Microscopía de Fluorescencia Confocal: Una Técnica para Determinar la Localización de Proteínas en Fibroblastos de Ratón

La microscopía de fluorescencia confocal es una técnica de imagen especializada para la localización de una proteína o antígeno de interés en una muestra de célula o tejido mediante el marcaje del antígeno con un tinte fluorescente conjugado con anticuerpos y la detección de la señal fluorescente. Ofrece una mayor resolución espacial que la microscopía de fluorescencia de campo amplio, con la ayuda de dos orificios colocados en los planos focales de la lente del objetivo, lo que le da el nombre de confocal. Permite a los usuarios visualizar la tinción a nivel subcelular, como la diferenciación entre la tinción de la membrana superficial y la tinción intracelular.

Un microscopio confocal sigue un principio básico similar al de un microscopio de fluorescencia clásico. El haz de una fuente de luz, generalmente un láser para confocal, es reflejado por un espejo dicroico y enfocado por una lente objetivo en la muestra. Esta luz excita los fluoróforos para que emitan una longitud de onda diferente, que viaja de regreso a través de la lente del objetivo y el espejo dicroico a una cámara o ocular.

La resolución mejorada de un microscopio confocal se debe principalmente a la presencia de dos orificios, que son orificios muy pequeños para que la luz pase a través de ellos en las trayectorias de excitación y emisión de luz. Los orificios están colocados estratégicamente en el plano focal de la lente del objetivo. Ahora, cambiemos a un esquema de vista lateral de la disposición del microscopio para revisar la trayectoria de la luz. Después de pasar a través del orificio de excitación, el haz de luz de excitación tiene el efecto de originarse en un punto focal, lo que permite que la lente del objetivo también enfoque la luz en un punto de la muestra. El haz de emisión de este punto focal converge en el orificio de emisión, lo que le permite pasar. Ahora, durante la excitación, los fluoróforos dentro de la trayectoria de la luz, por encima y por debajo del punto focal, también se excitan ligeramente. Mientras que la luz de emisión que se origina en el punto focal pasa a través del agujero de alfiler, las emisiones de los puntos desenfocados convergen antes o después del agujero de emisión, y por lo tanto se bloquean, lo que resulta en una fluorescencia de fondo reducida.

El ciclo de excitación-emisión-detección debe repetirse para cada punto de imagen en la región de interés, lo que se puede hacer de diferentes maneras. Por ejemplo, el escaneo láser confocal utiliza espejos de escaneo de galvanómetro, que desvían la luz de excitación en diferentes ángulos. Por lo tanto, barre el haz de luz a través de la muestra en el plano XY. El disco giratorio confocal utiliza un disco con una matriz de orificios, que gira para cambiar la disposición de los orificios. Esto permite a los usuarios iluminar múltiples puntos pequeños de imagen en la muestra cada vez, cubriendo gradualmente toda el área a medida que gira el disco. Como resultado de los agujeros de alfiler, la imagen XY en el detector representa un plano Z estrecho. Por lo tanto, las imágenes se pueden recopilar de una serie de planos Z consecutivos, a menudo denominados pila Z. A partir de estas imágenes, un software adecuado puede generar una representación en 3D del patrón de señal de fluorescencia en la muestra.

En este protocolo, observará la inmunotinción de fibroblastos de ratón, seguida de imágenes en un microscopio confocal para visualizar diferencialmente una proteína de la superficie celular y una proteína lisosomal.

Para comenzar, utilizando técnicas estériles, resuspenda las células de interés en 500 microlitros de medio de crecimiento por pocillo y luego siembrójelas en los pocillos de un portaobjetos de cámara de cuatro pocillos. Aquí, estamos utilizando fibroblastos de ratón que fueron transfectados para expresar la molécula presentadora de antígeno, CD1d. Para permitir que las células se adhieran al vidrio, coloque el portaobjetos de la cámara en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados e incube durante la noche. Por la mañana, aspire los medios de cada pocillo y luego lave las células una vez con 500 microlitros de PBS durante unos segundos.

Para fijar las celdas, agregue 500 microlitros de solución de paraformaldehído al 1% en cada pocillo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, recoja el paraformaldehído en un contenedor de desechos líquidos peligrosos apropiado y luego elimine cualquier resto del fijador lavando las celdas tres veces con PBS durante unos segundos.

Para permitir la penetración de los anticuerpos en las células, añadir 500 microlitros de tampón de permeabilización a cada pocillo e incubar en el banco durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la permeabilización, lavar las células brevemente tres veces con 500 microlitros de PBS. A continuación, añada 500 microlitros de tampón de bloqueo a cada pocillo e incube durante una hora a cuatro grados centígrados para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos.

Prepare los anticuerpos primarios, anti-CD1d y anti-LAMP-1, en concentraciones de trabajo adecuadas. A continuación, aspire el tampón de los pocillos y cubra las células de cada pocillo con 500 microlitros de solución de anticuerpos primarios diluidos y, a continuación, incube el portaobjetos sobre una superficie plana durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, diluya los anticuerpos secundarios, en este caso un anticuerpo anti-ratón y anti-rata con marcas fluorescentes distintas, en tampón de bloqueo a concentraciones de trabajo adecuadas. A continuación, aspire la solución de anticuerpos primarios de los pocillos y luego lave las células cuatro veces con 500 microlitros de PBS. A continuación, añada 500 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios diluidos a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad. Después de la incubación, aspire la solución de anticuerpos secundarios y lave los pocillos cuatro veces con 500 microlitros de PBS para eliminar cualquier anticuerpo secundario no unido.

