Generación de anticuerpos: Producción de anticuerpos monoclonales mediante hibridomas

Los anticuerpos son una poderosa herramienta para la investigación y el diagnóstico, lo que significa que a menudo es necesario producirlos en grandes cantidades.

El primer paso para generar anticuerpos es inyectar el antígeno de interés en un animal huésped. El antígeno activa las células B del huésped, que luego producen y liberan anticuerpos específicos contra ese antígeno. A continuación, se lleva a cabo un cribado periódico de los antisueros del animal huésped para detectar la presencia del anticuerpo diana, utilizando ELISA u otro método de detección. Una vez que se detecta, se extirpa el bazo del animal huésped, que contiene las células B. Si todas las células B del bazo están ahora aisladas, esto debería incluir una población que esté secretando anticuerpos contra el antígeno de interés. Nos referimos a esta población como policlonal, porque probablemente cada célula se unió a un epítopo diferente del antígeno y, por lo tanto, generó su propio anticuerpo individual y único.

Para generar anticuerpos monoclonales, es decir, anticuerpos generados para reconocer un epítopo específico, primero se debe aislar y cultivar la célula B individual que produce el anticuerpo deseado. Desafortunadamente, las células B no sobreviven bien en cultivo. Entonces, para superar este obstáculo, los científicos fusionan las células B con células de mieloma inmortales, lo que da como resultado hibridomas. Luego, estas células se cultivan en un medio selectivo que solo permite que los hibridomas crezcan y liberen anticuerpos. Una vez más, el medio se examina mediante un método como ELISA para el anticuerpo deseado. Una vez que se detecta, los hibridomas se clonan a través de un proceso llamado dilución limitada, una dilución en serie del cultivo original, que debería dar lugar a la siembra de células individuales en los pocillos de una placa de cribado. Esto permite el crecimiento de hibridomas a partir de una sola célula madre, produciendo una línea celular monoclonal que solo libera el anticuerpo deseado. Estas líneas monoclonales pueden expandirse en matraces de cultivo de tejidos para producir grandes cantidades de anticuerpos monoclonales. Después de esto, a medida que las células comienzan a morir, los anticuerpos pueden precipitarse del medio con sulfato de amonio. Normalmente, en solución, los anticuerpos interactúan con el agua a través de interacciones hidrofílicas. Sin embargo, el amonio y el sulfato son iones altamente cargados que separan las moléculas de agua de los anticuerpos, disminuyendo la solubilidad de los anticuerpos y haciendo que precipiten.

Para comenzar, primero verifique la lista de materiales y prepare todos los medios, suministros y superficies de trabajo para el protocolo.

Luego, abre un baño de agua y ajústalo a 37 grados centígrados. A continuación, agregue 10 mililitros de RPMI completo a un tubo cónico de 15 mililitros y 15 mililitros de RPMI completo a un matraz de cultivo celular T75 y déjelos a un lado. Con precaución y usando el equipo de protección personal adecuado, retire el frasco congelado que contiene células de hibridoma del almacenamiento de nitrógeno líquido. Para liberar la presión dentro del vial, afloje ligeramente la tapa. Ahora, incube cuidadosamente el vial en el baño de agua, asegurándose de que la tapa permanezca por encima de la superficie del agua para minimizar las posibilidades de contaminación. Cuando las células estén casi descongeladas, lo que suele tardar unos dos minutos, mueva el vial a la campana de cultivo de tejidos.

A continuación, limpie el exterior del vial con etanol al 70% antes de retirar el tapón. Con una pipeta estéril, transfiera las células al tubo cónico que contiene 10 mililitros de medio RPMI completo. Luego, centrifuga el tubo durante cinco minutos a 1200 RPM. Después de la centrifugación, vuelva a colocar el tubo en la cubierta de tejido y limpie el exterior del tubo con etanol. Sin alterar el pellet, deseche el sobrenadante y luego agregue cinco mililitros de medio RPMI completo fresco y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender. A continuación, transfiera las células al matraz de cultivo celular T75 y coloque el matraz dentro de una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Permita que las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, lo que suele tardar unos tres días. Tenga en cuenta que las células de hibridoma no se adhieren y crecerán suspendidas en el medio. El tiempo para alcanzar una confluencia suficiente puede variar según el número inicial de células vivas y el tipo de célula de hibridoma utilizada.

Una vez que las células sean lo suficientemente confluentes, utilice una pipeta estéril de 25 mililitros para transferirlas del matraz de cultivo a un tubo de centrífuga cónico. Peletizar las células por centrifugación a 1200 RPM durante cinco minutos. Mientras las células están en la centrífuga, agregue 18 mililitros de RPMI completo en cada uno de los tres nuevos matraces de cultivo celular T75 y déjelos a un lado. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente el pellet de celda en seis mililitros de RPMI completo. A continuación, añada dos mililitros de la suspensión celular en cada uno de los tres nuevos matraces de cultivo celular. Finalmente, coloque los matraces en una incubadora configurada a 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados e incube hasta que los matraces tengan alrededor del 80% de confluente, aproximadamente tres días.

En este punto, las células están listas para continuar su crecimiento en el medio libre de suero diseñado para líneas celulares de hibridomas, como el medio HB Basal Liquid disponible comercialmente que contiene el suplemento HB101. Transfiera las células de cada matraz de cultivo celular a tubos de centrífuga cónicos y luego granule las células por centrifugación a 1200 RPM durante cinco minutos. Ahora, agregue 230 mililitros de medio libre de suero HB101 suplementado en cada uno de los seis matraces de cultivo celular de 225 centímetros cuadrados y déjelos a un lado. Una vez finalizada la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender cada pellet en 10 mililitros de medio HB101 suplementado. A continuación, en cada matraz de cultivo celular, se añadan cinco mililitros de la suspensión celular. Coloque los matraces en la incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados y continúe cultivando las células durante unas tres semanas. Durante este tiempo, las células producirán y liberarán el anticuerpo monoclonal de interés en el medio de cultivo y el anticuerpo estará listo para la purificación cuando las células comiencen a morir.

