Curvas de crecimiento: Generación de curvas de crecimiento utilizando unidades formadoras de colonias y mediciones de densidad óptica

Las bacterias se reproducen a través de un proceso llamado división celular, que resulta en dos células hijas idénticas. Si las condiciones de crecimiento son favorables, las poblaciones bacterianas crecerán exponencialmente.

Las curvas de crecimiento bacteriana trazan la cantidad de bacterias en un cultivo en función del tiempo. Una curva de crecimiento típica progresa a través de cuatro etapas: fase de retraso, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte. La fase de retraso es el tiempo que tardan las bacterias en llegar a un estado en el que pueden crecer y dividirse rápidamente. Después de esto, la transición de las bacterias a la fase exponencial, caracterizada por el rápido crecimiento celular y la división. La tasa de crecimiento exponencial del cultivo bacteriano durante esta fase se puede expresar como el tiempo de duplicación, la tasa más rápida a la que las bacterias pueden reproducirse en condiciones específicas. La fase estacionaria viene a continuación, donde las mesetas de crecimiento celular bacteriano y las tasas de crecimiento y mortalidad incluso hacia fuera debido al agotamiento de nutrientes ambientales. Finalmente, las bacterias entran en la fase de muerte. Aquí es donde el crecimiento bacteriano disminuye bruscamente y el agotamiento severo de nutrientes conduce a la lising de las células.

Se pueden utilizar dos técnicas para cuantificar la cantidad de bacterias presentes en un cultivo y trazar una curva de crecimiento. El primero de ellos es a través de unidades formadoras de colonias, o UFC. Para obtener UFC se realiza una serie de nueve diluciones en puntos de tiempo regulares. La primera de estas diluciones, negativa en este ejemplo, contiene 9 ml de PBS y 1 ml del cultivo bacteriano. Resultando en un factor de dilución 1:10. A continuación, 1 ml de esta solución se transfiere al siguiente tubo, dos negativos, lo que resulta en un factor de dilución 1:100. Este proceso continúa a través del último tubo, nueve negativo, resultando en un factor de dilución final de 1:1 mil millones. Después de esto, 100 microlitros de cada dilución se chapa. Las placas se incuban y se cuentan las colonias clonales. La placa de dilución para un punto de tiempo dado que crece entre 30 y 300 colonias se utiliza para calcular las UFC por mililitro para ese punto de tiempo.

El segundo método común de medición de la concentración bacteriana es la densidad óptica. La densidad óptica de un cultivo se puede medir instantáneamente, en relación con un medio en blanco, con un espectrofotómetro. Típicamente una longitud de onda de 600 nanómetros, también conocido como OD600, se utiliza para estas mediciones, que aumentan a medida que aumenta la densidad celular. Mientras que la densidad óptica es menos precisa que las UFC, es conveniente porque se puede obtener instantáneamente y requiere relativamente pocos reactivos. Ambas técnicas se pueden utilizar juntas para crear una curva estándar que se aproxime con mayor precisión al recuento de células bacterianas de un cultivo. En este vídeo, aprenderá cómo obtener mediciones de UFC y OD600 a partir de diluciones seriales cronometradas de E. coli. A continuación, se trazarán dos curvas de crecimiento utilizando las mediciones CFU y OD600, respectivamente, antes de ser relacionadas por una curva estándar.

Cuando se trabaja con bacterias, es importante utilizar el equipo de protección personal adecuado, como una capa de laboratorio y guantes, y observar la técnica aséptica adecuada.

Después de esto, esterilizar la estación de trabajo con 70% de etanol. Primero, prepare el caldo LB y los medios de agar sólidos LB en botellas autoclavebles separadas. Después de cerrar parcialmente las tapas de las botellas, esterilizar el medio en un autoclave establecido a 121 grados Celsius durante 35 minutos. A continuación, deje que el medio de agar se enfríe en un baño de agua ajustado a 50 grados Celsius durante 30 minutos. Una vez enfriado, vierta de 20 a 25 ml en cada plato de Petri. Después de esto, deje que las placas se ajusten durante 24 horas a temperatura ambiente.

Para preparar los aislados de una sola colonia que más tarde se utilizarán para producir un cultivo bacteriano líquido, utilice el caldo previamente congelado y la técnica de revestimiento de rayas adecuada para rayar E. coli para el aislamiento en el agar LB. Incubar el plato a 37 grados Celsius durante la noche. Después de esto, enfríe un bucle de inoculación esterilizado por llama en el agar antes de seleccionar una sola colonia de la placa rayada. Inocular 4 ml de medios líquidos en un tubo de ensayo de 15 ml. Luego, haga crecer la E. coli a 37 grados centígrados durante la noche con agitación a 210 rpm.

Para configurar el volumen 1:1000 del cultivo bacteriano que se utilizará en la curva de crecimiento, primero obtenga un matraz Erlenmeyer autoclavedo de 500 ml. A continuación, utilice una pipeta serológica de 50 ml para transferir 100 ml de medios estériles al matraz. A continuación, etiquetar nueve tubos de ensayo de 15 ml consecutivamente como uno a nueve. Estos números corresponden al factor de dilución que se utilizará para calcular la unidad formadoa de colonias, o CFU. A continuación, agregue 9 ml de 1X PBS a cada tubo. Después de esto, etiquetar las placas de agar preparadas con los puntos de tiempo y factores de dilución correspondientes que se cultivarán. En este ejemplo con E. coli, después del punto de tiempo de inicio, los puntos de tiempo se toman una vez cada hora. Utilizando el cultivo líquido de E. coli durante la noche previamente preparado, inocular los medios en el matraz Erlenmeyer de 500 ml de autoclave con volumen de cultivo 1:1000. Gire los medios para distribuir uniformemente las bacterias.

