Análisis del ciclo celular: Evaluación de la proliferación de células T CD4 y CD8 después de su estimulación mediante tinción CFSE y citometría de flujo

1. Preparación

1. Antes de comenzar, ponte guantes de laboratorio y la ropa protectora adecuada.
2. Esterilice todas las herramientas de disección, primero con un detergente y luego con 70% de etanol y luego seque bien.
3. Preparar 50 ml de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene un 2% de suero de becerro fetal (FCS).

2. Disección

1. Usando un sistema de administración de dióxido de carbono, eutanasia el ratón por hipoxia. Asegure el ratón eutanasiado en una placa de disección en posición supina y realice una laparotomía longitudinal utilizando tijeras y fórceps.
2. Usando fórceps, mueva los intestinos y el estómago en el lado derecho del abdomen para exponer el estómago y el bazo. El bazo está unido al estómago.
3. Usando fórceps separa cuidadosamente el bazo del estómago y colócalo en la placa Petri que contiene 5 ml de HBSS 2% FCS.

3. Aislamiento celular inmune

1. Coloque el bazo sobre un colador de células de 40 m sobre la misma placa De Petri. Aplastar el bazo con un émbolo para disociarlo.
2. Transfiera el bazo disociado y el líquido a un tubo centrífugo de 15 ml.
3. Centrifugar el tubo a 370 x g durante 7 min a 10oC y desechar el sobrenadante evitando el pellet.
4. Resuspenda el pellet en 2 ml de acetato de potasio para lisar los eritrocitos. Espere 2 minutos y luego suba el volumen hasta 15 ml usando HBSS 2% FCS.
5. Centrifugar el tubo de nuevo a 370 x g durante 7 min a 10oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 5 ml de HBSS 2% FCS.
6. Cuente las células usando un ensayo de tinción azul trypan y ajuste la concentración celular final a 10⁷ celdas/ml usando un volumen apropiado de HBSS 2% FCS.

4. Tinción CFSE y Estimulación de células T

1. Distribuir 10⁷ células/tubo aislados en 4 tubos (tubos de 15 ml, etiquetados 1 a 4)