Para eliminar los restos celulares de los medios de cultivo que contienen anticuerpos, vierta el contenido de los matraces de cultivo en tubos para un rotor de ángulo fijo. Coloque los tubos en el rotor y asegúrese de que esté correctamente equilibrado antes de la centrifugación. Haga girar los tubos a 10.000 rpm durante ocho minutos. Mientras se centrifugan las muestras, coloque un vaso de plástico de dos litros con una barra de agitación en una cubeta de hielo y luego coloque la cubeta de hielo en una placa de agitación.

A continuación, coloque una tapa de filtro de 500 mililitros en una botella de un litro. Conecte esta unidad de filtro de tapa de botella a una aspiradora doméstica usando el tubo apropiado. A continuación, vierta el sobrenadante que contiene el anticuerpo en la parte superior del filtro. Centrifugar el medio restante para separar los restos celulares del sobrenadante que contiene anticuerpos. Cuando la parte superior del filtro esté llena de sobrenadante, encienda la aspiradora. Luego, cuando la botella de recolección de un litro esté casi llena, retire la tapa del filtro y vierta el sobrenadante filtrado en el vaso de precipitados de dos litros sobre hielo. Repita los pasos de filtración hasta que se procese todo el sobrenadante.

Cuando se haya procesado toda la muestra, pese 295 gramos de sulfato de amonio por un litro de sobrenadante filtrado. Encienda la placa de agitación y agregue lentamente el sulfato de amonio al sobrenadante durante las próximas horas. Esto evita una alta concentración localizada de sal de sulfato de amonio que puede hacer que precipiten proteínas no deseadas. Una vez que se haya agregado todo el sulfato de amonio, cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y muévalo, junto con la placa de agitación, a una habitación fría a cuatro grados centígrados y configúrelo para agitar la solución de anticuerpos durante la noche.

A la mañana siguiente, vierta la solución de anticuerpos que contiene sulfato de amonio del vaso de precipitados de dos litros en tubos limpios para el rotor de ángulo fijo. Centrifugar los tubos a 6500 RPM durante 20 minutos sin descanso para granular el anticuerpo en la parte inferior de los tubos. A continuación, aspire al vacío el sobrenadante, teniendo cuidado de no aspirar la pelletización blanda. Continúe usando el mismo conjunto de tubos para recolectar el anticuerpo granulado del resto del sobrenadante que contiene sulfato de amonio. Después de la última aspiración, vuelva a suspender cada gránulo de anticuerpo en aproximadamente un mililitro de PBS.

Para eliminar el sulfato de amonio de la solución de anticuerpos, primero corte aproximadamente una pulgada de tubo de diálisis por cada mililitro de solución de anticuerpos. A continuación, limpie el tubo con agua destilada y haga un nudo en un extremo del tubo. Llene el tubo con agua destilada para verificar si hay fugas del nudo. Si no hay fugas después de unos minutos, vacíe el agua del tubo.

A continuación, pipetee la solución de anticuerpos en el tubo. Para recuperar la mayor cantidad posible de anticuerpos, enjuague los tubos con 0,25 mililitros adicionales de PBS y transfiéralos también al tubo. Asegure la parte superior del tubo lo más cerca posible de la solución con un clip de diálisis. Luego, pegue con cinta adhesiva la parte superior del tubo a la parte exterior de un vaso de precipitados de cuatro litros con la parte llena del tubo colgando del vaso de precipitados. Ahora, lleve el vaso de precipitados a la cámara frigorífica de cuatro grados centígrados y colóquelo en una placa para remover. Llene el vaso de precipitados hasta la parte superior con PBS y agregue una barra revolvente. Deje que el tubo y la solución remuevan durante la noche durante aproximadamente ocho horas. A la mañana siguiente, reemplace el PBS en el vaso de precipitados con PBS nuevo y luego deje que el vaso de precipitados revuelva nuevamente durante aproximadamente ocho horas. Más tarde esa noche, repita el proceso por última vez. Por la mañana, abra el tubo de diálisis y luego transfiera la solución de anticuerpos del tubo a tubos cónicos de 15 mililitros. Para eliminar cualquier precipitante que pueda haberse formado durante la diálisis, centrifugue los tubos durante cinco minutos a 1200 RPM. Finalmente, transfiera el sobrenadante a tubos nuevos.

Para cuantificar la concentración de anticuerpos, primero se debe hacer una dilución de 20 veces añadiendo cinco microlitros de una alícuota de anticuerpo a 95 microlitros de PBS. A continuación, pipetea el anticuerpo diluido en una cubeta y utiliza un espectrofotómetro para registrar la concentración a 280 nanómetros. A continuación, calcule la concentración de anticuerpos utilizando la fórmula que se muestra. Por último, etiquete los viales con tapón de rosca con el nombre del anticuerpo, la concentración, la fecha de preparación y, si corresponde, el número de lote y el nombre del experimentador, y luego alícuota el anticuerpo en los viales con tapón de rosca etiquetados. Estos se pueden almacenar a menos 80 grados centígrados hasta que se necesiten.

Los rendimientos de ejemplo utilizando la línea de hibridoma 120G8 anti-mouse CD317 o PDCA-1 oscilaron entre 44 y 99,6 miligramos, lo que normalmente produce, en promedio, una cantidad de 67,3 miligramos. Es importante tener en cuenta que cada ciclo de producción con la misma línea celular de hibridoma puede ser ligeramente diferente en la cantidad de anticuerpo monoclonal disponible al final.