6.9: Ensayo de placa: Un método para determinar los títulos virales como unidades formadoras de placas (UFP)

1. Configuración

1. Antes de empezar cualquier trabajo que involucre microbios, asegúrese de que el espacio de trabajo esté esterilizado(por ejemplo, limpiado con 70% de etanol). Use siempre una capa de laboratorio y guantes, mantenga el cabello largo atado hacia atrás y asegúrese de que las heridas estén particularmente bien protegidas.
2. Cuando haya terminado, esterilizar todas las superficies y lavar/esterilizar a fondo las manos y las muñecas.

2. Protocolo

1. Preparación de LB Media
   Nota: Dependiendo de la cepa bacteriana del huésped y del bacteriófago, un medio líquido diferente puede ser más adecuado para el cultivo inicial de la cepa bacteriana huésped o un medio sólido diferente puede ser más adecuado para el crecimiento posterior. El caldo de lysabagenia (LB) se utiliza en este protocolo para el caldo y el agar.
   1. Mezclar 4 g LB en 200 ml de agua destilada, en triplicado, para el caldo LB, el agar inferior sólido y el agar superior suave. Todas las soluciones deben prepararse en recipientes capaces de contener el doble del volumen final para evitar el desbordamiento durante el autoclave.
      Nota: Si realiza el ensayo en triplicado, prepare el doble de agar inferior LB.
   2. Ajuste el pH de las tres soluciones a 7.4 utilizando NaOH o HCl según corresponda.
   3. Añadir 3 g de potencia de agar a la botella de agar inferior para hacer una solución de agar del 1,5% para el agar sólido
   4. Añadir 1,2 g de potencia de agar a la botella de agar superior para hacer una solución de agar 0.6% para agar suave.
   5. Colocar las botellas, con tapas semiapretadas, en un autoclave ajustado a 121oC durante 20 min para esterilizar las soluciones. Cierre las tapas tan pronto como finalice la carrera para evitar la contaminación.
   6. Cuando el medio LB haya alcanzado una temperatura de aproximadamente 45-50 oC, agregue 450 ml de 1 M CaCl₂ estéril a las tres soluciones LB de 200 ml para realizar una concentración final de 2,25 mM.
   7. Vierta las alícuotas de 15 ml del medio de agar sólido en platos estériles de Petri (evitar agitar para evitar la formación de espuma) y deje que el agar se solidifique durante unas horas o durante la noche a temperatura ambiente(Figura 4A). Las placas se pueden almacenar boca abajo a 4oC durante varios días.
2. Cultivo de células huésped
   1. Un día antes del ensayo, añadir 10 ml de cultivo de E. coli a 10 ml de caldo LB.
   2. Incubar las bacterias a 37oC durante la noche a 160 rpm en una incubadora de temblores.
   3. La mañana del ensayo, añadir 0,5 ml del cultivo nocturno a 10 ml de LB fresco.
      Nota: Si usted está realizando el ensayo en triplicado, preparar el doble de la cantidad de esta cultura.
   4. Incubar a 37oC a 160 rpm en una incubadora de agitación hasta que el cultivo bacteriano se encuentre en crecimiento en fase log. Esto se puede determinar espectrofotométricamente por un OD600 de 0.5-0.7.
   5. Mantenga el cultivo a temperatura ambiente hasta que las bacterias se añadan al agar LB superior.
3. 10 veces dilución serial de bacteriófagos
   1. Añadir 180 l de caldo LB a siete pocillos en la primera fila de a a un plato de 96 pocillos
      Nota: Se sugiere realizar la dilución en triplicado con el fin de aumentar su fiabilidad estadística. Para ello, preparar diluciones adicionales del bacteriófago en la segunda y tercera filas de la placa.
   2. Reórse cuidadosamente la muestra original del bacteriófago para asegurar la homogeneidad y transferir 20 ml al primer pozo.
   3. Mezcle bien la muestra pipeteando y hacia abajo.
   4. Transfiera 20 s de la suspensión resultante al segundo pozo.
   5. Continúe la dilución en serie transfiriendo 20 l de la solución en el segundo pozo al tercer pozo, y así sucesivamente, hasta el sexto pozo, dejando el séptimo así como un control negativo al que no se añadirá ninguna suspensión de fago. Esto creará un rango de dilución de 10^-1-10^-6.
4. Galjanoplastia
   1. Etiquetar la base de los platos de Petri (previamente preparados en el paso 2.1.7) con nombre, fecha y una breve descripción de la muestra (incluido el factor de dilución de la muestra de fago). Precalienta los platos de Petri en una incubadora de 37oC una hora antes del ensayo.
   2. Derretir el agar-medio solidificado (típicamente hecho usando un microondas; el agar solidificado se derrite a 85 oC), y dejar que llegue a alrededor de 45 oC. El medio calentado se puede colocar en un baño de agua de 45oC durante 1 h para alcanzar una temperatura adecuada. Debe estar lo suficientemente caliente como para permanecer en forma líquida, pero lo suficientemente fresco como para no matar bacterias añadidas.
   3. Mezclar el cultivo bacteriano de 4 ml (del paso 2.2) con el agar blando de 35 ml LB (a 45oC). Gire para distribuir uniformemente las células, pero evite agitar para evitar la formación de espuma(Figura 4A).
   4. Etiquetar un tubo de ensayo estéril para cada uno de los pasos de dilución en serie y otro para la muestra de control, para un total de 7 tubos de ensayo etiquetados. Coloque 5 alícuotas ml del cultivo bacteriano/mezcla de agar suave del paso 2.4.3 en los 7 tubos. Trabaje rápidamente a través del paso 2.4.6 porque estos pequeños volúmenes de medios a base de agar se solidificarán rápidamente a temperatura ambiente.
   5. Añadir 100 l de la muestra de control (del paso 2.3) al tubo de ensayo de control y girar con cuidado. Deseche la punta de pipeta usada y transfiera el mismo volumen de cada una de las muestras de bacteriófagos diluidos en serie (paso 2.3) a sus respectivos tubos de ensayo, girando para mezclar.
   6. Transfiera inmediatamente las mezclas de 5 ml a las placas de agar sólidas etiquetadas, precalentadas(Figura 4A). Gire suavemente las placas para extender las mezclas.
      Nota: Si está realizando el ensayo por triplicado, repita los pasos 2.4.3-6 dos veces más.
   7. Sellar cada placa con película de laboratorio, y permitir que ambas capas se solidifiquen correctamente a temperatura ambiente (aproximadamente 15 minutos) antes de colocarlas de lado abajo una incubadora de 37oC, estimulando el crecimiento tanto de las bacterias como del fago, durante 24 horas o hasta que las placas desarrollar, Por lo general toma alrededor de 1-5 días para que aparezcan las placas(Figura 4B),pero el momento varía considerablemente dependiendo de las condiciones de incubación, medio, y las especies bacterianas.

