Pruebas de susceptibilidad a los antibióticos: Pruebas con epsilometro para determinar los valores de la CMI de dos antibióticos y evaluar la sinergismos

1. Pruebas de epsiómetro (pruebas E)

1. Configuración
   1. Use guantes y un abrigo de laboratorio
   2. Preparar el espacio de trabajo esterilizando con 70% de etanol
   3. Recoger placas de agar Mueller-Hinton (placas MHA)
2. Preparación de un estándar de turbidez de McFarland No. 0.5
   1. Preparar una solución al 1% de cloruro de bario (BaCl_2):
      Añadir 1 gramo de cloruro de bario anhidro (BaCl₂) en 100 ml de agua destilada. Vórtice bien.
   2. Preparar una solución al 1% de ácido sulfúrico (H₂SO₄):
      Añadir 1 mL de concentrado H₂SO₄ en 99 mL de agua destilada. Vórtice bien.
   3. Preparar un estándar de turbidez de McFarland No. 0.5:
      50 L BaCl₂ solución en 5 ml de 1% H₂SO₄ solución. Vortex la solución bien para obtener una suspensión turbia.
   4. Mantenga el estándar de turbidez De McFarland No. 0.5 en un tubo cubierto de papel de aluminio. Conservar a 25oC durante un máximo de 6 meses. Vórtice bien a una solución homogénea antes de su uso.
3. Preparación de placas MHA
   1. Raspar Streptococcus grupo G bacterias de la placa de agar de la sangre utilizando un lazo estéril. Mezclar en 1 ml de salina, y vórtice a una suspensión de la bacteria.
   2. Compare la suspensión con un estándar McFarland No. 0.5 para lograr la misma turbidez con el fin de tener el mismo tamaño de inóculo durante los experimentos. Ajuste la concentración utilizando salina adicional o bacterias.
   3. Inocular las placas MHA utilizando un aplicador estéril de punta de algodón. Swab la placa suavemente para cubrir la superficie. Continúe con uno de los tres métodos descritos a continuación (1.4-1.6).
4. Prueba única de resistencia a antibióticos. Streptococcus grupo G, resistencia a la penicilina G o gentamicina 
   1. Coloque una tira de prueba en E (ya sea penicilina G o gentamicina) en el centro de la placa MHA(Figura 1 A,B).
   2. Incubar durante 18-20 horas, 37oC.
   3. Lea los resultados. MIC se mide como la zona de inhibición que interseca la tira de prueba de antibióticos calificada(Figura 1 C,D).

Figura 1: Prueba E única. Colocación de una tira de prueba E de A) penicilina G y B) gentamicina en una placa de agar Mueller Hinton cubierta con colonias bacterianas de un grupo G estreptococos antes (A y B) y después (C y D) durante la noche incubación a 37oC 5% CO₂. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Pruebas de sinergia entre enfoques. Streptococcus grupo G, resistencia a la penicilina G y gentamicina.
   1. Coloque dos tiras de prueba en E con diferentes antibióticos (por ejemplo, penicilina G y gentamicina) en la placa de MHA inoculada en una formación cruzada.
      1. Para obtener los resultados más precisos, el objetivo es colocar la cruz en un ángulo de aproximadamente 90o en la intersección entre las escalas en sus valores MIC, previamente determinados en una sola prueba de resistencia a los antibióticos(Figura 2 A).
      2. Tenga en cuenta que una vez que las tiras se colocan en la placa de agar, no se deben mover, ya que algunos antibióticos ya pueden haber sido absorbidos por la placa. Por lo tanto, es más apropiado mantener las tiras en un ángulo ligeramente incorrecto (por ejemplo, 85o) y hasta 1-2 mm desde el valor REAL de MIC. Se recomienda ejecutar el experimento en triplicado para reducir este problema.
   2. Incubar durante 18-20 horas, 37oC.
   3. Lea los resultados. MIC se mide como la zona de inhibición que interseca la tira de prueba de antibióticos calificada en cada tira de prueba E respectiva(Figura 2 B).
   4. Utilice la fórmula para la concentracióninhibitoriafraccionaria (FIC) (Ecuación 1 ) con el fin de determinar la sinergia.

