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Advanced Biology

Análisis del ciclo celular: Evaluación de la proliferación de células T CD4 y CD8 después de su estimulación mediante tinción CFSE y citometría de flujo

Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation After Stimulation Using CFSE Staining and Flow Cytometry

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Immunology

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Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation After Stimulation Using CFSE Staining and Flow Cytometry

5.9: Immunoprecipitation-Based Techniques: Purification of Endogenous Proteins Using Agarose Beads

5.11: Adoptive Cell Transfer: Introducing Donor Mouse Splenocytes to a Host Mouse and Assessing Success via FACS

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10:57 min

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April 30, 2023

Overview

Fuente: Perchet Thibaut^1,2,3, Meunier Sylvain^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
¹ Unidad de Linfinfoesis, Departamento de Inmunología, Instituto Pasteur, París, Francia
² INSERM U1223, París, Francia
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, París, Francia
⁴ Flow Cytometry Platfrom, Citometría y Biomarcadores UtechS, Centro de Ciencias Traslacionales, Instituto Pasteur, París, Francia

El ciclo celular es un proceso universal de vida. Durante el ciclo celular, una célula sufre varias modificaciones para dividir en dos células hijas. Este mecanismo se produce a lo largo de la vida de un organismo en respuesta a sus necesidades. Las divisiones celulares y el desarrollo embrionario producen un organismo completo a partir de un cigoto unicelular. Durante la edad adulta, el ciclo celular es fundamental para muchos procesos biológicos críticos, como reparaciones de tejidos.

Los mecanismos de división celular son eventos estrechamente controlados donde la célula sufre modificaciones escalonadas antes de la división final. Las celdas que aún no están en el ciclo se describen como en la fase de brecha 0 (G₀). Durante esta etapa la célula se considera en reposo. Cuando la célula comienza a ciclo, se reconocen cuatro fases distintas: Brecha 1 (G₁), Síntesis (S), Brecha 2 (G₂₎y Mitosis (M). La fase G₁ es un punto de control de los recursos necesarios por la célula para la síntesis de ADN. Luego, se produce la fase S, y se inicia la replicación de ADN, seguida de la interfase G_2, otro punto de control que controla todos los elementos necesarios para que la célula se divida. Finalmente, la célula ingresa mitosis y se divide en dos células hijas.

La división celular es un parámetro muy informativo en muchos sistemas biológicos diferentes. En el campo de la inmunología, el análisis de la proliferación de leucocitos puede indicar el mecanismo de la respuesta inmunitaria. Otros dominios de investigación también se basan en el análisis del ciclo celular. Por ejemplo, el análisis del ciclo celular durante el desarrollo del tumor ha mejorado nuestra comprensión del cáncer.

Muchos colorantes fluorescentes ahora están disponibles para el seguimiento de la proliferación celular. Estos tendededes difieren en sus propiedades químicas y espectrales. Existen dos clases diferentes de colorantes: los colorantes proteicos se combinan permanentemente con las proteínas mediante la formación de un enlace covalente, y los colorantes de membrana se intercalan de forma estable dentro de las membranas celulares a través de fuertes asociaciones hidrofóbicas. Los estudios in vitro e in vivo de la proliferación de células inmunitarias por citometría de flujo se encuentran entre las aplicaciones más comunes de ambas clases de destenciones de seguimiento celular (1, 2).

CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) es un tinte fluorescente que marca las células divisorias. Inicialmente, todas las células reciben la misma cantidad de tinte; dividiendo las células uniformemente dividir el tinte que recibieron entre sus dos células hijas. Por lo tanto, el ciclo celular puede ser seguido por la disminución progresiva de la intensidad del tinte en las células. La tinción CFSE es seguida por la citometría de flujo multiparamétrica convencional, una tecnología de alto rendimiento basada en fluorescencia que permite la caracterización fenotípica y funcional de las células en función de su grado de tinción CFSE (3).

En el siguiente experimento, evaluamos la proliferación de células CD4⁺ y CD8⁺ T in vitro,después de la estimulación CD3, utilizando tinción CFSE y citometría de flujo.