3. Análisis de datos y resultados

1. Contar placas
   1. Asegúrese de que no haya placas visibles en las placas marcadas como "control", ya que esto indicaría contaminación viral.
   2. Comience con las placas etiquetadas 10^-6, que contengan la muestra de bacteriófago más diluida. Cuente las placas sin quitar la tapa, marcándolas con un bolígrafo a medida que vaya para indicar qué placas ya se han contado.
   3. Cuente las placas restantes. Algunas placas pueden tener muy pocas o demasiadas placas para contar. Utilice las placas con 10-150 placas para su posterior análisis.
2. Cálculo de PFU
   1. Divida el número de placas por el factor de dilución(porejemplo, 10^-6 para la muestra más diluida) para obtener el número de unidades formadoras de placas (PFU) en 100 ml de mezcla de fago.
      Nota: Si realiza el ensayo en triplicado, utilice el número medio de placas de las tres placas.
   2. Para determinar la concentración (en PFU/ml) de la muestra original, multiplique por un factor de dilución adicional de 10, ya que sólo se celado 100 ml de la muestra. (es decir)
   3. Calcular el valor medio de la PFU/ml para todas las diluciones que tenían entre 10 y 150 placas para lograr un resultado más confiable.

Los bacteriófagos, también llamados fagos, son virus que infectan específicamente a las bacterias y podemos confirmar su presencia y cuantificarlos utilizando una herramienta llamada ensayo de placa. Los bacteriófagos infectan a sus huéspedes susceptibles adhiriéndose primero a la pared celular bacteriana e inyectando su material genético. Luego, secuestran la maquinaria biosintética de la célula para replicar su ADN y producir numerosas partículas de fagos de progenie, que luego liberan lisando y matando a la célula huésped.

Esta actividad lítica es la base de una técnica de enumeración de fagos ampliamente utilizada conocida como ensayo de placa o ensayo de doble capa de agar. Aquí, primero se prepara una mezcla de bacteriófagos en un caldo de nutrientes fundidos que contiene agar de baja concentración. Todas las bacterias utilizadas en la mezcla deben estar vivas y dividirse activamente en la fase logarítmica de su crecimiento, lo que asegurará que un gran porcentaje de las bacterias sean viables y capaces de formar un césped denso alrededor de las placas. A continuación, esta mezcla de agar bacteriano y fagos fundidos se extiende sobre un medio nutritivo de agar más sólido y concentrado que ya está solidificado en una placa de Petri. En la incubación a temperatura ambiente, el caldo de baja concentración de agar-fagos-bacterias también se solidifica para formar una capa de agar suave.

