6.2: Diluciones en serie y enchapado: enumeración microbiana

1. Configuración

1. Un diagrama de flujo con una lista de todos los materiales, un protocolo experimental escalonado y un método para desechar suministros deben escribirse en un cuaderno de laboratorio y mantenerse cerca del espacio de trabajo experimental.
2. Los espacios de trabajo deben esterilizarse con un antiséptico adecuado (70% etanol) y el experimentador debe mitigar el riesgo de contaminación mediante el uso de prendas de laboratorio limpias que también los protejan de anomalías de exposición. Las prendas adecuadas incluyen, entre otras, un abrigo de laboratorio, guantes de látex o nitrilo, googles, respiradores y zapatos cerrados. Es fundamental mantener la técnica aséptica en todo momento.
3. Preparar 90 ml de 0,45% de salina. Usando un cilindro graduado limpio, mida 90 ml de agua estéril y transfiéralo a un matraz Erlenmeyer limpio etiquetado 0.45% solución salina. Pesar .405 g de cloruro sódico (Sigma-Aldrich NaCl S9888) y añadirlo al matraz etiquetado 0,45% de solución salina. Gire repetidamente hasta que no quede visible ningún soluto.
4. Una vez completado, el experimentador debe volver a esterilizar todas las superficies y descartar cualquier organismo no deseado, existencias de diluyentes, platos de petri o bucles de inoculación desechables de acuerdo con las directrices de la OSHA. Las prendas de laboratorio se pueden quitar antes de lavarse las manos.

2. Preparación de medios

1. Seleccione los medios que sean apropiados para el cultivo de un organismo deseado. En la mayoría de los escenarios, un caldo permitiría un crecimiento bacteriano suficiente. Dado que aquí se desean organismos de un protocolo Winogradsky, una columna que consiste en carbonato de calcio, azufre, celulosa y barro se ensambló y se dejó sin perturbaciones durante 7 días. La columna de nombre anterior se separa en secciones aeróbicas, microaerofílicas y anaeróbicas.
2. Elija un medio apropiado para enchapar el organismo de interés. La suplementación de medios líquidos con agar de grado microbiológico se emplea típicamente como un agente solidificante. El medio/agar LB es suficiente cuando se cosechan muestras de regiones aeróbicas, microaerófilas y anaeróbicas de la columna con nombre anterior. Nota: Para este procedimiento no se cosecharon muestras de la región microaeroófila. Sin embargo, estos organismos deben ser cultivados en frascos de velas. La introducción de una vela a esta cámara de cultivo antes de sellar crea un ambiente de bajo oxígeno que es adecuado para la proliferación microaerofílica.
3. Dado que deseamos preparar 250 ml, utilice frascos Erlenmeyer de 500 ml (o más) para evitar la ebullición al autoclave. Etiqueta un "Caldo" y el otro "Agar".
4. Determine la cantidad de medios necesarios para crear cada solución siguiendo las recomendaciones de concentración del fabricante. El agar LB, utilizado aquí, se prepara combinando 25g/L con agua ultrapura. Nuestro volumen de 250 ml requiere una solución de 6,25 LB Agar/250 ml de agua. Del mismo modo, el caldo LB se prepara combinando la misma proporción de caldo LB y agua. Puesto que no se complementa con un agente solidificante, no se endurecerá cuando se enfríe.
5. Pesar el medio y mezclarlo con agua en proporciones consistentes con las recomendaciones del fabricante. Agregue 6.25g de agar LB a un matraz etiquetado como "Agar", y 6.25g de caldo LB a un matraz etiquetado como "Broth". Añadir 250 ml de agua ultrapura a cada matraz.
6. Envuelva la lámina de aluminio sobre cada matraz y utilice un autoclave para esterilizar los medios durante un mínimo de 15 minutos a 121oC, 15 psi.
7. Con un guante o almohadilla resistente al calor, retire los matraces del autoclave cuando el ciclo esté completo y colóquelos en un baño de agua de 40-50 oC.
8. Una vez alcanzada la temperatura adecuada, vierta el contenido del matraz etiquetado como "Broth" en un Erlenmeyer de 250 ml, o matraz de fondo redondo. Etiquetar el matraz de 250 ml "solución_0".
9. Obtenga 10, 100 mm x 15 mm de platos de petri estériles y etiquételos con la fecha, el nombre, el tipo de medio utilizado y la zona de columna de Winogradsky de la que se cosecharán los organismos.
10. Retire el matraz etiquetado como "Agar" del baño de agua y comience a verter en cada uno de los platos de 10 petri. No se deben añadir más de 15 ml a cada plato. Esto también se puede realizar con un pipetador y una pipeta serológica de 25 ml para mejorar la precisión. Use una punta de pipeta estéril para eliminar las burbujas presentes, y luego cubra con las tapas de la placa y deje que se solidifique durante la noche.

