Curvas de crecimiento: Generación de curvas de crecimiento utilizando unidades formadoras de colonias y mediciones de densidad óptica

Las bacterias se reproducen a través de un proceso llamado división celular, que da como resultado dos células hijas idénticas. Si las condiciones de crecimiento son favorables, las poblaciones bacterianas crecerán exponencialmente.

Las curvas de crecimiento bacteriano trazan la cantidad de bacterias en un cultivo en función del tiempo. Una curva de crecimiento típica progresa a través de cuatro etapas: fase de retraso, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte. La fase de retraso es el tiempo que tardan las bacterias en alcanzar un estado en el que pueden crecer y dividirse rápidamente. Después de esto, las bacterias pasan a la fase exponencial, caracterizada por un rápido crecimiento y división celular. La tasa de crecimiento exponencial del cultivo bacteriano durante esta fase se puede expresar como el tiempo de duplicación, la tasa más rápida a la que las bacterias pueden reproducirse en condiciones específicas. La fase estacionaria viene a continuación, donde el crecimiento de las células bacterianas se estanca y las tasas de crecimiento y muerte se igualan debido al agotamiento de los nutrientes ambientales. Finalmente, las bacterias entran en la fase de muerte. Aquí es donde el crecimiento bacteriano disminuye bruscamente y el agotamiento severo de nutrientes conduce a la lisis de las células.

Se pueden utilizar dos técnicas para cuantificar la cantidad de bacterias presentes en un cultivo y trazar una curva de crecimiento. La primera de ellas es a través de unidades formadoras de colonias, o UFC. Para obtener UFC, se realiza una serie de una a diez diluciones de nueve en puntos de tiempo regulares. La primera de estas diluciones, negativa en este ejemplo, contiene 9 mL de PBS y 1 mL del cultivo bacteriano. El resultado es un factor de dilución de 1:10. Luego, 1 ml de esta solución se transfiere al siguiente tubo, menos dos, lo que da como resultado un factor de dilución de 1:100. Este proceso continúa a través del último tubo, menos nueve, lo que da como resultado un factor de dilución final de 1:1 mil millones. Después de esto, se colocan 100 microlitros de cada dilución. A continuación, se incuban las placas y se cuentan las colonias clonales. La placa de dilución para un punto de tiempo determinado que crece entre 30 y 300 colonias se utiliza para calcular las UFC por mililitro para ese punto de tiempo.

El segundo método común para medir la concentración bacteriana es la densidad óptica. La densidad óptica de un cultivo se puede medir instantáneamente, en relación con un medio en blanco, con un espectrofotómetro. Por lo general, se utiliza una longitud de onda de 600 nanómetros, también conocida como OD600, para estas mediciones, que aumentan a medida que aumenta la densidad celular. Si bien la densidad óptica es menos precisa que las UFC, es conveniente porque se puede obtener instantáneamente y requiere relativamente pocos reactivos. Ambas técnicas se pueden usar juntas para crear una curva estándar que se aproxime con mayor precisión al recuento de células bacterianas de un cultivo. En este video, aprenderá cómo obtener CFU y mediciones de OD600 a partir de diluciones en serie cronometradas de E. coli. A continuación, se trazarán dos curvas de crecimiento utilizando las mediciones CFU y OD600, respectivamente, antes de ser relacionadas por una curva estándar.

Cuando se trabaja con bacterias, es importante utilizar el equipo de protección personal adecuado, como una bata de laboratorio y guantes, y observar una técnica aséptica adecuada.

Después de esto, esterilice la estación de trabajo con etanol al 70%. Primero, prepare el caldo LB y los medios de agar sólido LB en botellas autoclave separadas. Después de cerrar parcialmente las tapas de los biberones, esterilice los medios en un autoclave ajustado a 121 grados centígrados durante 35 minutos. A continuación, deje que el medio de agar se enfríe en un baño de agua a 50 grados centígrados durante 30 minutos. Una vez enfriado, vierta de 20 a 25 ml en cada placa de Petri. Después de esto, deje que las placas se asienten durante 24 horas a temperatura ambiente.

Para preparar los aislados de una sola colonia que luego se utilizarán para producir un cultivo bacteriano líquido, utilice caldo previamente congelado y una técnica adecuada de recubrimiento de rayas para rayar E. coli para su aislamiento en agar LB. Incuba el plato a 37 grados centígrados durante la noche. Después de esto, enfríe un circuito de inoculación esterilizado con llama en el agar antes de seleccionar una sola colonia de la placa rayada. Inocular 4 mL de medio líquido en un tubo de ensayo de 15 mL. Luego, cultive la E. coli a 37 grados centígrados durante la noche agitándola a 210 rpm.

Para configurar el volumen 1:1000 de cultivo bacteriano que se utilizará en la curva de crecimiento, primero obtenga un matraz Erlenmeyer de 500 ml esterilizado en autoclave. A continuación, utilice una pipeta serológica de 50 mL para transferir 100 mL de medio estéril al matraz. A continuación, etiquete nueve tubos de ensayo de 15 ml consecutivamente como uno a nueve. Estos números corresponden al factor de dilución que se utilizará para calcular la unidad formadora de colonias, o UFC. Luego, agregue 9 mL de 1X PBS a cada tubo. Después de esto, etiquete las placas de agar preparadas con los puntos de tiempo correspondientes y los factores de dilución que se cultivarán. En este ejemplo con E. coli, después del punto de tiempo de inicio, los puntos de tiempo se toman una vez cada hora. Utilizando el cultivo líquido de E. coli previamente preparado durante la noche, inocular el medio en el matraz Erlenmeyer de 500 ml en autoclave con un volumen de cultivo 1:1000. Agite el medio para distribuir uniformemente las bacterias.