Aquí, las células bacterianas pueden obtener nutrientes adicionales de la capa inferior y deberían multiplicarse rápidamente para producir un césped confluente de bacterias. Sin embargo, como las partículas de fagos también están presentes en la capa blanda, estas infectarán y replicarán su material genético dentro de las bacterias, culminando en la lisis celular, que libera múltiples progenies. Esta progenie de fagos infecta a las células vecinas, ya que el estado semisólido de la capa de bacterias-fagos restringe su movimiento a las células huésped ubicadas más distantes. Este ciclo de infección y lisis continúa durante múltiples rondas, matando una gran cantidad de bacterias en un área localizada. El efecto de la destrucción de las células vecinas es producir una sola zona circular clara, llamada placa, que se puede ver a simple vista, amplificando efectivamente la actividad lítica bacteriana del fago y permitiendo su enumeración.

El número de placas en una placa de Petri se denomina Unidades Formadoras de Placas, o PFU, y, siempre que la concentración inicial de bacteriófagos esté suficientemente diluida, debe corresponder directamente al número de partículas de fagos infecciosos en la muestra original. Esta técnica también se puede utilizar para la caracterización de la morfología de la placa, para ayudar en la identificación de tipos de fagos o para aislar mutantes de fagos. En este laboratorio, aprenderá a realizar el ensayo de placa para enumerar fagos, utilizando el fago T7 de E. coli como ejemplo.

En primer lugar, identificar un medio adecuado para el cultivo de las células bacterianas del huésped y del bacteriófago. En este caso, se utilizó caldo de lisogínia, o medio LB, para cultivar E. coli y el fago T7. A continuación, tome tres botellas de vidrio limpias y etiquételas con medios, nombre, y luego la primera como LB-Broth, la segunda como LB-Bottom Agar y la tercera como LB-Top Agar. Ahora, pese cuatro gramos de polvo LB preformulado en tres juegos y luego transfiera un juego de medios secos pesados a cada botella. Agrega 200 mililitros de agua a la primera botella. Mezcle el contenido con una barra magnética para agitar.

Luego, usando un medidor de pH y agitando constantemente, lleve el pH final a 7.4 mediante la adición de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico. Repita también la adición de agua y el ajuste del pH para las otras dos botellas restantes. Ahora, pesa tres gramos de agar en polvo y añádelo a la segunda botella para hacer un agar de fondo del 1,5 %. Por último, pesar 1. 2 gramos de agar y agréguelo a la tercera botella para hacer el agar superior de .6 % LB. La condición de caldo en la botella uno no necesita una adición de agar. Tape el frasco semiherméticamente y luego esterilice el medio esterilizándolo en autoclave a 121 grados centígrados durante 20 minutos. Una vez completado, retire las botellas de medios del autoclave e inmediatamente gire las tapas de las botellas para cerrarlas completamente y evitar la contaminación. Mantenga los medios LB-Broth y LB-Top Agar en el banco para su uso posterior. Coloque el agar LB-Bottom para que se enfríe en un baño de agua que está preestablecido a aproximadamente 45 grados centígrados.

Cuando el agar LB-Bottom alcance aproximadamente los 45 grados centígrados, transfiéralo al banco de trabajo. A continuación, esterilizar el espacio de trabajo con etenol al 70 %. A continuación, agregue 450 microlitros de cloruro de calcio estéril de un molar al agar de fondo fundido para obtener una concentración final de 2,25 milimolares. Agite suavemente la botella para mezclar. Luego, coloque siete placas de Petri limpias. Etiquete cada plato en la parte inferior con el nombre del medio y la fecha de preparación. Luego, vierta 15 mililitros del agar de fondo en cada una de las siete placas de Petri. Deje que las placas se asienten durante unas horas o toda la noche a temperatura ambiente. Una vez colocadas, las placas de cultivo se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante varios días si es necesario, boca abajo para minimizar la condensación. Transfiera las placas de Petri del refrigerador de cuatro grados Celsius a una incubadora de 37 grados Celsius una hora antes del ensayo.

El día antes de la realización del ensayo, se debe cultivar la E. coli. Aquí, se inocularon 10 microlitros de cultivo de E. coli en 10 mililitros de LB-Broth. Coloque las bacterias para que crezcan durante la noche en una incubadora agitadora configurada a 37 grados centígrados a 160 RPM. Luego, el día del ensayo, retire el cultivo bacteriano de la incubadora. Siembre 10 mililitros frescos de caldo LB fresco con 0,5 mililitros de cultivo durante la noche. Coloque estas células para que crezcan en una incubadora agitadora configurada a 37 grados Celsius a 160 RPM. A continuación, utilice un espectrofotómetro para comprobar cuándo este cultivo alcanza el crecimiento de la fase logarítmica, indicado por una densidad óptica de 0,5 a 0,7. Una vez que el OD alcanza este nivel, detenga la incubación transfiriendo el cultivo celular al banco. Ahora están listos para ser utilizados para el ensayo de superposición de fagos.

