JoVE Science Education

Advanced Biology

Ensayo de placa: Un método para determinar los títulos virales como unidades formadoras de placas (UFP)

JoVE Science Education
Microbiology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Microbiology

Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

6.8: Microscopy and Staining: Gram, Capsule, and Endospore Staining

6.10: Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

185,089 Views

•

13:00 min

•

April 30, 2023

Overview

Fuente: Tilde Andersson¹, Rolf Lood¹
¹ Departamento de Ciencias Clínicas Lund, División de Medicina de Infecciones, Centro Biomédico, Universidad de Lund, 221 00 Lund, Suecia

Los virus que infectan los organismos procaloicos, llamados bacteriófagos o simplemente fagos, fueron identificados a principios^del siglo XX por Twort (1) y d’Hérelle (2) de forma independiente. Desde entonces, los fagos han sido ampliamente reconocidos por su valor terapéutico (3) y su influencia en los ecosistemas humanos (4), así como en los ecosistemas globales (5). Las preocupaciones actuales han impulsado un renovado interés en el uso de fagos como alternativa a los antibióticos modernos en el tratamiento de enfermedades infecciosas (6). Esencialmente toda la investigación de fagose se basa en la capacidad de purificar y cuantificar virus, también conocido como un titer viral. Descrito inicialmente en 1952, este fue el propósito del ensayo de placa (7). Décadas y múltiples avances tecnológicos más tarde, el ensayo de placa sigue siendo uno de los métodos más fiables para la determinación del titer viral (8).

Los bacteriófagos subsisten inyectando su material genético en las células huésped, secuestrando las máquinas para la producción de nuevas partículas de fago, y eventualmente causando que el huésped libere numerosos viriones de progenie a través de la lisis celular. Debido a su tamaño minúsmico, los bacteriófagos no se pueden observar utilizando únicamente microscopía de luz; por lo tanto, se requiere microscopía electrónica de barrido (Figura 1). Además, los fagos no se pueden cultivar en placas de agar nutricionales como bacterias, ya que necesitan células huésped para abeste.

Figura 1: La morfología de un bacteriófago, aquí ejemplificada por un fago E. coli, se puede estudiar mediante microscopía electrónica de barrido. La mayoría de los bacteriófagos pertenecen a Caudovirales (bacteriófagos de cola). Este fago en particular tiene una estructura de cola muy corta y una cabeza icosahedral, colocándola en la familia de Podovirus.

El ensayo de placa (Figura 2) se basa en la incorporación de células huésped, preferentemente en el crecimiento de la fase log, en el medio. Esto crea una capa densa y turbia de bacterias capaces de mantener el crecimiento viral. Un fago aislado puede infectar, replicar y oxidar una célula. Con cada célula lysed, varias de las adyacentes se infectan inmediatamente. Varios ciclos en, una zona clara (una placa) se pueden observar en la placa de otro modo turbia (Figura 2B/Figura 3A),lo que indica la presencia de lo que inicialmente era una sola partícula de bacteriófago. Por lo tanto, el número de unidades formadoras de placas por volumen(es decir, PFU/ml) de una muestra puede determinarse a partir del número de placas generadas.

Figura 2: Las pruebas para las unidades formadoras de placas (PFU) son un método común para determinar el número de bacteriófagos en una muestra. (A) La base de una placa estéril de Petri está cubierta con un medio de nutrientes sólido adecuado, seguido de una mezcla de medios blandos, células huésped susceptibles y una dilución de la muestra original de bacteriófagos. Tenga en cuenta que la suspensión del fago podría, en algunos casos, también extenderse uniformemente a través de la superficie del agar blando ya solidificado. (B) El crecimiento de las bacterias anfitrionas forma un césped de células en la capa superior de agar. La replicación de bacteriófagos genera zonas claras, o placas, causadas por la lisis de la célula huésped.

Figura 3: Los resultados de las pruebas de PFU muestran múltiples placas generadas por bacteriófagos. Debido a la lisis de las células huésped susceptibles, las placas pueden ser vistas como zonas de despeje en el césped bacteriano, ya sea con (A) aclaramiento completo, o (B) re-crecimiento parcial causado por la generación de bacterias resistentes (o posiblemente por fagos templados en el lisogénico).