Procedure

1. Preparación

Antes de comenzar, ponte guantes de laboratorio y la ropa protectora adecuada.
Esterilice todas las herramientas de disección, primero con un detergente y luego con 70% de etanol y luego seque bien.
Preparar 50 ml de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene un 2% de suero de becerro fetal (FCS).

2. Disección

Usando un sistema de administración de dióxido de carbono, eutanasia el ratón por hipoxia. Asegure el ratón eutanasiado en una placa de disección en posición supina y realice una laparotomía longitudinal utilizando tijeras y fórceps.
Usando fórceps, mueva los intestinos y el estómago en el lado derecho del abdomen para exponer el estómago y el bazo. El bazo está unido al estómago.
Usando fórceps separa cuidadosamente el bazo del estómago y colócalo en la placa Petri que contiene 5 ml de HBSS 2% FCS.

3. Aislamiento celular inmune

Coloque el bazo sobre un colador de células de 40 m sobre la misma placa De Petri. Aplastar el bazo con un émbolo para disociarlo.
Transfiera el bazo disociado y el líquido a un tubo centrífugo de 15 ml.
Centrifugar el tubo a 370 x g durante 7 min a 10oC y desechar el sobrenadante evitando el pellet.
Resuspenda el pellet en 2 ml de acetato de potasio para lisar los eritrocitos. Espere 2 minutos y luego suba el volumen hasta 15 ml usando HBSS 2% FCS.
Centrifugar el tubo de nuevo a 370 x g durante 7 min a 10oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 5 ml de HBSS 2% FCS.
Cuente las células usando un ensayo de tinción azul trypan y ajuste la concentración celular final a 10⁷celdas/ml usando un volumen apropiado de HBSS 2% FCS.

4. Tinción CFSE y Estimulación de células T

Distribuir 10⁷ células/tubo aislados en 4 tubos (tubos de 15 ml, etiquetados 1 a 4)
Añadir 3 ml de HBSS 2%FCS a cada tubo.
Añadir 1 l de CSFE en cada tubo (concentración final de 5 m).
Incubar los tubos a 37oC en una incubadora de_CO2 al 5% durante 10 min.
En los tubos 3 y 4, añadir 12 ml de anticuerpo HBSS 2% FCS + anti-CD3 a una concentración final de 2,5 g/ml. Los tubos 3 y 4 se estimulan utilizando anticuerpos anti-CD3, para observar el efecto en el ciclo celular.
En los tubos 1 y 2 añadir 12 mL de HBSS 2% FCS. Las células de los tubos 1 y 2 no serán estimuladas.
Centrifugar todos los tubos a 370 x g durante 7 min a 10oC. Descarta los supernatantes.
Resuspenda los pellets en 2 ml de HBSS 2%FCS.
Transfiera las soluciones resultantes a pozos separados en una placa de 6 pocillos.
Incubar las células a 37oC, 5%_CO2 durante 3 días.

5. Tinción celular

En el día 3, añadir 2 mL HBSS 2%FCS en los pozos 1 y 3.
Pipeta vigorosamente y transfiera las muestras a tubos FACS de 5 ml.
Continúe incubando las células restantes de los pozos 2-4 a 37oC, 5% CO_2. Se analizarán el día 5 para investigar los efectos a largo plazo de la estimulación en el ciclo celular.
Centrifugar los tubos a 370 x g durante 7 min a 10oC. Descarta los supernatantes.
Añadir 100 l de mezcla de anticuerpos (ver Tabla 1) a cada tubo.

Anticuerpo	Fluorocromo	Dilución
CD3	Pacific Blue	1/100
CD4	BV786	1/1600
CD8	Pe	1/400
Thy1.2	BV605	1/400

Tabla 1: Composición de mezcla de anticuerpos. Cuatro preparaciones de cócteles de anticuerpos utilizando conjugados concentrados de anticuerpos fluorescentes y HBSS.

