Ensayo de placa: Un método para determinar los títulos virales como unidades formadoras de placas (UFP)

1. Configuración

1. Antes de empezar cualquier trabajo que involucre microbios, asegúrese de que el espacio de trabajo esté esterilizado(por ejemplo, limpiado con 70% de etanol). Use siempre una capa de laboratorio y guantes, mantenga el cabello largo atado hacia atrás y asegúrese de que las heridas estén particularmente bien protegidas.
2. Cuando haya terminado, esterilizar todas las superficies y lavar/esterilizar a fondo las manos y las muñecas.

2. Protocolo

1. Preparación de LB Media
   Nota: Dependiendo de la cepa bacteriana del huésped y del bacteriófago, un medio líquido diferente puede ser más adecuado para el cultivo inicial de la cepa bacteriana huésped o un medio sólido diferente puede ser más adecuado para el crecimiento posterior. El caldo de lysabagenia (LB) se utiliza en este protocolo para el caldo y el agar.
   1. Mezclar 4 g LB en 200 ml de agua destilada, en triplicado, para el caldo LB, el agar inferior sólido y el agar superior suave. Todas las soluciones deben prepararse en recipientes capaces de contener el doble del volumen final para evitar el desbordamiento durante el autoclave.
      Nota: Si realiza el ensayo en triplicado, prepare el doble de agar inferior LB.
   2. Ajuste el pH de las tres soluciones a 7.4 utilizando NaOH o HCl según corresponda.
   3. Añadir 3 g de potencia de agar a la botella de agar inferior para hacer una solución de agar del 1,5% para el agar sólido
   4. Añadir 1,2 g de potencia de agar a la botella de agar superior para hacer una solución de agar 0.6% para agar suave.
   5. Colocar las botellas, con tapas semiapretadas, en un autoclave ajustado a 121oC durante 20 min para esterilizar las soluciones. Cierre las tapas tan pronto como finalice la carrera para evitar la contaminación.
   6. Cuando el medio LB haya alcanzado una temperatura de aproximadamente 45-50 oC, agregue 450 ml de 1 M CaCl₂ estéril a las tres soluciones LB de 200 ml para realizar una concentración final de 2,25 mM.
   7. Vierta las alícuotas de 15 ml del medio de agar sólido en platos estériles de Petri (evitar agitar para evitar la formación de espuma) y deje que el agar se solidifique durante unas horas o durante la noche a temperatura ambiente(Figura 4A). Las placas se pueden almacenar boca abajo a 4oC durante varios días.
2. Cultivo de células huésped
   1. Un día antes del ensayo, añadir 10 ml de cultivo de E. coli a 10 ml de caldo LB.
   2. Incubar las bacterias a 37oC durante la noche a 160 rpm en una incubadora de temblores.
   3. La mañana del ensayo, añadir 0,5 ml del cultivo nocturno a 10 ml de LB fresco.
      Nota: Si usted está realizando el ensayo en triplicado, preparar el doble de la cantidad de esta cultura.
   4. Incubar a 37oC a 160 rpm en una incubadora de agitación hasta que el cultivo bacteriano se encuentre en crecimiento en fase log. Esto se puede determinar espectrofotométricamente por un OD600 de 0.5-0.7.
   5. Mantenga el cultivo a temperatura ambiente hasta que las bacterias se añadan al agar LB superior.
3. 10 veces dilución serial de bacteriófagos
   1. Añadir 180 l de caldo LB a siete pocillos en la primera fila de a a un plato de 96 pocillos
      Nota: Se sugiere realizar la dilución en triplicado con el fin de aumentar su fiabilidad estadística. Para ello, preparar diluciones adicionales del bacteriófago en la segunda y tercera filas de la placa.
   2. Reórse cuidadosamente la muestra original del bacteriófago para asegurar la homogeneidad y transferir 20 ml al primer pozo.
   3. Mezcle bien la muestra pipeteando y hacia abajo.
   4. Transfiera 20 s de la suspensión resultante al segundo pozo.