Los títulos de fagos pueden variar exponencialmente entre los diferentes tipos de fagos y muestras. Por lo tanto, para contarlos de manera efectiva, deben diluirse para generar una amplia gama de concentraciones de fagos. El día del ensayo, genere una serie de diluciones de fagos que van desde una décima hasta una millonésima parte de concentraciones, siguiendo una técnica de dilución de 10 veces. Para obtener datos estadísticamente significativos y precisos, realice la dilución en serie por triplicado.

A continuación, derrita el agar LB-top solidificado con un microondas. Luego, colóquelo en un baño de agua que está preestablecido a 45 grados centígrados durante una hora. Después de una hora, recoja las placas de Petri que contienen la capa inferior de agar de la incubadora. Etiquete las placas con la concentración de fagos y la fecha de ensayo. Luego, coloque siete tubos de ensayo limpios. Etiquete cada tubo de ensayo con el número de dilución de fagos en serie y designe uno como control.

Cuando el agar LB-top alcance los 45 grados centígrados, transfiéralo al banco de trabajo. Ahora, agregue 450 microlitros de cloruro de calcio molar al agar de 200 mililitros para hacer una concentración final de 2.25 milimolar. Agite suavemente la botella para mezclar. A continuación, agregue 35 mililitros de agar LB-top y cuatro mililitros de suspensión bacteriana a un tubo cónico estéril. Gire suavemente para distribuir uniformemente las células, pero evite agitar para evitar la formación de espuma.

Ahora, alícuota cinco mililitros de esta mezcla de agar superior de bacterias a cada uno de los siete tubos de ensayo. Luego, transfiera 100 microlitros de las muestras de bacteriófagos diluidos en serie y los medios de control, que deben ser simplemente medios sin bacteriófagos, a los tubos de ensayo marcados respetuosamente. Agite la mezcla suavemente para asegurar una mezcla adecuada. Transfiera suavemente cinco mililitros de mezcla de bacteriófagos a la placa de Petri respectiva. Extienda uniformemente la mezcla por toda la superficie girando suavemente la placa de Petri.

Una vez que todas las placas de Petri estén cubiertas con la mezcla, permita la solidificación de la capa superior incubando a temperatura ambiente durante 15 minutos. Una vez completados estos pasos, repita el proceso para el segundo y luego el tercer conjunto de placas de Petri utilizando los dos conjuntos restantes de diluciones de fagos. Selle cada plato con parafilm e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Coloque la placa de cultivo boca abajo a una temperatura adecuada durante 24 horas o hasta que se desarrollen placas. Aquí, las placas se colocaron en una incubadora a 37 grados centígrados durante un día, una condición de crecimiento estimulante para E. coli y el fago T7.

Las placas aparecerán después de uno a cinco días de incubación, dependiendo de la especie bacteriana, las condiciones de incubación y la elección del medio. Aquí, las placas eran visibles después de un día de incubación a 37 grados centígrados. Comience por verificar las placas marcadas como control y asegúrese de que no se hayan formado placas en estas placas, ya que esto indicaría contaminación viral. Para determinar el título de fagos en la muestra original, comience primero con las placas que contienen la muestra de fagos más diluida y cuente las placas sin quitar las tapas, marcándolas para indicar cuáles ya se han contado. Repita el conteo para cada plato en cada serie. Algunas placas pueden tener demasiadas o muy pocas placas para contarlas. Considere de 10 a 150 como un recuento ideal de placas.

A continuación, genere una tabla que enumere los valores del número de placa para las diferentes diluciones y réplicas. A continuación, calcule los valores medios del número de placas para las placas de dilución que contenían el número ideal de recuentos de placa. En este ejemplo, este fue el número promedio de placas formadas en las placas de dilución de 10 a menos tres y de 10 a menos cuatro. Ahora, ajuste el factor de dilución de fagos dividiendo los valores medios de placa obtenidos por los respectivos factores de dilución de fagos. Aquí, el número promedio de placas formadas a las placas de dilución de 10 a menos tres y de 10 a menos cuatro veces, se dividió por sus respectivos factores de dilución para obtener el número de unidades formadoras de placas, o PFU, en 100 microlitros de mezcla de fagos. Para convertir el valor a PFU por mililitro, multiplique los valores generados por 10, ya que solo se utilizaron 100 microlitros de mezcla de dilución de fagos durante el paso de preparación de la superposición de bacteriófagos, lo que produjo un factor de dilución adicional de 10. Por último, calcular la media de los valores obtenidos de las diferentes placas de dilución. Esto dará el número promedio de PFU por mililitro. El número de PFU corresponde al número de partículas de fagos infecciosos en la muestra original.