Incubar los tubos durante 20 minutos sobre hielo en la oscuridad.
Añadir 1 ml de HBSS 2%FCS y centrifugar los tubos a 370 x g durante 7 min a 10oC.
Deseche el sobrenadante y resuspenda los gránulos en 200 l de HBSS 2% FCS.
Transfiera los pellets resuspendidos a nuevos tubos FACS etiquetados.
Evalúe la proliferación de células T mediante FACS.
En el día 5, repita el proceso de tinción celular con las células de los dos pozos restantes de la placa de 6 pocillos.

6. Análisis de datos

Abra el software “FlowJo” y arrastre los archivos a la ventana“Todos losejemplos”.
Haga doble clic en el archivo para las celdas no estimuladas recopiladas en el día 3 para mostrar una gráfica de puntos con dispersión hacia delante en el eje Y y dispersión lateral en el eje X.
Haga clic en“Polígono”y cree una estrategia de gating para seleccionar células linfoides, Thy1.2⁺ CD3⁺ células y distinguir CD4⁺ y CD8⁺ células (ver Figura 1).

Figura 1: Estrategia de gaseo. Las células se encerradan primero en función de su morfología (izquierda: FSC-A, SSC-A). Las células T se agaran (medio: CD3, Thy1.2) y se dividen en células CD4⁺ T (naranja) y células CD8⁺ T (azul) (derecha: CD4, CD8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Repita los pasos con otros archivos.
Para determinar las frecuencias de las celdas divisorias y no divisorias, primero visualice las poblaciones de celdas haciendo clic en“Editorde diseño .”
Arrastre las celdas T CD4 y CD8 T de cada uno de los cuatro tubos a la“Ventana de muestra Todo“
Aparecerán gráficos que representan a cada población.
Utilice histograma para visualizar los resultados y seleccione“CFSE”como parámetro para la comparación de los diferentes tubos y las diferentes poblaciones.
Las células no divisorias mantienen niveles más altos de CFSE, mientras que las células que proliferan dividen el contenido de CFSE en células divisorias
Cree una puerta en celdas que no sean divisorias y aplíquela en todos los tubos.
Crea una puerta en las celdas divisorias y aplítala en todos los tubos.
Para examinar la frecuencia de división de celdas CD3+, haga clic en “Editor detablas .”
Arrastre las poblaciones de interés – dividiendo las células T CD8 y dividiendo las células T CD4 – en“Tabla.”
En el menú“Estadística”,seleccione “frecuencia de las celdas T,luego haga clic en“Crear tabla”para revelar la frecuencia en una nueva tabla.
Haga clic en“Crear tabla.” Para revelar los valores de frecuencia, aparezca en una nueva tabla.

Para la mayoría de los estudios de inmunología, la medición de la proliferación de células inmunitarias es un paso clave y el método basado en tintes fluorescentes CFSE se utiliza comúnmente. La división celular adecuada es importante para las células inmunitarias, ya que regula tanto los niveles como la especificidad de una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, las células T proliferan para identificar y matar las células cancerosas y las células B se someten a división celular para producir anticuerpos específicos. La premisa general del ensayo CSFE consiste en manchar las células con el tinte fluorescente verde CFSE, que entra en células vivas y se une de forma estable a las proteínas en su interior, lo que resulta en un etiquetado permanente. Como resultado, cuando la célula madre que contiene el tinte se divide, cada célula hija obtiene la mitad de la fluorescencia de la célula padre.

Este proceso continúa en las divisiones posteriores con la intensidad del tinte disminuyendo progresivamente con cada división. En el punto final deseado, la intensidad de fluorescencia de cada célula se mide por citometría de flujo. Estos datos se utilizan para cuantificar el número y el patrón de divisiones por las que han pasado las celdas. Como se muestra aquí, la población celular con la fluorescencia más alta es de la generación padre. La segunda más alta pertenece a la segunda generación y así sucesivamente. El número de picos determina el número de divisiones de celda.