3. Preparación diluyente

1. Prepare diez tubos de ensayo capaces de almacenar 20 ml o más en un bastidor y etiquételos T1-T10. Cada número de tubo es coherente con el factor de dilución al que corresponde (es decir, T4 a 1x10^-4 o 0,0001 o 1/10.000 de concentración de stock).
2. Pipet 9 mL de 0.45% salina en cada uno de los 10 tubos de ensayo.
3. Los espacios en blanco salinos ahora están listos para ser esterilizados por autoclave. Utilice papel de aluminio para cubrir cada uno de los 10 tubos de ensayo y luego transfieralos a un bastidor de tubo de ensayo compatible con autoclave. Esterilice durante un mínimo de 15 minutos a 121oC, 15 psi.
4. Retire los espacios en blanco con guantes resistentes al calor y deje enfriar. Cubra y almacene a 4oC hasta que sea necesario cuando los tubos hayan alcanzado la temperatura ambiente, o cuando se enfríen al tacto.

4. Cultivo de organismo objetivo

1. Inocular la "solución_0"con una sola colonia a partir de una placa previamente rayada o de 50 ml de una culata congelada. Permita que el organismo objetivo se replique colocando la "solución_0"inoculada en una incubadora de 37oC durante la noche con temblores (si es necesario). (Nota: El matraz debe estar cubierto para evitar la contaminación. Si el organismo objetivo es aeróbico, utilice gasas estériles y tapones de algodón para evitar la contaminación. Si evalúa las regiones de la columna Winogradsky, simplemente retire 1 gramo de cada zona deseada (aeróbico y anaeróbico a los efectos de este estudio) y vuelva a suspender en T1 antes de continuar con el paso 5.3.

5. Dilución en serie

1. Obtenga el matraz etiquetado como "Caldo nutritivo" de la incubadora y agite vigorosamente.
2. Pipet 1 mL de "solución_0"en el tubo de ensayo etiquetado T1. Vórtice T1. Si evalúa los explantes de Winogradsky, pese 1 gramo de la zona deseada y agréguelo a La T1 antes del vórtice. (Nota: 1 mL se utiliza aquí para la simplicidad- volúmenes más pequeños o más grandes de diluyente también se pueden utilizar).
3. Retire 1 ml del tubo de ensayo T1 y agréguelo al tubo de ensayo T2. Vórtice T2.
4. Retire 1 ml del tubo de ensayo T2 y agréguelo al tubo de ensayo T3. Vórtice T3.
5. Retire 1 ml del tubo de ensayo T3 y agréguelo al tubo de ensayo T4. Vortex T4.
6. Retire 1 ml del tubo de ensayo T4 y agréguelo al tubo de ensayo T5. Vórtice T5.
7. Retire 1 ml del tubo de ensayo T5 y agréguelo al tubo de ensayo T6. Vortex T6.
8. Retire 1 ml del tubo de ensayo T6 y agréguelo al tubo de ensayo T7. Vortex T7.
9. Retire 1 ml del tubo de ensayo T7 y agréguelo al tubo de ensayo T8. Vortex T8.
10. Retire 1 ml del tubo de ensayo T8 y agréguelo al tubo de ensayo T9. Vortex T9.
11. Retire 1 ml del tubo de ensayo T9 y agréguelo al tubo de ensayo T10.