   5. Continúe la dilución en serie transfiriendo 20 l de la solución en el segundo pozo al tercer pozo, y así sucesivamente, hasta el sexto pozo, dejando el séptimo así como un control negativo al que no se añadirá ninguna suspensión de fago. Esto creará un rango de dilución de 10^-1-10^-6.
4. Galjanoplastia
   1. Etiquetar la base de los platos de Petri (previamente preparados en el paso 2.1.7) con nombre, fecha y una breve descripción de la muestra (incluido el factor de dilución de la muestra de fago). Precalienta los platos de Petri en una incubadora de 37oC una hora antes del ensayo.
   2. Derretir el agar-medio solidificado (típicamente hecho usando un microondas; el agar solidificado se derrite a 85 oC), y dejar que llegue a alrededor de 45 oC. El medio calentado se puede colocar en un baño de agua de 45oC durante 1 h para alcanzar una temperatura adecuada. Debe estar lo suficientemente caliente como para permanecer en forma líquida, pero lo suficientemente fresco como para no matar bacterias añadidas.
   3. Mezclar el cultivo bacteriano de 4 ml (del paso 2.2) con el agar blando de 35 ml LB (a 45oC). Gire para distribuir uniformemente las células, pero evite agitar para evitar la formación de espuma(Figura 4A).
   4. Etiquetar un tubo de ensayo estéril para cada uno de los pasos de dilución en serie y otro para la muestra de control, para un total de 7 tubos de ensayo etiquetados. Coloque 5 alícuotas ml del cultivo bacteriano/mezcla de agar suave del paso 2.4.3 en los 7 tubos. Trabaje rápidamente a través del paso 2.4.6 porque estos pequeños volúmenes de medios a base de agar se solidificarán rápidamente a temperatura ambiente.
   5. Añadir 100 l de la muestra de control (del paso 2.3) al tubo de ensayo de control y girar con cuidado. Deseche la punta de pipeta usada y transfiera el mismo volumen de cada una de las muestras de bacteriófagos diluidos en serie (paso 2.3) a sus respectivos tubos de ensayo, girando para mezclar.
   6. Transfiera inmediatamente las mezclas de 5 ml a las placas de agar sólidas etiquetadas, precalentadas(Figura 4A). Gire suavemente las placas para extender las mezclas.
      Nota: Si está realizando el ensayo por triplicado, repita los pasos 2.4.3-6 dos veces más.
   7. Sellar cada placa con película de laboratorio, y permitir que ambas capas se solidifiquen correctamente a temperatura ambiente (aproximadamente 15 minutos) antes de colocarlas de lado abajo una incubadora de 37oC, estimulando el crecimiento tanto de las bacterias como del fago, durante 24 horas o hasta que las placas desarrollar, Por lo general toma alrededor de 1-5 días para que aparezcan las placas(Figura 4B),pero el momento varía considerablemente dependiendo de las condiciones de incubación, medio, y las especies bacterianas.

3. Análisis de datos y resultados

1. Contar placas
   1. Asegúrese de que no haya placas visibles en las placas marcadas como "control", ya que esto indicaría contaminación viral.
   2. Comience con las placas etiquetadas 10^-6, que contengan la muestra de bacteriófago más diluida. Cuente las placas sin quitar la tapa, marcándolas con un bolígrafo a medida que vaya para indicar qué placas ya se han contado.
   3. Cuente las placas restantes. Algunas placas pueden tener muy pocas o demasiadas placas para contar. Utilice las placas con 10-150 placas para su posterior análisis.
2. Cálculo de PFU
   1. Divida el número de placas por el factor de dilución(porejemplo, 10^-6 para la muestra más diluida) para obtener el número de unidades formadoras de placas (PFU) en 100 ml de mezcla de fago.
      Nota: Si realiza el ensayo en triplicado, utilice el número medio de placas de las tres placas.
   2. Para determinar la concentración (en PFU/ml) de la muestra original, multiplique por un factor de dilución adicional de 10, ya que sólo se celado 100 ml de la muestra. (es decir)
   3. Calcular el valor medio de la PFU/ml para todas las diluciones que tenían entre 10 y 150 placas para lograr un resultado más confiable.