Además, si se utilizan células inmunitarias primarias, las poblaciones celulares específicas, como las células T, por ejemplo, pueden etiquetarse con un tinte de fluorescencia de diferentes colores junto con CFSE, y se pueden identificar simultáneamente mediante citometría de flujo multicolor. Los nuevos datos se pueden trazar en el mismo gráfico, mostrando ahora la subpoblación de células T con diferentes intensidades de tinción CFSE, mediante la cual se puede analizar específicamente la tasa de proliferación de las células T. Este vídeo demuestra el protocolo para la tinción CFSE de los esplenocitos de ratón, que se estimulan con un anticuerpo anti-CD3. Esto es seguido por la tinción para etiquetar las células T y la citometría de flujo para rastrear su proliferación celular.

Para empezar, ponte ropa protectora adecuada y guantes de laboratorio. A continuación, lave un par de fórceps y diseccione las tijeras primero con un detergente y luego con 70% de etanol y luego séquelos con una toalla de papel limpia. Prepare 50 mililitros de solución sal equilibrada de Hank, o HBSS, con una concentración del 2% de suero de pantorrilla fetal, o FCS, combinando un mililitro de FCS con 49 mililitros de HBSS en un tubo de 50 mililitros. Mezcle pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces. A continuación, aísle las células del bazo del ratón como se muestra en el protocolo de vídeo para el aislamiento FACS de linfocitos B esplénicos.

Etiquete cuatro tubos de 15 mililitros uno a cuatro y agregue una por 10 a la séptima célula aislada del bazo. A continuación, agregue tres mililitros de HBSS 2% FCS a cada tubo. Luego, pipetear un microlitro de cinco micromolares carboxifluoresceína éster de succinimidilo, o CFSE, en cada tubo. Incubar los tubos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante 10 minutos. Las células en los tubos uno y dos no serán estimuladas. Se utilizarán para revelar el nivel basal de proliferación de células T esplénicas CD4 y CD8.

Pipetear 10 mililitros de HBSS 2% FCS en estos tubos. Los tubos tres y cuatro serán estimulados por anticuerpos anti-CD3 para observar los efectos en el ciclo celular. Añadir 10 mililitros de anticuerpos HBSS 2% FCS y anti-CD3 a una concentración final de 2,5 microgramos por mililitro a los tubos tres y cuatro. A continuación, centrifugar todos los tubos a 370 x g durante siete minutos a 10 grados centígrados. Descarta los supernatantes. Resuspenda los pellets en dos mililitros de HBSS 2% FCS y pipetee las soluciones resultantes en pozos separados en una placa de seis pocillos. Etiquete cuidadosamente la placa de uno a cuatro para realizar un seguimiento de las identidades de la muestra. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante tres días.

En el tercer día, agregue dos mililitros de HBSS 2% FCS a los pozos uno y tres, que deben contener las células de los tubos uno y tres. Pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente y luego transferir las muestras en tubos FACS etiquetados de cinco mililitros. Vuelva a colocar la placa de seis pocillos en la incubadora. Estas células restantes de los pozos dos y cuatro se analizarán en el día cinco para investigar los efectos a largo plazo de la estimulación en el ciclo celular. Centrifugar los tubos a 370 x g durante siete minutos a 10 grados centígrados y luego desechar los sobrenatonos. Ahora, agregue 100 microlitros de mezcla de anticuerpos a cada tubo. Incubar los tubos durante 20 minutos sobre hielo en la oscuridad. A continuación, agregue un mililitro de HBSS 2% FCS a cada tubo y centrifugar los tubos a 370 x g durante siete minutos a 10 grados centígrados. Descarta los supernatantes. Vuelva a suspender los pellets en 200 mililitros de HBSS 2% FCS y mezclar bien. Transfiera los pellets resuspendidos a los nuevos tubos FACS etiquetados.

A continuación, evalúe la proliferación de células T mediante la citometría de flujo como se muestra en el protocolo FACS. Acote las células a seleccionar células linfoides CD3 positivas y para distinguir las células CD4 positivas y CD8 positivas, y registre los datos de los tubos uno y tres. En el quinto día, repita el proceso de tinción celular con las células de los dos pozos restantes de la placa de seis pocillos.