Después de borrar un espectrofotómetro, limpie la cubeta con una toallita sin pelusas. A continuación, dispensar 1 ml del cultivo en la cubeta y colocarlo en el espectrofotómetro para obtener la densidad óptica del cultivo en el punto de tiempo cero. Luego, crecer la E. coli a 37 grados Centígrados con agitación a 210 rpm. En cada momento después del punto de tiempo cero, retire otro 1 ml de cultivo bacteriano del matraz y repita la medición de densidad óptica. Si la lectura de densidad óptica es mayor que 1.0, diluir 100 microlitros de cultivo bacteriano con 900 microlitros de medios frescos y luego medir la densidad óptica una vez más. Este valor se puede multiplicar por 10 para la medición OD 600.

Para obtener la medida de la unidad de formación de colonias para cada punto de tiempo, retire 1 ml adicional de cultivo bacteriano del matraz en cada punto de tiempo. Dispensar el cultivo bacteriano en el tubo de ensayo negativo y el vórtice para mezclar. A continuación, realice la serie de dilución transfiriendo primero 1 ml del tubo negativo al tubo negativo de dos tubos y vórtice para mezclar. Transfiera 1 ml desde el tubo negativo de dos tubos al tres tubos negativos y el vórtice para mezclar. Continúe esta transferencia serial por todos los tubos de dilución al tubo negativo de nueve. Dispensar 100 microlitros de suspensión celular en la placa etiquetada correspondientemente para cada dilución. Para cada dilución, esterilizar un esparcidor celular en etanol, pasarlo a través de una llama de quemador Bunsen, y enfriarto tocando la superficie del agar lejos del inoculado. Luego, usa el esparcidor celular para extender la suspensión celular hasta que la superficie de la placa de agar se seque. Incubar las placas al revés a 37 grados centígrados. Una vez que surgen colonias visibles, contar el número de colonias bacterianas en cada plato. Registre estos valores y sus factores de dilución asociados para cada placa en cada punto de tiempo.

Para crear una curva de crecimiento OD 600, después de asegurarse de que todos los puntos de datos se introducen correctamente en una tabla, seleccione todos los puntos de tiempo y sus datos correspondientes. Para generar una parcela de curva de crecimiento de unidad de formación de colonias, elija la placa de dilución donde el recuento de colonias cayó dentro del rango de 30 a 300 bacterias para cada punto de tiempo. Multiplique el número de recuento de colonias por el factor de dilución y, a continuación, por diez. Esto se debe a que la propagación de 100 microlitros se considera una dilución adicional de 1:10 al calcular unidades formadoras de colonias por mililitro. Después de esto, trazar las unidades formadoras de colonias frente al tiempo en una escala de semi-registro.

Estas parcelas producidas con mediciones de OD 600 y CFU, respectivamente, pueden proporcionar información valiosa sobre la cinética de crecimiento de E. coli. La densidad óptica y las unidades formadoras de colonias pueden estar relacionadas, de modo que los UFC por mililitro se pueden estimar a partir de mediciones de 600 OD, ahorrando tiempo y materiales en futuros experimentos.

Para ello, trazar las unidades formadoras de colonias contra la densidad óptica en una escala lineal para OD 600 lecturas menores o iguales a 1. 0. Después de esto, genere una línea de tendencia de regresión lineal en formato Y – MX + B, donde M es la pendiente y B es la intercepción y. Haga clic con el botón derecho en los puntos de datos y seleccione añadir línea de tendencia y lineal. A continuación, marque la casilla para mostrar la ecuación en el gráfico y mostrar el valor cuadrado R en el gráfico. El valor R al cuadrado es la medida estadística de la distancia con la que los datos coinciden con la línea de regresión ajustada. En este ejemplo, los primeros 6 puntos de tiempo se trazan con OD 600 en el eje x y UFC por mililitro en el eje y. En experimentos futuros con las mismas condiciones de crecimiento, estos valores de pendiente e intercepción y se pueden conectar a esta ecuación para estimar las UFC a partir de las lecturas OD 600. A continuación, mire la parcela de la curva de crecimiento de la unidad de formación de colonias. Durante la fase exponencial, identifique dos puntos de tiempo con la pendiente más pronunciada entre ellos. Para calcular el tiempo de duplicación, primero calcule el cambio de tiempo entre los puntos de tiempo seleccionados. A continuación, calcule el cambio en las generaciones utilizando la ecuación que se muestra aquí. Aquí, el caso inferior b es el número de bacterias en el punto de tiempo tres y el caso superior B es el número de bacterias en el punto de tiempo dos. Por último, divida el cambio en el tiempo por el cambio en las generaciones. En este ejemplo, el tiempo de duplicación es 0. 26 horas o 15 minutos y 19 segundos. Comparar los tiempos de duplicación en diferentes tratamientos experimentales nos permite identificar las mejores condiciones de crecimiento para una determinada especie bacteriana. Por lo tanto, el tratamiento con el menor tiempo de duplicación será el más óptimo de las condiciones probadas.