6. Revestimiento de propagación

1. Pipet 100 l de una muestra diluida de T1 directamente sobre una placa de petri. Este paso puede ser, pero no necesita ser, repetido para cada tubo.
2. Obtener una varilla de propagación estéril y desechable o una llama esterilizar una varilla de esparcimiento de vidrio. En un movimiento en el sentido de las agujas del reloj/en el sentido contrario a las agujas del reloj, deslice la parte horizontal de la varilla de propagación para distribuir equitativamente la muestra dentro de la placa petri.
3. Repita el proceso para cada zona de la columna Winogradsky que se va a evaluar.
4. Incubar placas en una incubadora de 37oC durante 24 horas. Para organismos anaeróbicos, utilice una cámara anaeróbica.

7. Streaking

1. Seleccione una dilución adecuada de su organismo objetivo. Por ejemplo, la solución₄ producirá una dilución 1/10.000 de su concentración inicial. Normalmente, las diluciones de 1/1.000^th (T3/Solution), 1/1.000.000^th (T6/Solution₆) y 1/1,000,000 th (T9/Solution₉₎se evalúan para enumerar microbios.
2. Usando un lazo de inoculado desechable estéril de plástico o un bucle de inoculado de metal reutilizable que ha estado bajo fuego durante no menos de 10 segundos, sumerja en la solución deseada del paso 5. Los bucles de inoculación calibrados deben transferir 0,01 ml. (Precaución: No permita que el bucle flameado entre en contacto con las bacterias inmediatamente después de retirarse del calor)
3. Levante ligeramente la cubierta de la placa de petri en un lado para que sólo el bucle inoculado pueda acceder al agar. Deslice el bucle inoculante a través de la parte superior de los medios de comunicación de una manera en zig-zag teniendo cuidado de no comprometer el agar. Baje la tapa del plato de petri.
4. Utilice un nuevo bucle de inoculado desechable o vuelva a esterilizar su bucle reutilizable.
5. Gire la placa aproximadamente 1/3^rd (118o) y reduzca la frecuencia del movimiento en zig-zag.
6. Una vez más, utilice un nuevo bucle desechable o vuelva a esterilizar un bucle de metal antes de girar una última vez y reduzca la frecuencia en zig-zag una vez más. Baje la tapa del plato de petri.
7. Repita los pasos 7.2 - 7.6 hasta que se hayan rayado al menos tres platos de petri para tres diluciones diferentes, utilizando un nuevo bucle desechable o volviendo a poner en llamas un bucle reutilizable(Figura 2).
8. Coloque platos de petri rayados en una incubadora de 37oC durante la noche. Para los organismos anaeróbicos, utilice una cámara anerobica.

8. Análisis de datos y resultados

1. Los cultivos fueron cosechados de las zonas oxic y anóxicos de una columna Winogradsky de 7 días. Estas zonas son adecuadas para anaerobios heterotróficos y oxidantes de hierro, respectivamente.
2. Los explantes de columna se diluyeron en serie antes de rayar o esparcirse en las placas de agar LB.
3. Streaking reveló una población mixta de cada una de las zonas de Winogradsky evaluadas. Las placas de propagación produjeron resultados similares.
4. Para calcular cFU/ml o CFU/g, promediar el número de colonias contadas a partir de tres placas. Multiplique el número medio de colonias por el factor de dilución y divida por la cantidad alícuota. Por ejemplo, si se contara un promedio de 65 colonias en placas inoculadas con 0,1 ml de solución₆ (T6), la fórmula descrita anteriormente equivaldría a 650.000.000 de UFC/ml.
5. Las colonias aisladas ahora se pueden elegir de cada placa para su uso en ensayos de enriquecimiento para determinar la identidad de las especies.

A veces, para identificar y estudiar las bacterias, primero necesitamos aislarlas y enriquecerlas a partir de una muestra. Por ejemplo, las muestras obtenidas de una columna de Winogradsky están mezcladas, lo que significa que contienen múltiples especies o cepas de bacterias, por lo que estudiar una bacteria individual o enumerar los diferentes tipos presentes puede ser un desafío. Con este fin, las técnicas de dilución y siembra en serie se emplean normalmente para cuantificar de forma fiable la carga bacteriana y aislar las colonias individuales.