Analizaremos los efectos de la estimulación CD3 en el ciclo celular de las células CD4 y CD8-positivas a los tres días y cinco días después de la estimulación. Para comenzar, haga clic en el icono FlowJo y arrastre sus archivos a la ventana Todos los ejemplos. Haga doble clic en el archivo de las celdas no estimuladas recopiladas en el tercer día para mostrar una gráfica de puntos con dispersión hacia delante en el eje Y y dispersión lateral en el eje X. Haga clic en polígono para rodear las poblaciones de linfocitos en función de su morfología. En la ventana de identificación de la subpoblación, asigne un nombre a los linfocitos de población y haga clic en Aceptar. A continuación, haga doble clic en la población en círculos y en la nueva ventana, seleccione Thy1.2 en el eje Y y CD3 en el eje X. Luego, haga clic en polígono para rodear las celdas positivas dobles CD3 y Thy1.2. En la nueva ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a las células T de población y haga clic en Aceptar. A continuación, haga doble clic en la población en círculos. En la nueva ventana, seleccione CD4 en el eje Y y CD8 en el eje X. A continuación, haga clic en polígono para rodear la población de CD4 positivos. En la nueva ventana de identificación de subpoblación, asigne a la población el nombre CD4 T-Cells y haga clic en Aceptar. Ahora, haga clic en polígono para rodear la población con cd8 positivos. En la nueva ventana de identificación de subpoblación, asigne a la población el nombre CD8 T-Cells y haga clic en Aceptar. Repita estos pasos con los otros archivos.

Para determinar las frecuencias de las celdas divisorias y no divisorias, primero, visualice las poblaciones de celdas haciendo clic en Editor de diseño. A continuación, arrastre las células T CD4 y las células T CD8 de cada uno de los cuatro tubos a la ventana Toda la muestra. Aparecerán gráficos que representan sus poblaciones. Para cada tubo, haga doble clic en la gráfica de puntos para las celdas T CD8 y seleccione Histograma en Definición de gráfico para visualizar los resultados. Seleccione CFSE como parámetro para comparar las poblaciones de células estimuladas frente a las no estimuladas en cada punto de tiempo. Las células no divisorias mantienen niveles más altos de CFSE, mientras que las células que proliferan dividen el contenido de CFSE en células divisorias.

Ahora, mientras presiona la tecla Mayús, haga doble clic en el histograma. En la nueva ventana, haga clic en el rango y seleccione el rango de CFSE correspondiente al pico más alto. En la ventana de identificación de subpoblación, asigne a la población el nombre Células T CD8 no divisorias y etiquete la población Dividiendo células CD8. Ahora, repita para seleccionar las células T CD4 divisorias y no divisoras en cada tubo. Para examinar la frecuencia de división de celdas cd3 positivas, haga clic en Editor de tablas. A continuación, arrastre las poblaciones de interés, Dividiendo LAS Células T CD8 y Dividiendo las Células T CD4, en la tabla. En el menú Estadística, seleccione Frecuencia de celdas T. A continuación, haga clic en Crear tabla para mostrar la frecuencia en una nueva tabla.

Results

En este experimento, seguimos la proliferación de células esplénicas CD4⁺ y CD8⁺ T en cultivo in vitro. Después de 3 días, no vimos fuerte proliferación en las células CD4⁺ y CD8⁺ T con o sin estimulación. Esto se puede ver en el panel superior de la Figura 2 donde los picos de CSFE no están disminuyendo. Sin embargo, después de 5 días, comenzamos a ver proliferación en ambas poblaciones, que es evidente por la disminución de los picos de CSFE (paneles inferiores, Figura 2). La tinción CFSE, demuestra claramente que las células CD4⁺ y CD8⁺ T se estaban dividiendo más después de la estimulación. Además, los células CD8⁺ T parecían ser ligeramente más proliferativos que los células CD4⁺ T después de 5 días de estimulación.