Figura 2: Detección de sinergismo - prueba cruzada. Resultados de las pruebas de sinergia antimicrobiana de MIC de penicilina G y gentamicina en Streptococcus grupo G antes (A) y después (B) incubación durante la noche a 37oC 5% CO₂. Se forma un ángulo de 90o entre los dos valores individuales de MIC (penicilina G: 0,094 g/ml, gentamicina: 8 g/ml). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Pruebas de sinergia enfoque no cruzado. Streptococcus grupo G, resistencia a la penicilina G y gentamicina.
   1. Coloque la tira de prueba E en el centro de la placa MHA(Figura 3 A,D).
   2. Marque dónde estaba el valor MIC previamente determinado en cada tira.
   3. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
   4. Deseche la tira de prueba E para cada placa MHA(Figura 3 B,E).
   5. Coloque la segunda tira de prueba E (que contiene un antibiótico diferente) en el área de la tira eliminada anteriormente, respectivamente, para que sus valores MIC se correspondan con la marca y estén alineados.
   6. Incubar durante 18-20 horas, 37oC.
   7. Lea los resultados. MIC se mide como la zona de inhibición que interseca la tira de prueba de antibióticos calificada en cada tira de prueba E respectiva(Figura 3 C,F).
   8. Para determinar la sinergia, se utiliza la fórmula para la concentracióninhibitoriafraccionaria (FIC) ( Ecuación 1 ).

Figura 3: Detección de sinergismo - prueba no cruzada. Resultados de las pruebas de sinergia antimicrobiana de MIC de penicilina G y gentamicina en Streptococcus grupo G. A) Tira de gentamicina (8 g/ml centrada) sobre la bacteria Streptococcus group G, B) Extirpación de la tira de gentamicina, C ) Tira combinada de gentamicina/penicilina G (0,094 g/ml centrada) sobre bacterias Streptococcus grupo G, D) Tira G de penicilina (0,094 g/ml centrada), E) Eliminación de la tira de penicilina G, F) Penicilina combinada G / tira de gentamicina (8 g/ml centrada) encima de la bacteria Streptococcus grupo G. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Pruebas de caldo

1. Configuración
   1. Use guantes y un abrigo de laboratorio
   2. Preparar el espacio de trabajo esterilizando con 70% de etanol
   3. Recoger caldo MH de 15 ml con 50% de sangre de caballo lysed y 20 mg/mL-NAD (MH-F)
2. (Opcional) Realizar una prueba E [Protocolo 1] para determinar el MIC en medio sólido
   1. Si bien es opcional, estos conocimientos permitirán un mejor diseño experimental (por ejemplo, las concentraciones de antibióticos añadidos se pueden diseñar para rodear el valor MIC determinado a partir de la placa), mejorando las posibilidades de un experimento exitoso.
3. Preparación de un inóculo bacteriano. Como se indicó anteriormente, la concentración bacteriana puede estimarse mediante mediciones de OD nm o normas de turbidez de McFarland
   1. OD600 nm Método
      1. Obtener una suspensión bacteriana con una concentración bacteriana establecida
      2. Diluir el cultivo en caldo MH-F para lograr un OD600 de 0.003
   2. Método de turbidez de McFarland
      1. Poner 15 ml de caldo MH-F en un tubo estéril.
      2. Inocular el caldo MH-F con bacterias (desde un plato) hasta un nivel mcFarland. Vortex la solución vigorosamente. Vierta la solución en un plato estéril de Petri.
4. Preparación de antibióticos
   1. Determinar la concentración de antibióticos deseados
      1. Identificar el valor MIC a partir de la prueba E- (por ejemplo, 0,125 g/ml para la penicilina G y 8 g/ml para la gentamicina)
      2. Multiplique el valor MIC de la placa de agar por 2⁴-2⁷, correspondiente a cuatro-siete 2x diluciones en serie. Esta será la concentración inicial de antibióticos. (por ejemplo, para la penicilina G, siete 2x diluciones en serie: 0,125 g/ml x 2⁷ x 16 g/mL; para la gentamicina, cuatro diluciones en serie 2x 8 g/ml x 2^x 128 g/ml
      3. Multiplicar el valor inicial deseado 100x para determinar generar una concentración en stock de los antibióticos (por ejemplo, existencias de 1,6 mg/ml de penicilina G y 12,8 mg/ml de gentamicina)
   2. Preparar una concentración de 100 x reservas de antibióticos en consecuencia
      1. Disolver los antibióticos en agua autoclave de 10 ml y vórtice para generar una solución en stock (por ejemplo, 16 mg de penicilina G y 128 mg de gentamicina para crear las existencias anteriores)
5. Añadir bacterias a los pozos de microplacas
   1. Aliquot 200 l caldo MH-F que contiene bacterias inóculo a los pozos en las primeras 3 filas de una placa microtíter de 96 pocillos para un experimento en triplicado.
6. Añadir antibióticos a los pozos de microplacas
   1. Añadir 200 l de caldo MH-F extra con bacterias a la primera columna de pozos (A1, B1, C1) para llevar el volumen total a 400 l.
   2. Añadir 4 l de la concentración de antibióticos a la primera columna de pozos. Dado que la muestra contiene 400 l, dará lugar a una dilución 100x de los antibióticos.
   3. Genere una dilución en serie 2x transfiriendo bacterias/antibióticos de 200 l de A1 a A2, hasta A11. Pipet a la fuerza entre las diluciones. Repita el paso para filas adicionales.
   4. Retire 200 l de la columna 11 para que el volumen final en todos los pozos sea de 200 l.
   5. Deje la última columna (A12, B12, C12) sin antibióticos, como controles.
7. Determinar los valores MIC
   1. Incubar la placa microtíter de 96 pocillos durante 24 horas a 37oC sin agitar.
   2. El valor MIC se define como el último pozo de la serie de dilución que no presenta crecimiento visible de bacterias(Figura 4). Este valor, sin embargo, solo se puede confiar si el tamaño del inóculo original era correcto.