Después de borrar un espectrofotómetro, limpie la cubeta con una toallita sin pelusa. A continuación, dispense 1 mL del cultivo en la cubeta y colóquelo en el espectrofotómetro para obtener la densidad óptica del cultivo en el punto de tiempo cero. Luego, cultive la E. coli a 37 grados centígrados agitando a 210 rpm. En cada punto de tiempo después del punto de tiempo cero, extraiga otro 1 mL de cultivo bacteriano del matraz y repita la medición de la densidad óptica. Si la lectura de densidad óptica es superior a 1,0, diluya 100 microlitros de cultivo bacteriano con 900 microlitros de medios frescos y luego mida la densidad óptica una vez más. Este valor se puede multiplicar por 10 para la medición de OD 600.

Para obtener la medida de la unidad formadora de colonias para cada punto de tiempo, extraiga 1 mL adicional de cultivo bacteriano del matraz en cada punto de tiempo. Dispense el cultivo bacteriano en el tubo de ensayo negativo y el vórtice para mezclar. Luego, realice la serie de dilución transfiriendo primero 1 mL del tubo negativo a otro tubo y al vórtice para mezclar. Transfiera 1 mL del tubo negativo dos al tubo negativo tres y el vórtice para mezclar. Continúe esta transferencia en serie por todos los tubos de dilución hasta el tubo de nueve negativos. Dispensar 100 microlitros de suspensión celular en la placa etiquetada correspondientemente para cada dilución. Para cada dilución, esterilice un esparcidor de células en etanol, páselo a través de una llama de mechero Bunsen y enfríelo tocando la superficie del agar lejos del inoculado. Luego, use el esparcidor de células para esparcir la suspensión celular hasta que la superficie de la placa de agar se seque. Incuba las placas boca abajo a 37 grados centígrados. Una vez que surjan colonias visibles, cuente el número de colonias bacterianas en cada plato. Registre estos valores y sus factores de dilución asociados para cada placa en cada punto de tiempo.

Para crear una curva de crecimiento OD 600, después de asegurarse de que todos los puntos de datos se ingresan correctamente en una tabla, seleccione todos los puntos de tiempo y sus datos correspondientes. Para generar un gráfico de curva de crecimiento unitario formador de colonias, elija la placa de dilución donde los recuentos de colonias se encontraban dentro del rango de 30 a 300 bacterias para cada punto de tiempo. Multiplique el número de recuento de colonias por el factor de dilución y luego por diez. Esto se debe a que la dispersión de 100 microlitros se considera una dilución adicional de 1:10 al calcular las unidades formadoras de colonias por mililitro. Después de esto, represente las unidades de formación de colonias en función del tiempo en una escala semilogarítmica.

Estas parcelas producidas con mediciones de OD 600 y UFC, respectivamente, pueden proporcionar información valiosa sobre la cinética de crecimiento de E. coli. La densidad óptica y las unidades formadoras de colonias se pueden relacionar, de modo que las UFC por mililitro se pueden estimar a partir de mediciones de OD 600, ahorrando tiempo y materiales en futuros experimentos.

Para hacer esto, trace las unidades formadoras de colonias contra la densidad óptica en una escala lineal para lecturas de OD 600 menores o iguales a 1. 0. Después de esto, genere una línea de tendencia de regresión lineal en formato Y = MX + B, donde M es la pendiente y B es la intersección con el eje y. Haga clic con el botón derecho en los puntos de datos y seleccione agregar línea de tendencia y lineal. A continuación, marque la casilla para mostrar la ecuación en el gráfico y mostrar el valor R cuadrado en el gráfico. El valor de R cuadrado es la medida estadística de cuánto coincidían los datos con la línea de regresión ajustada. En este ejemplo, los primeros 6 puntos de tiempo se trazan con OD 600 en el eje x y UFC por mililitro en el eje y. En experimentos futuros con las mismas condiciones de crecimiento, estos valores de pendiente e intersección con el eje y se pueden conectar a esta ecuación para estimar las UFC a partir de lecturas de OD 600. A continuación, observe el gráfico de la curva de crecimiento de la unidad formadora de colonias. Durante la fase exponencial, identifique dos puntos de tiempo con la pendiente más pronunciada entre ellos. Para calcular el tiempo de duplicación, primero calcule el cambio de tiempo entre los puntos de tiempo seleccionados. Luego, calcule el cambio en generaciones usando la ecuación que se muestra aquí. Aquí, la b minúscula es el número de bacterias en el punto de tiempo tres y la B mayúscula es el número de bacterias en el punto de tiempo dos. Por último, divide el cambio en el tiempo por el cambio en las generaciones. En este ejemplo, el tiempo de duplicación es 0. 26 horas o 15 minutos y 19 segundos. La comparación de los tiempos de duplicación entre diferentes tratamientos experimentales nos permite identificar las mejores condiciones de crecimiento para una determinada especie bacteriana. Por lo tanto, el tratamiento con el menor tiempo de duplicación será el más óptimo de las condiciones probadas.