Ciertos fagos templados pueden adoptar lo que se conoce como un ciclo de vida lisogénico, además del crecimiento lítico descrito anteriormente. En la lisógena, el virus asume un estado latente mediante la incorporación de su material genético en el genoma de la célula huésped (9), a menudo confiriendo resistencia a más infecciones por fagos. Esto a veces se revela a través de una ligera opacidad de la placa (Figura 3B). Vale la pena señalar sin embargo, que las placas también pueden aparecer borrosas debido al re-crecimiento de bacterias que han evolucionado resistencia al fago independiente de las infecciones anteriores de fago.

Los virus pueden adjuntarse, o adsorgar, a sólo un rango limitado de bacterias anfitrionas (10). Los rangos de acogida están aún más limitados por estrategias antivirales intracelulares como el sistema CRISPR-Cas (11). La resistencia/sensibilidad hacia fagos específicos mostrados por subgrupos bacterianos se ha utilizado históricamente para clasificar las cepas bacterianas en diferentes tipos de fagos (Figura 4). Aunque la eficacia de este método ha sido ahora superada por nuevas técnicas de secuenciación, la tipificación de fagos todavía puede proporcionar información valiosa sobre las interacciones entre bacterias y fagos, por ejemplo, facilitando el diseño de un cóctel de fago para uso clínico .

Figura 4: Sensibilidad del fago de diferentes cepas bacterianas. Las placas de agar blandas con cepa Cutibacterium acnes (A) AD27 y (B) AD35, fueron manchadas con 21 bacteriófagos Diferentes de C. acnes. Sólo el fago 11 fue capaz de infectar y matar AD27 mientras que la cepa AD35 mostró sensibilidad hacia todos los fagos. Esta técnica, que se denomina tipificación de fagos, se puede utilizar para dividir especies bacterianas y cepas en diferentes subgrupos basados en la susceptibilidad del fago.

Procedure

1. Configuración

Antes de empezar cualquier trabajo que involucre microbios, asegúrese de que el espacio de trabajo esté esterilizado(por ejemplo, limpiado con 70% de etanol). Use siempre una capa de laboratorio y guantes, mantenga el cabello largo atado hacia atrás y asegúrese de que las heridas estén particularmente bien protegidas.
Cuando haya terminado, esterilizar todas las superficies y lavar/esterilizar a fondo las manos y las muñecas.

