5.10: Análisis del ciclo celular: Evaluación de la proliferación de células T CD4 y CD8 después de su estimulación mediante tinción CFSE y citometría de flujo

1. Preparación

1. Antes de comenzar, ponte guantes de laboratorio y la ropa protectora adecuada.
2. Esterilice todas las herramientas de disección, primero con un detergente y luego con 70% de etanol y luego seque bien.
3. Preparar 50 ml de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene un 2% de suero de becerro fetal (FCS).

2. Disección

1. Usando un sistema de administración de dióxido de carbono, eutanasia el ratón por hipoxia. Asegure el ratón eutanasiado en una placa de disección en posición supina y realice una laparotomía longitudinal utilizando tijeras y fórceps.
2. Usando fórceps, mueva los intestinos y el estómago en el lado derecho del abdomen para exponer el estómago y el bazo. El bazo está unido al estómago.
3. Usando fórceps separa cuidadosamente el bazo del estómago y colócalo en la placa Petri que contiene 5 ml de HBSS 2% FCS.

3. Aislamiento celular inmune

1. Coloque el bazo sobre un colador de células de 40 m sobre la misma placa De Petri. Aplastar el bazo con un émbolo para disociarlo.
2. Transfiera el bazo disociado y el líquido a un tubo centrífugo de 15 ml.
3. Centrifugar el tubo a 370 x g durante 7 min a 10oC y desechar el sobrenadante evitando el pellet.
4. Resuspenda el pellet en 2 ml de acetato de potasio para lisar los eritrocitos. Espere 2 minutos y luego suba el volumen hasta 15 ml usando HBSS 2% FCS.
5. Centrifugar el tubo de nuevo a 370 x g durante 7 min a 10oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 5 ml de HBSS 2% FCS.
6. Cuente las células usando un ensayo de tinción azul trypan y ajuste la concentración celular final a 10⁷ celdas/ml usando un volumen apropiado de HBSS 2% FCS.

4. Tinción CFSE y Estimulación de células T

1. Distribuir 10⁷ células/tubo aislados en 4 tubos (tubos de 15 ml, etiquetados 1 a 4)

Para la mayoría de los estudios de inmunología, la medición de la proliferación de células inmunitarias es un paso clave y el método basado en colorantes fluorescentes CFSE se usa comúnmente. La división celular adecuada es importante para las células inmunitarias, ya que regula tanto los niveles como la especificidad de una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, las células T proliferan para identificar y destruir las células cancerosas y las células B se dividen para producir anticuerpos específicos. La premisa general del ensayo CSFE consiste en teñir las células con el colorante verde fluorescente CFSE, que entra en las células vivas y se une de forma estable a las proteínas de su interior, lo que da lugar a un marcaje permanente. Como resultado, cuando la célula madre que contiene el colorante se divide, cada célula hija obtiene la mitad de la fluorescencia de la célula madre.

Este proceso continúa en las divisiones posteriores con la intensidad del tinte disminuyendo progresivamente con cada división. En el punto final deseado, la intensidad de fluorescencia de cada célula se mide mediante citometría de flujo. Estos datos se utilizan para cuantificar el número y el patrón de divisiones por las que han pasado las células. Como se muestra aquí, la población de células con la fluorescencia más alta pertenece a la generación principal. El segundo más alto pertenece a la segunda generación y así sucesivamente. El número de picos determina el número de divisiones celulares.

Además, si se utilizan células inmunitarias primarias, las poblaciones celulares específicas, como las células T, por ejemplo, pueden marcarse con un colorante de fluorescencia de diferente color junto con CFSE, e identificarse simultáneamente mediante citometría de flujo multicolor. Los nuevos datos se pueden trazar en el mismo gráfico, que ahora muestra la subpoblación de células T con diferentes intensidades de tinción de CFSE, mediante las cuales se puede analizar específicamente la tasa de proliferación de las células T. Este vídeo muestra el protocolo para la tinción de CFSE de los esplenocitos de ratón, que se estimulan con un anticuerpo anti-CD3. A esto le sigue la tinción para marcar las células T y la citometría de flujo para rastrear su proliferación celular.

Para empezar, póngase ropa protectora adecuada y guantes de laboratorio. A continuación, lave un par de pinzas y unas tijeras de disección primero con un detergente y luego con etanol al 70% y luego séquelas con una toalla de papel limpia. Prepare 50 mililitros de la Solución Salina Equilibrada de Hank's, o HBSS, con una concentración del 2% de suero fetal de ternero, o FCS, combinando un mililitro de FCS con 49 mililitros de HBSS en un tubo de 50 mililitros. Mezcle pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces. A continuación, aísle las células del bazo de ratón, como se demuestra en el protocolo de vídeo para el aislamiento de FACS de linfocitos B esplénicos.

Etiquete cuatro tubos de 15 mililitros del uno al cuatro y agregue uno por 10 a la séptima célula aislada del bazo. A continuación, añade tres mililitros de HBSS 2% FCS a cada tubo. A continuación, pipetee un microlitro de cinco ésteres de carboxifluoresceína succinimidilo micromolar, o CFSE, en cada tubo. Incubar los tubos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante 10 minutos. Las células de los tubos uno y dos no serán estimuladas. Se utilizarán para revelar el nivel basal de proliferación de las células T esplénicas CD4 y CD8.