Figura 2: CD4 versus la proliferación de células T CD8. Proliferación de células T en el día 3 (panel superior) y el día 5 (panel inferior). El ciclo celular se compara entre las células T CD4 y CD8 con o sin estimulación en dos días diferentes. Las células T CD4 y CD8 proliferan más cuando se estimulan. Cd8 estimularon los células T proliferan más de que los células T estimuladas por CD4 en el día 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Applications and Summary

Los ensayos de proliferación se utilizan a menudo en diferentes campos, como la inmunología, para determinar el grado de activación de las células. También se realiza en el diagnóstico oncológico para determinar la agresividad tumoral en pacientes. La tinción CFSE es una técnica útil para seguir la proliferación de las poblaciones de células inmunitarias a lo largo del tiempo. Otros métodos permiten la caracterización del ciclo celular. BrdU, un equivalente de CFSE se incorpora sólo en células divisorias. El modelo reciente de ratón Fucci incluso permite la detección de fases de ciclo celular, sin tinción adicional.

References

Lyons, A. B. and Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171 (1): 131-37, (1994).
Lyons, A. B. Analyzing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 147-154, (2000).
Quah, B. J., Warren H. S., and Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9): 2049-56, (2007).

Transcript

For most immunology studies, measuring proliferation of immune cells is a key step and the CFSE fluorescent dye-based method is commonly used. Proper cell division is important for immune cells since it regulates both levels and specificity of an immune response. For example, T-cells proliferate to identify and kill cancer cells and B-cells undergo cell division to produce specific antibodies. The overall premise of the CSFE assay involves staining the cells with the green fluorescent dye CFSE, which enters live cells and stably binds to the proteins inside, resulting in permanent labeling. As a result, when the dye-containing parent cell divides, each daughter cell gets half the fluorescence from the parent cell.

This process continues in the subsequent divisions with the dye intensity progressively decreasing with each division. At the desired endpoint, the fluorescence intensity of each cell is measured by flow cytometry. This data is then used to quantify the number and pattern of divisions the cells have gone through. As shown here, the cell population with the highest fluorescence are from the parent generation. The second highest belongs to the second generation and so on. The number of peaks determines the number of cell divisions.

In addition, if primary immune cells are used, specific cell populations, like the T-cells for example, can be labeled with a different colored fluorescence dye along with CFSE, and simultaneously identified using multicolor flow cytometry. The new data can be plotted on the same graph, now showing the T-cell sub-population with different CFSE staining intensities, by which the proliferation rate of the T-cells can be specifically analyzed. This video demonstrates the protocol for CFSE staining of mouse splenocytes, which are stimulated with an anti-CD3 antibody. This is followed by staining to label T-cells and flow cytometry to track their cell proliferation.

To begin, put on appropriate protective clothing and laboratory gloves. Next, wash a pair of forceps and dissecting scissors first with a detergent and then with 70% ethanol and then wipe them dry with a clean paper towel. Prepare 50 milliliters of Hank’s Balanced Salt Solution, or HBSS, with a 2% concentration of fetal calf serum, or FCS, by combining one milliliter of FCS with 49 milliliters of HBSS in a 50 milliliter tube. Mix by gently pipetting the solution up and down approximately 10 times. Then, isolate mouse spleen cells as demonstrated in the video protocol for FACS isolation of splenic B-lymphocytes.

Label four 15-milliliter tubes one through four and add one times 10 to the seventh isolated spleen cells. Next, add three milliliters of HBSS 2% FCS to each tube. Then, pipette one microliter of five micromolar carboxyfluorescein succinimidyl ester, or CFSE, into each tube. Incubate the tubes at 37 degrees Celsius in a 5% carbon dioxide incubator for 10 minutes. The cells in tubes one and two will not be stimulated. They will be used to reveal the basal level of proliferation of splenic CD4 and CD8 T-cells.

