. Sustituya el PBS en el vaso de precipitados por PBS fresco y revuelva durante 8 horas dos veces más.
10. Transfiera el anticuerpo del tubo a tubos cónicos de 15 o 50 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 1200 RPM para eliminar cualquier precipitado que pueda haberse formado. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
11. Diluir una alícuota de anticuerpos 1:20 con PBS (anticuerpo de 5 l + PBS de 95 l). Cantidad de la concentración de anticuerpos con un espectrofotómetro (en blanco con PBS) a 280 nm. Utilice un coeficiente de extinción de 1,43. La concentración se calcula como
    
    
12. Alícuota el anticuerpo en viales de tapa de tornillo y guárdelo a -80oC.