Microscopía de Fluorescencia Confocal: Una Técnica para Determinar la Localización de Proteínas en Fibroblastos de Ratón

1. Materiales

Búferes

1. Tampón de lavado: 1 salina estéril con fosfato (PBS) sin calcio o magnesio
2. Búfer de fijación: 1% paraformaldehído en PBS
3. Búfer de permeabilización: 0.1% Triton X-100 en PBS
4. Buffer de bloqueo: 1% albúmina sérica bovina en PBS
5. Medio de crecimiento celular: DMEM complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), penicilina/estreptomicina y L-glutamina

Equipo

6. Capucha de flujo laminar
7. Incubadora humedecida (37oC, 5% CO₂)
8. Microscopio de escaneo láser confocal; aquí, Nikon Eclipse Ti láser

Materiales y reactivos

9. Diapositivas de cultivo celular por cámara
10. Medios de montaje anti-fade con DAPI (para tinción de núcleos)
11. Vidrio de la cubierta del microscopio
12. Toallitas de tarea delicadas
13. Pipettors y puntas

Reactivos específicos de ensayo

14. Células adherentes (células primarias o líneas celulares); aquí, se utilizaron fibroblastos de ratón transtrófilos con CD1d (LCD1).
15. Anticuerpos primarios para detectar objetivos celulares; aquí, se utilizaron cd107a antiratón de rata (LAMP-1) y ratón antiratón CD1d.
16. Anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos específicos de los isotipos de anticuerpos primarios; aquí se utilizaron IgG anti-rata conjugada con Alexafluor 488 y anti-ratón IgG conjugado con Alexafluor 647.

2. Protocolo

Preparación para la tinción de anticuerpos

Células de sembrado

1. Resuspender las células de interés en los medios de crecimiento.
2. Luego, la semilla de 500 l de la suspensión de la célula / por pozo en los pozos de un portaobjetos de cámara de 4 pozos. (Aquí, las células LCD1 se sembraron a 2.5x10⁵ células/cámara en 500 s de medios de crecimiento. La densidad de sembración puede variar entre líneas celulares).
3. Incubar el tobogán de la cámara durante la noche en una incubadora de_CO2 del 5% a 37oC, para permitir que las células se adhieran al vidrio.
4. Al día siguiente, aspirar los medios de cada poca y luego lavar las células 1X con 500 l de PBS.

Fijación

5. Para fijar las células, agregue una solución de paraformaldehído de 500 l 1% en cada poca y incubadurante durante 15 minutos a temperatura ambiente.
6. Después de la incubación, recoja el paraformaldehído en un contenedor de residuos líquidos peligrosos apropiado.
7. Luego, lave las células 3 veces con 500 l de PBS para eliminar los restos del fijador.

Permeabilización

8. Permeabilizar las células incubando con un tampón/bien de permeabilización de 500 l durante 15 minutos a temperatura ambiente.
9. Luego, lave las células brevemente 3 veces con 500 l de PBS.

Bloqueo

10. Incubar las células de cada pozo con un tampón de bloqueo de 500 ml durante 1 hora a 4oC, para bloquear la unión de anticuerpos no específicos.

Incubación de anticuerpos primarios

11. Aspirar el búfer de bloqueo de las cámaras deslizantes.
12. A continuación, agregue 500 s de solución de anticuerpos primarios diluidas a las células. (Aquí, anti-CD107a (LAMP-1) se diluyó 1:500 y anti-CD1d se utilizó sin diluir (1H6 anticuerpo monoclonal fue amablemente proporcionado por el Dr. Randy Brutkiewicz)).
13. Incubar los toboganes durante la noche a 4oC.

Nota: Si sondea más de un objetivo, asegúrese de que los anticuerpos primarios sean isotipos diferentes. Las concentraciones recomendadas de anticuerpos varían entre los fabricantes y deben valorarse antes de su uso.

Incubación Secundaria de Anticuerpos

14. Aspirar la solución primaria de anticuerpos de los pozos.
15. Lave las cámaras del pozo 4 veces con 500 oL de PBS.
16. A continuación, añadir 500 s de la solución de anticuerpos secundarios diluidas a cada poca. (Aquí, tanto los anticuerpos secundarios- anti-ratón IgG Alexafluor 647 y anti-rata IgG Alexafluor 488 se diluyeron 1:2000 en el búfer de bloqueo).
17. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad.
18. Después de la incubación, aspirar la solución secundaria de anticuerpos.
19. Lavar las cámaras 4 veces con 500 oL de PBS para eliminar cualquier anticuerpo secundario no unido.