Pipetee 10 mililitros de HBSS 2% FCS en estos tubos. Los tubos tres y cuatro serán estimulados por el anticuerpo anti-CD3 con el fin de observar los efectos sobre el ciclo celular. Añadir 10 mililitros de HBSS 2% FCS y anticuerpo anti-CD3 a una concentración final de 2,5 microgramos por mililitro a los tubos tres y cuatro. A continuación, centrifuga todos los tubos a 370 x g durante siete minutos a 10 grados centígrados. Deseche los sobrenadantes. Vuelva a suspender los gránulos en dos mililitros de HBSS 2% FCS y pipetee las soluciones resultantes en pocillos separados en una placa de seis pocillos. Etiquete cuidadosamente la placa del uno al cuatro para realizar un seguimiento de las identidades de las muestras. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante tres días.

En el tercer día, agregue dos mililitros de HBSS 2% FCS a los pocillos uno y tres, que deben contener las células de los tubos uno y tres. Pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente y luego transfiera las muestras a tubos FACS de cinco mililitros etiquetados. Vuelva a colocar la placa de seis pocillos en la incubadora. Estas células restantes de los pozos dos y cuatro se analizarán el quinto día para investigar los efectos a largo plazo de la estimulación en el ciclo celular. Centrifugar los tubos a 370 x g durante siete minutos a 10 grados centígrados y luego desechar los sobrenadantes. Ahora, agregue 100 microlitros de mezcla de anticuerpos a cada tubo. Incubar los tubos durante 20 minutos en hielo en la oscuridad. A continuación, agregue un mililitro de HBSS 2% FCS a cada tubo y centrifugue los tubos a 370 x g durante siete minutos a 10 grados centígrados. Deseche los sobrenadantes. Vuelva a suspender los pellets en 200 mililitros de HBSS 2% FCS y mezcle bien. Transfiera los gránulos resuspendidos a nuevos tubos FACS etiquetados.

A continuación, evalúe la proliferación de células T mediante citometría de flujo, como se muestra en el protocolo FACS. Conecte las células para seleccionar las células linfoides CD3 positivas y para distinguir las células CD4 positivas y las CD8 positivas, y registre los datos de los tubos uno y tres. En el quinto día, repita el proceso de tinción celular con las células de los dos pocillos restantes de la placa de seis pocillos.

Analizaremos los efectos de la estimulación de CD3 sobre el ciclo celular de las células CD4 y CD8 positivas a los tres días y a los cinco días post-estimulación. Para empezar, haz clic en el icono de FlowJo y arrastra tus archivos a la ventana Todas las muestras. Haga doble clic en el archivo de las células no estimuladas recolectadas en el tercer día para mostrar un diagrama de puntos con dispersión hacia adelante en el eje y y dispersión lateral en el eje x. Haga clic en el polígono para rodear las poblaciones de linfocitos en función de su morfología. En la ventana de identificación de subpoblaciones, asigne un nombre a los linfocitos de la población y haga clic en Aceptar. A continuación, haga doble clic en la población encerrada en un círculo y, en la nueva ventana, seleccione Thy1.2 en el eje y y CD3 en el eje x. A continuación, haga clic en el polígono para rodear las celdas dobles positivas CD3 y Thy1.2. En la nueva ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a las células T de población y haga clic en Aceptar. A continuación, haga doble clic en la población encerrada en un círculo. En la nueva ventana, seleccione CD4 en el eje y y CD8 en el eje x. A continuación, haga clic en el polígono para encerrar en un círculo la población CD4 positiva. En la nueva ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a las células T CD4 de la población y haga clic en Aceptar. Ahora, haga clic en el polígono para rodear la población CD8 positiva. En la nueva ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a las células T CD8 de la población y haga clic en Aceptar. Repita estos pasos con los demás archivos.

Para determinar las frecuencias de las células que se dividen y las que no se dividen, primero, visualice las poblaciones de células haciendo clic en Editor de diseño. A continuación, arrastre las células T CD4 y las células T CD8 de cada uno de los cuatro tubos a la ventana Todas las muestras. Aparecerán gráficos que representan sus poblaciones. Para cada tubo, haga doble clic en el diagrama de puntos para las células T CD8 y seleccione Histograma en Definición de gráfico para visualizar los resultados. Seleccione CFSE como parámetro para comparar las poblaciones de células estimuladas frente a las no estimuladas en cada punto de tiempo. Las células que no se dividen mantienen niveles más altos de CFSE, mientras que las células en proliferación dividen el contenido de CFSE en las células que se dividen.

Ahora, mientras presiona la tecla Shift, haga doble clic en el histograma. En la nueva ventana, haga clic en rango y seleccione el rango de CFSE correspondiente al pico más alto. En la ventana de identificación de la subpoblación, asigne a la población el nombre de las células T CD8 no dividibles y etiquete la población como células CD8 en división. Ahora, repita para seleccionar las células T CD4 que se dividen y no se dividen en cada tubo. Para examinar la frecuencia de división de las células CD3 positivas, haga clic en Editor de tablas. A continuación, arrastre las poblaciones de interés, División de células T CD8 y División de células T CD4, a la tabla. En el menú Estadística, seleccione Frecuencia de células T. A continuación, haga clic en Crear tabla para mostrar la frecuencia en una nueva tabla.