Para montar las muestras después del lavado final, separe y retire con cuidado las cámaras del portaobjetos. Para eliminar el PBS residual, sostenga el portaobjetos en ángulo sobre una toallita delicada y elimine el líquido de los bordes sin tocar las celdas. Una vez eliminado el exceso de PBS, se añade una gota de medio de montaje antidecoloración, que contenga el DAPI de tinción nuclear, en cada sección de las células. A continuación, tome un cubreobjetos de 20 por 60 milímetros y, con las yemas de los dedos, comience a bajar el cubreobjetos lentamente en cada borde, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas sobre las celdas. Limpie cualquier medio de montaje adicional en las guías con una toallita de trabajo delicada y guarde las guías en la oscuridad a temperatura ambiente hasta por una semana.

Para comenzar a obtener imágenes de las celdas, primero haga clic en el icono del software NIS en el escritorio. Una vez en la ventana de control, haga clic en la pestaña TiPad en la parte superior y elija el objetivo deseado para la imagen. A continuación, cargue la diapositiva con celdas en el escenario y céntrela debajo de la lente. A continuación, en la pestaña A1plus Compact GUI junto a la pestaña TiPad, configure los láseres apropiados para los fluoróforos utilizados. Haga clic en el símbolo del engranaje para abrir el menú de configuración de tinte y espectral. Una vez que el menú de configuración de tinte y espectral esté abierto, seleccione los canales necesarios y configure el láser para cada canal. A continuación, seleccione las emisiones adecuadas en el menú desplegable situado debajo del primer espejo dicroico. A continuación, en la ventana de la GUI compacta A1plus, haga clic en Ch.Series para configurar la serie de canales de línea, que establece si los láseres utilizados dispararán sobre la muestra de forma simultánea o secuencial.

Después de eso, comience a escanear haciendo clic en el icono de la punta de la flecha en la parte superior. En este punto, mientras la imagen está en vivo, en la ventana de A1plus Compact GUI, haga clic en la escala deslizante y modifique el tamaño del agujero para asegurarse de limitar la luz desenfocada. A continuación, ajuste la configuración de alto voltaje y compensación debajo de cada láser a los niveles apropiados mediante el uso de las escalas deslizantes para permitir la detección de la tinción específica y limitar cualquier posible tinción de fondo. Si se dispone de una muestra de tinción positiva, comience por obtener imágenes de esta muestra para cada canal para asegurarse de que los ajustes del láser produzcan una relación señal-ruido óptima. Después de establecer los valores óptimos de HV y offset para cada láser, haga clic en la pestaña ND Acquisition y, a continuación, seleccione el icono Z para configurar los parámetros de la serie z.

A continuación, mientras adquiere una imagen en vivo de la muestra, primero establezca la parte inferior encontrando la parte inferior de la imagen y haciendo clic en el botón inferior. A continuación, busque la posición superior de la muestra y haga clic en el botón superior. Establezca el tamaño del paso escribiendo específicamente el tamaño de paso preferido en micras para cada paso o especificando cuántos pasos totales se necesitan. Para seleccionar el tamaño/resolución de píxeles deseado de la imagen, haga clic en la ventana de la GUI de Aiplus Compact y, debajo del icono de tamaño, seleccione la resolución deseada.

Para disminuir el ruido de la imagen, puede seleccionar el menú desplegable junto al símbolo theta para promediar el número seleccionado de imágenes. Después de esto, haga clic en la pestaña Ejecutar ahora en el menú Adquisición de ND para comenzar a crear imágenes de la muestra. Una vez completada la imagen, guarde la imagen haciendo clic en archivo y, a continuación, en Guardar como, lo que exportará el archivo de imagen con la extensión dot-nd2. Finalmente, repita el proceso para cada una de las otras muestras.

En este experimento, los fibroblastos de ratón que expresan el gen de la glicoproteína de superficie CD1d se fijaron, inmunotiñeron y obtuvieron imágenes en un microscopio confocal. Esta imagen muestra una sola sección de una pila Z con un aumento de 40X, donde CD1d está teñido de rojo. La muestra se cubrió con LAMP-1, un marcador lisosomal, en color verde. Se utilizó la tinción nuclear DAPI para mostrar los núcleos de las células.

En una imagen compuesta en la que se fusionan los tres canales diferentes, la apariencia de amarillo es el resultado de la superposición de los canales rojo y verde, e indica un área donde CD1d y LAMP-1 se localizan conjuntamente en los lisosomas. Las áreas en las que solo hay un color indican la presencia de CD1d o LAMP-1 sin colocalización. Esta imagen muestra una representación en 3D de las celdas construidas a partir de imágenes capturadas en la pila z y este método permitió la construcción de una vista lateral de este grupo de celdas. La siguiente imagen muestra un corte de la pila z con un aumento de 100X, lo que demuestra los patrones de expresión de estas dos proteínas con mayor detalle. El cuadro delineado de color rosa en el lado derecho de la imagen muestra la sección transversal de la coordenada x designada por la línea rosa de la imagen, que representa la vista lateral en la línea rosa. De manera similar, el cuadro con contorno azul en la parte inferior de la imagen muestra la sección transversal de la coordenada y designada por la línea azul en la imagen, que representa la vista frontal en la línea azul. La representación en 3D de la imagen de la pila z permite a los usuarios ver la imagen en 3D, visualizando todos los planos x, y y z. Esto se puede utilizar para estudiar la colocalización de las diferentes tinciones en diferentes regiones dentro de la célula.