Pipette 10 milliliters of HBSS 2% FCS into these tubes. Tubes three and four will be stimulated by anti-CD3 antibody in order to observe the effects on the cell cycle. Add 10 milliliters of HBSS 2% FCS and anti-CD3 antibody at a final concentration of 2.5 micrograms per milliliter to tubes three and four. Next, centrifuge all of the tubes at 370 x g for seven minutes at 10 degrees Celsius. Discard the supernatants. Resuspend the pellets in two milliliters of HBSS 2% FCS and pipette the resulting solutions into separate wells on a six-well plate. Carefully label the plate from one to four to keep track of sample identities. Incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5% CO2 for three days.

On day three, add two milliliters of HBSS 2% FCS to wells one and three, which should contain the cells from tubes one and three. Pipette up and down vigorously and then transfer the samples into labeled five-milliliter FACS tubes. Place the six-well plate back into the incubator. These remaining cells from wells two and four will be analyzed on day five to investigate long-term effects of stimulation on the cell cycle. Centrifuge the tubes at 370 x g for seven minutes at 10 degrees Celsius and then discard the supernatants. Now, add 100 microliters of antibody mix to each tube. Incubate the tubes for 20 minutes on ice in the dark. Next, add one milliliter of HBSS 2% FCS to each tube and centrifuge the tubes at 370 x g for seven minutes at 10 degrees Celsius. Discard the supernatants. Re-suspend the pellets in 200 milliliters of HBSS 2% FCS and mix well. Transfer the resuspended pellets to new labeled FACS tubes.

Then, evaluate T-cell proliferation using flow cytometry as shown in the FACS protocol. Gate the cells to select lymphoid CD3-positive cells and to distinguish CD4-positive and CD8-positive cells, and record the data for tubes one and three. On day five, repeat the cell-staining process with the cells from the remaining two wells of the six-well plate.

We will analyze the effects of CD3 stimulation on the cell cycle of CD4 and CD8-positive cells at three days and five days post-stimulation. To begin, click on the FlowJo icon and drag your files into the All Sample window. Double-click on the file for the unstimulated cells collected on day three to display a dot plot with forward scatter on the y-axis and side scatter on the x-axis. Click on polygon to circle the lymphocyte populations based on their morphology. In the sub-population identification window, name the population lymphocytes and click OK. Next, double-click on the circled population and in the new window, select Thy1.2 on the y-axis and CD3 on the x-axis. Then, click on polygon to circle the CD3 and Thy1.2 double positive cells. In the new sub-population identification window, name the population T-Cells and click OK. Next, double-click on the circled population. In the new window, select CD4 on the y-axis and CD8 on the x-axis. Then, click on polygon to circle the CD4-positive population. In the new sub-population identification window, name the population CD4 T-Cells and click OK. Now, click on polygon to circle the CD8-positive population. In the new sub-population identification window, name the population CD8 T-Cells and click OK. Repeat these steps with the other files.

To determine the frequencies of dividing and non-dividing cells, first, visualize the cell populations by clicking on Layout Editor. Then, drag the CD4 T-cells and CD8 T-cells from each of the four tubes to the All Sample window. Graphs representing your populations will appear. For each tube, double-click on the dot plot for CD8 T-cells and select Histogram under Graph Definition to visualize the results. Select CFSE as the parameter to compare the stimulated versus unstimulated cell populations at each time point. Non-dividing cells maintain higher levels of CFSE whereas proliferating cells split the content of CFSE to dividing cells.

Now, while pressing the Shift key, double-click on the histogram. In the new window, click range and select the range of CFSE corresponding to the highest peak. In the sub-population identification window, name the population Non-Dividing CD8 T-Cells and label the population Dividing CD8 Cells. Now, repeat to select the dividing and non-dividing CD4 T-cells in each tube. To examine the frequency of dividing CD3-positive cells, click on Table Editor. Then, drag the populations of interest, Dividing CD8 T-Cells and Dividing CD4 T-Cells, into table. On the Statistic menu, select Frequency of T-cells. Then, click on Create Table to reveal the frequency in a new table.

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