La dilución en serie es un proceso a través del cual la concentración de un organismo, bacterias en este ejemplo, se reduce sistemáticamente a través de la resuspensión sucesiva en volúmenes fijos de diluyente líquido. Por lo general, el volumen del diluyente es un múltiplo de 10 para facilitar la reducción logarítmica del organismo de la muestra. Por ejemplo, primero se retira un gramo de sedimento de la zona de interés de Winogradsky y se añade a 10 mililitros de un medio líquido adecuado. Luego, se agrega un mililitro de esta primera dilución a otro tubo que contiene nueve mililitros de medio. El proceso se puede repetir hasta que se hayan preparado varias concentraciones diferentes de bacterias. La dilución en serie es la clave para la enumeración de bacterias en este ejemplo, ya que las muestras mezcladas de una columna de Winogradsky contienen un número desconocido, a menudo grande, de bacterias.

A continuación, el recubrimiento de rayas y el recubrimiento extendido permiten el aislamiento y la enumeración de bacterias dentro de una muestra, respectivamente. El rayado se logra introduciendo una muestra diluida en una sección del medio sólido suplementado con nutriente, que se divide en tercios. Este inóculo se extiende sobre cada tercio de la placa en un patrón en zig-zag. A medida que se rayan diferentes secciones de la placa, cruzándose desde la muestra anterior solo una vez, la muestra se extiende más finamente. Esto significa que es posible que solo necesite rayar una dilución para lograr colonias individuales en las secciones posteriores. Después de la incubación, las placas rayadas permiten observar la morfología de la colonia, información que puede ayudar a diferenciar entre las diferentes especies bacterianas.

Alternativamente, si el objetivo principal es la enumeración de las bacterias en la muestra extendida, se puede utilizar el recubrimiento. En el recubrimiento extendido, una alícuota de una sola muestra se distribuye uniformemente sobre toda la superficie del medio sólido. Por lo general, debido a que no conocemos los números bacterianos en la muestra mezclada, se hace una placa de extensión para cada una de las diluciones o una muestra representativa de ellas. Después de la incubación, la enumeración se puede realizar utilizando estas placas de esparcimiento. Cualquier placa con un conteo de colonias inferior a 30 debe descartarse, ya que los recuentos pequeños están sujetos a un mayor error. Del mismo modo, se deben descartar los recuentos superiores a 300 porque el hacinamiento y la superposición de colonias pueden llevar a una subestimación del recuento de colonias. Si el conteo de colonias de cada una de estas placas restantes se registra y se multiplica por el factor de dilución, y luego se divide por el volumen plateado, esto produce las unidades formadoras de colonias, o UFC, por mililitro de suspensión. En este video, aprenderá cómo evaluar cualitativa y cuantitativamente una muestra que contiene una bacteria conocida y las comunidades microbianas contenidas en varias regiones de una columna de Winogradsky a través de dilución en serie, recubrimiento extendido y recubrimiento de rayas.

Primero, póngase el equipo de protección personal adecuado, incluida una bata de laboratorio, guantes y gafas. A continuación, esterilice el espacio de trabajo con etanol al 70% y limpie la superficie. A continuación, reúna dos matraces Erlenmeyer de 500 mililitros y etiquete un caldo y el otro agar. Para preparar la solución de agar LB, mezcle aproximadamente 6,25 gramos de agar LB, tres gramos de agar técnico y 250 mililitros de agua destilada en el matraz de agar etiquetado.

Luego, prepare el caldo LB combinando 2. 5 gramos de medio LB y 100 mililitros de agua destilada en el caldo etiquetado con el matraz. Después de esterilizar los matraces en autoclave, use un guante resistente al calor para quitar los matraces del autoclave y colóquelos en un baño de agua de 40 a 50 grados Celsius. Una vez que los matraces estén a 50 grados centígrados, prepare cuidadosamente tres alícuotas de 100 mililitros de la solución de caldo y etiquete cada solución alícuota como cero. A continuación, reúna 10 placas de Petri estériles y etiquételas con la fecha, el nombre, el tipo de medio utilizado y la zona de la columna de Winogradsky de la que se cosecharán los organismos. Pipetear 15 mililitros de agar del matraz de agar en cada placa de Petri. A continuación, utilice la punta de la pipeta para eliminar las burbujas, vuelva a colocar las tapas de las placas y deje que se solidifiquen en la mesa de trabajo durante la noche.

Al día siguiente, limpie la mesa de trabajo con etanol al 70%. A continuación, etiquete 10 tubos de ensayo de 20 mililitros T1 a T10 y colóquelos en una rejilla. Pipetee nueve mililitros de solución salina de .45% en cada tubo. Ahora, cubra cada uno de los 10 tubos de ensayo sin apretar con sus tapas y transfiéralos a un soporte de tubos de ensayo compatible con autoclave. Una vez completado el ciclo, retire los blancos de solución salina con guantes resistentes al calor y deje que se enfríen. Guarde los tubos a temperatura ambiente hasta que hayan alcanzado aproximadamente 22 grados centígrados.

Para cultivar un organismo objetivo conocido, E. coli en este ejemplo, inocule 100 mililitros de solución cero con una sola colonia de una placa previamente rayada. Luego, tapa el tubo e incuba durante la noche a 37 grados centígrados. Para evaluar las regiones de una columna de Winogradsky, agregue aproximadamente un gramo de material de la zona aeróbica a T1 y vuelva a suspender por vórtice. Luego, repita este proceso con un gramo de material de la zona anaeróbica.

Retire el tubo que contiene la solución cero inoculada con E. coli de la incubadora y agítelo. A continuación, pipetee un mililitro de la solución en un tubo de ensayo T1 y vórtice para mezclar. Retire un mililitro de solución de T1 y transfiéralo a T2, agitando el vórtice para mezclar. Repita este proceso a través del tubo T10. Para evaluar las zonas aeróbicas y anaeróbicas de la columna de Winogradsky, extraiga un mililitro de solución de cada uno de los tubos T1 previamente preparados y transfiéralo a los tubos T2 apropiados. A continuación, continúe con las diluciones en serie a través de los tubos T10 como se ha demostrado anteriormente.

Para extender la placa, pipetee 100 microlitros de la muestra diluida de cada tubo T3 en la placa de Petri correspondiente. Luego, use una varilla de esparcimiento estéril para distribuir suavemente la muestra en la placa de Petri y vuelva a colocar la tapa de la placa. Repita este proceso para las diluciones T6 y T9, como se demostró anteriormente. Incubar las placas que contienen organismos aeróbicos en una incubadora a 37 grados centígrados durante 24 horas. Incubar las placas que contienen organismos anaeróbicos en una cámara anaeróbica ajustada a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, retire las placas de dilución T3, T6 y T9 de la incubadora y de la cámara anaeróbica y transfiéralas a la mesa de trabajo. Trabajando con una placa a la vez, deslice un bucle de inoculación estéril a través de la parte superior del medio en un patrón en zig-zag. Luego, vuelva a colocar la tapa de la placa de Petri. A continuación, gire la placa en 1/3 y esterilice el bucle para reducir la frecuencia del patrón en zig-zag realizado anteriormente. Nuevamente, después de esterilizar el bucle, gire la placa 1/3, reduzca la frecuencia del patrón en zig-zag por última vez y vuelva a colocar la tapa. Repita este método de rayado para las placas restantes, como se mostró anteriormente. Luego, coloque las placas rayadas que contienen organismos aeróbicos en una incubadora a 37 grados Celsius durante la noche y las placas rayadas que contienen organismos anaeróbicos en una cámara anaeróbica configurada a 37 grados Celsius durante la noche.

Los cultivos se cosecharon en las zonas aeróbicas y anaeróbicas de una columna Winogradsky de siete días. Luego, los cultivos se diluyeron en serie antes de rayar y esparcir en placas de agar LB. Las rayas revelaron una población mixta de cada una de las zonas de Winogradsky evaluadas, y las placas esparcidas produjeron resultados similares. Un plato veteado de una población mixta dará lugar a colonias bacterianas de diferentes formas, tamaños, texturas y colores. En contraste, las placas rayadas y extendidas que contenían el organismo conocido, E. coli, demostraron una población homóloga. Por lo general, es mejor calcular las UFC por mililitro utilizando el recuento promedio de colonias de tres placas distribuidas con la misma muestra y factor de dilución. Multiplique el número promedio de colonias por el factor de dilución y divida por la cantidad alícuota. Finalmente, las colonias aisladas elegidas de cada placa se pueden utilizar en ensayos de enriquecimiento adicionales para determinar la identidad de la especie.