2. Protocolo

Preparación de LB Media
Nota: Dependiendo de la cepa bacteriana del huésped y del bacteriófago, un medio líquido diferente puede ser más adecuado para el cultivo inicial de la cepa bacteriana huésped o un medio sólido diferente puede ser más adecuado para el crecimiento posterior. El caldo de lysabagenia (LB) se utiliza en este protocolo para el caldo y el agar.
1. Mezclar 4 g LB en 200 ml de agua destilada, en triplicado, para el caldo LB, el agar inferior sólido y el agar superior suave. Todas las soluciones deben prepararse en recipientes capaces de contener el doble del volumen final para evitar el desbordamiento durante el autoclave.
  Nota: Si realiza el ensayo en triplicado, prepare el doble de agar inferior LB.
2. Ajuste el pH de las tres soluciones a 7.4 utilizando NaOH o HCl según corresponda.
3. Añadir 3 g de potencia de agar a la botella de agar inferior para hacer una solución de agar del 1,5% para el agar sólido
4. Añadir 1,2 g de potencia de agar a la botella de agar superior para hacer una solución de agar 0.6% para agar suave.
5. Colocar las botellas, con tapas semiapretadas, en un autoclave ajustado a 121oC durante 20 min para esterilizar las soluciones. Cierre las tapas tan pronto como finalice la carrera para evitar la contaminación.
6. Cuando el medio LB haya alcanzado una temperatura de aproximadamente 45-50 oC, agregue 450 ml de 1 M CaCl₂ estéril a las tres soluciones LB de 200 ml para realizar una concentración final de 2,25 mM.
7. Vierta las alícuotas de 15 ml del medio de agar sólido en platos estériles de Petri (evitar agitar para evitar la formación de espuma) y deje que el agar se solidifique durante unas horas o durante la noche a temperatura ambiente(Figura 4A). Las placas se pueden almacenar boca abajo a 4oC durante varios días.
Cultivo de células huésped
1. Un día antes del ensayo, añadir 10 ml de cultivo de E. coli a 10 ml de caldo LB.
2. Incubar las bacterias a 37oC durante la noche a 160 rpm en una incubadora de temblores.
3. La mañana del ensayo, añadir 0,5 ml del cultivo nocturno a 10 ml de LB fresco.
  Nota: Si usted está realizando el ensayo en triplicado, preparar el doble de la cantidad de esta cultura.
4. Incubar a 37oC a 160 rpm en una incubadora de agitación hasta que el cultivo bacteriano se encuentre en crecimiento en fase log. Esto se puede determinar espectrofotométricamente por un OD600 de 0.5-0.7.
5. Mantenga el cultivo a temperatura ambiente hasta que las bacterias se añadan al agar LB superior.
10 veces dilución serial de bacteriófagos
1. Añadir 180 l de caldo LB a siete pocillos en la primera fila de a a un plato de 96 pocillos
  Nota: Se sugiere realizar la dilución en triplicado con el fin de aumentar su fiabilidad estadística. Para ello, preparar diluciones adicionales del bacteriófago en la segunda y tercera filas de la placa.
2. Reórse cuidadosamente la muestra original del bacteriófago para asegurar la homogeneidad y transferir 20 ml al primer pozo.
3. Mezcle bien la muestra pipeteando y hacia abajo.
4. Transfiera 20 s de la suspensión resultante al segundo pozo.
5. Continúe la dilución en serie transfiriendo 20 l de la solución en el segundo pozo al tercer pozo, y así sucesivamente, hasta el sexto pozo, dejando el séptimo así como un control negativo al que no se añadirá ninguna suspensión de fago. Esto creará un rango de dilución de 10^-1-10^-6.
Galjanoplastia
1. Etiquetar la base de los platos de Petri (previamente preparados en el paso 2.1.7) con nombre, fecha y una breve descripción de la muestra (incluido el factor de dilución de la muestra de fago). Precalienta los platos de Petri en una incubadora de 37oC una hora antes del ensayo.
2. Derretir el agar-medio solidificado (típicamente hecho usando un microondas; el agar solidificado se derrite a 85 oC), y dejar que llegue a alrededor de 45 oC. El medio calentado se puede colocar en un baño de agua de 45oC durante 1 h para alcanzar una temperatura adecuada. Debe estar lo suficientemente caliente como para permanecer en forma líquida, pero lo suficientemente fresco como para no matar bacterias añadidas.
3. Mezclar el cultivo bacteriano de 4 ml (del paso 2.2) con el agar blando de 35 ml LB (a 45oC). Gire para distribuir uniformemente las células, pero evite agitar para evitar la formación de espuma(Figura 4A).
4. Etiquetar un tubo de ensayo estéril para cada uno de los pasos de dilución en serie y otro para la muestra de control, para un total de 7 tubos de ensayo etiquetados. Coloque 5 alícuotas ml del cultivo bacteriano/mezcla de agar suave del paso 2.4.3 en los 7 tubos. Trabaje rápidamente a través del paso 2.4.6 porque estos pequeños volúmenes de medios a base de agar se solidificarán rápidamente a temperatura ambiente.
5. Añadir 100 l de la muestra de control (del paso 2.3) al tubo de ensayo de control y girar con cuidado. Deseche la punta de pipeta usada y transfiera el mismo volumen de cada una de las muestras de bacteriófagos diluidos en serie (paso 2.3) a sus respectivos tubos de ensayo, girando para mezclar.
6. Transfiera inmediatamente las mezclas de 5 ml a las placas de agar sólidas etiquetadas, precalentadas(Figura 4A). Gire suavemente las placas para extender las mezclas.
  Nota: Si está realizando el ensayo por triplicado, repita los pasos 2.4.3-6 dos veces más.
7. Sellar cada placa con película de laboratorio, y permitir que ambas capas se solidifiquen correctamente a temperatura ambiente (aproximadamente 15 minutos) antes de colocarlas de lado abajo una incubadora de 37oC, estimulando el crecimiento tanto de las bacterias como del fago, durante 24 horas o hasta que las placas desarrollar, