Cultivos puros y siembra por estrías: aislamiento de colonias bacterianas únicas de una muestra mixta

1. Configurar

1. Todos los microbios deben tratarse como si fueran peligrosos. Use siempre una capa de laboratorio y guantes, ate el cabello largo y asegúrese de que las heridas estén particularmente bien protegidas.
2. Preparar el espacio de trabajo esterilizando con 70% de etanol.
3. Asegúrese de que las placas de agar, la solución(s) de muestra y una caja de bucles de inoculación de plástico preesterilizados o un bucle de metal más una llama Bunsen, estén cerca. Los bucles de plástico desechables suelen estar preesterilizados. Los bucles metálicos deben sumergirse en 70% de etanol, y luego mantenerse cerca de la zona azul de una llama Bunsen y calentarse hasta que esté ardientemente caliente. Deje que el cable se enfríe elevando la tapa de la placa (sólo ligeramente para evitar la contaminación) y golpeándola contra el medio solidificado.
4. Finalice cada procedimiento con una esterilización repetida del espacio de trabajo y un lavado/esterilización exhaustivo de manos y muñecas.

2. Protocolo

1. Preparación de medios
   1. Identificar y preparar un medio sólido (normalmente contiene 1,5% (p/v) agar) que sostendrá las especies/strain bacterianas utilizadas. Mezclar el medio en una botella capaz de sostener el doble del volumen final para evitar el desbordamiento al autoclave.
   2. Esterilice el soporte colocando el frasco, con una tapa semiapretada, en un autoclave ajustado a 121oC durante 20 min.
   3. Cierre la tapa correctamente tan pronto como se retire la botella del autoclave. Si el medio se va a utilizar en breve, coloque la botella en un baño de agua ajustado a 45 oC para conservarla en estado líquido. De lo contrario, el agar se solidifique a menos de 32-40 oC, y posteriormente se puede volver a calentar (normalmente usando un microondas) a un punto de fusión a 85 oC.
2. Preparación de la(s) placa(s) de cultivo(s)
   1. Marque la base de los platos estériles de Petri (normalmente 100 x 15 mm) en el lado o en la parte inferior con el nombre del experimentador, la fecha y el tipo de soporte.
   2. Vierta 20-25 ml de medio de cultivo de agar a 45oC (previamente preparado) en cada una de las placas etiquetadas. Si la espuma aparece a lo largo de los bordes, esto debe ser eliminado rápidamente usando una pipeta regular y una punta estéril.
   3. Coloque inmediatamente todas las tapas de nuevo en los platos para evitar la contaminación.
   4. Deje que el agar se solidifique durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC. Una vez establecidas, las placas de cultivo bacterianos deben almacenarse posteriormente boca abajo a 4oC para minimizar la condensación en la superficie media.
3. Revestimiento de rayas
   1. Sumerja un bucle estéril en el inóculo deseado e disperse inmediatamente la muestra recogida en el primer cuadrante de la placa utilizando un movimiento en zig-zag(Figura 1, I).
   2. Cierre la tapa y vuelva a esterilizar el bucle de inoculación o recoja un nuevo lazo desechable estéril.
   3. Hacer 3-4 trazos irradiando desde el primer cuadrante (que contiene una población bacteriana relativamente densa) hacia el segundo cuadrante de la placa(Figura 1, II).
   4. Cierre la tapa y vuelva a esterilizar el bucle de inoculación o deseche el bucle desechable y recoja uno nuevo estéril.
   5. Repita este rayado de 3-4 golpes desde el segundo hasta el tercer cuadrante, y luego del tercer al cuarto cuadrante, utilizando un bucle estéril cada vez(Figura 1, III - IV).
   6. Usando un lazo estéril, haga un golpe final en un patrón en zig-zag desde el cuarto cuadrante hacia el centro de la placa(Figura 1, V). La prevalencia bacteriana será menor en esta área, lo ideal es permitir que se establezcan colonias individuales a partir de una sola célula madre viable.
   7. Cierre la tapa y (si así lo requiere la especie bacteriana) cierre con parafilm para evitar el flujo de aire.
   8. Dependiendo de las especies bacterianas/strain, coloque la placa de cultivo boca abajo en un ambiente adecuado e incubar hasta que las colonias bacterianas sean visibles (las colonias segregadas pueden aparecer en cualquiera de las áreas de la placa, ya que la concentración inicial puede variar).
   9. Para generar una población bacteriana clonal, saque otra placa, intercambiando el inóculo chapado en la placa original por células aisladas de una sola colonia de la placa original.