Nota: Las concentraciones recomendadas de anticuerpos varían entre los fabricantes y deben valorarse antes de su uso. Si se sondea más de un objetivo, los anticuerpos secundarios deben conjugarse con diferentes fluoróforos con espectros únicos de excitación/emisión. También tenga en cuenta la excitación/emisión de la contramancha nuclear (es decir, DAPI) mientras selecciona los fluoróforos. La selección de fluoróforos puede verse afectada por la configuración láser del microscopio confocal utilizado. La configuración láser de la máquina dictará qué fluoróforos son adecuados para el experimento.

3. Montaje de Coverslips

1. En primer lugar, retire cuidadosamente las cámaras de la corredera.
2. Luego, sostenga la diapositiva en ángulo sobre una delicada limpieza de tareas y retire el líquido de los bordes sin tocar las células.
3. Agregue 1 gota de medio de montaje antidescoloro, que contenga la mancha nuclear DAPI, en cada sección de las células.
4. A continuación, coloque un recubre de 20 mm x 60 mm sobre la diapositiva sosteniéndolo sobre los bordes con las yemas de los dedos. (Evite la formación de burbujas sobre las células, ya que interfieren con las imágenes).
5. Limpie cualquier medio de montaje adicional en los lados con una delicada limpieza de tareas y guarde los portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente hasta una semana.

4. Imágenes confocales

Muestras de imagen en un microscopio de escaneo láser confocal. Para los datos mostrados en la Figura 2, la Nikon Eclipse Ti A1R se utilizó con el software NIS Elements Advanced Research. En la siguiente sección se detalla el procedimiento para capturar imágenes utilizando el software antes mencionado.

1. Para comenzar a crear imágenes de las celdas, abra el software 'NIS Elements Advanced Research' haciendo clic en el icono de'NIS software.'
2. A continuación, en la ventana de control haga clic en 'TiPad' pestaña y elegir el objetivo deseado para la imagen. (Aquí, se utilizó el primer objetivo 40x).
3. Cargue la diapositiva con celdas en el escenario y céndala debajo de la lente.
4. Ahora, en la pestaña 'A1plus Compact GUI', configure los láseres apropiados para los fluoróforos utilizados. Haga clic en el símbolo de engranaje para abrir el menú de ajustes espectrales y de tinte y seleccionar los canales necesarios y configurar el láser para cada canal.
5. A continuación, seleccione las emisiones apropiadas en el menú desplegable bajo el primer espejo dicroico.
6. A continuación, en 'A1plus Compact GUI' ventana, haga clic en 'Ch. Series' para configurar la serie de canales de línea, que configura si los láseres utilizados se disparará en la muestra simultáneamente o secuencialmente. (Aquí, se eligieron pasadas secuenciales, comenzando con el canal 1, seguido por el canal 2, luego 4).
7. Después de eso, comience a escanear haciendo clic en el icono ' Punta deflecha' en la parte superior. En este punto mientras la imagen está en vivo, bajo 'A1plus Compact GUI' ventana, haga clic en la escala deslizante y modificar el tamaño del agujero para asegurar la limitación de la luz de enfoque. (Aquí, se utilizó el ajuste más bajo disponible (0,5).
8. A continuación, ajuste los ajustes 'alto voltaje' y 'offset' bajo cada láser a los niveles apropiados, mediante el uso de las escalas deslizantes para permitir la detección de la tinción específica mientras se limita cualquier posible tinción de fondo. Si hay disponible una muestra de tinción positiva, comience por tomar imágenes de esta muestra para cada canal para asegurarse de que los ajustes del láser producen proporciones óptimas de señal a ruido.
   Precaución: la alta intensidad del láser durante períodos prolongados puede causar fotoblanqueo.
9. Después de establecer los valores óptimos de HV y desplazamiento para cada láser, haga clic en la pestaña 'ND Acquisition' y luego seleccione el icono 'Z' para configurar los parámetros para la serie z. A continuación, mientras se adquiere una imagen en vivo de la muestra, primero establezca la parte inferior encontrando la parte inferior de la imagen y haciendo clic en el botón 'inferior' luego encontrar la posición superior de la muestra y haga clic en el botón 'superior'. Establezca el tamaño del paso escribiendo específicamente el tamaño de paso preferido en el valor de m para cada paso o especificando cuántos pasos totales se necesitan.
10. Una vez establecidos los parámetros de la serie z, seleccione la resolución de tamaño/píxel deseada de la imagen. Para ello, haga clic en la ventana 'A1plus Compact GUI' y debajo del icono 'size' seleccione la resolución deseada. Para disminuir el ruido de la imagen, se puede seleccionar el menú desplegable junto al símbolo 'á' para promediar el número seleccionado de imágenes.
11. Ahora, haga clic en la pestaña'Ejecutar ahora' en el menú 'Nd Acquisition' para comenzar a tomar imágenes de la muestra.
12. Una vez completada la imagen, guarde la imagen haciendo clic en 'Archivo', luego 'Guardar como', que exportará el archivo de imagen con la extensión '.nd2'. Por último, repita el proceso para cada una de las otras muestras.