Figura 4: Determinación de MIC por dilución de caldo. MIC se define aquí como el último pozo que exhibe claridad (sin crecimiento de bacterias) antes de que cambie la turbidez. Fila son duplicados del valor MIC de penicilina G y fila son duplicados del valor MIC de gentamicina, ambos frente a un aislado de Streptococcus grupo G. A) resultado experimental real, B) interpretación esquemática de los valores de A ( gris- sin crecimiento; blanco- crecimiento). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Procedimiento esquemático de la serie de dilución para contar la concentración de bacterias originales. Las diluciones se realizaron como se describe (20 l diluidos en 180 l para una serie de dilución de 10x), y luego 10 l de las filas A-H se chapan en dos placas de agar sanguíneo separadas como se indica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

8. Determinar el tamaño original del inóculo
   NOTA: Los ensayos de microbroth son muy sensibles para el tamaño original del inóculo utilizado. Un tamaño excesivo de inóculo dará un resultado falso positivo, ya que los antibióticos añadidos no serán capaces de inhibir el crecimiento por más tiempo en esa proporción. Por lo tanto, es fundamental verificar cuántas bacterias se han añadido a los micropozos. Si bien los datos no estarán disponibles en el punto del experimento (debido a la necesidad de 24 horas de incubación) servirá naseado como control. Si el número de bacterias añadidas está dentro del rango de concentración indicado, se puede confiar en los valores MIC. Si el inóculo era demasiado alto o demasiado bajo, el experimento debe repetirse.
   1. Diluir en serie las bacterias
      1. Preparar una placa microtíter de 96 pocillos para diluir la concentración bacteriana original con el fin de determinar el tamaño del inóculo. El óptimo es un volumen de 200 l con 10^5-6 bacterias. Para realizar las diluciones, primero alícuota 180 l PBS estéril a cada pocto en B-H (en triplicado 1-3).
      2. A continuación, añadir 100 l de solución bacteriana a A (en triplicado 1-3).
      3. Generar una dilución en serie de 10x (en triplicado) transfiriendo 20 l de bacterias de A a B, pipeteo vigorosamente. Repita los pasos para C-H.
   2. Placa las diluciones bacterianas para la determinación del tamaño del inóculo
      1. Marque las placas de agar de sangre de acuerdo con la Figura 5.
      2. Transfiera 10 l de la dilución en serie a la placa de acuerdo con la figura 5.
      3. Incubar la placa a 37oC durante 20-24 horas.
   3. Determinar el tamaño del inóculo bacteriano
      1. Contar números bacterianos en manchas dentro de 5-50 colonias(Figura 6).
      2. Calcular el tamaño inicial del inóculo calculando la media de las muestras triplicadas, multiplicar por el factor de dilución (por ejemplo, 10x para muestras B, 100x para muestras C, 1000x para muestras D, etc.) y luego por 100 para compensar el volumen de detección de 10 sL, lo que resulta en el tamaño del inóculo en cfu/ml. Si el inóculo está dentro de 10^5-6 cfu/mL los datos MIC pueden ser de confianza.

Figura 6: Determinación del tamaño del inóculo. Las bacterias inoculadas según la figura 5 fueron incubadas durante 20-24 horas a 37oC y luego contadas. La fila D tiene un buen número de colonias que contar (por ejemplo, 5-50). Las muestras en A no se diluyen, B se diluye 10x, C se diluye 100x, y D se diluye 1000x, y sólo 10 l se chapa en cada punto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.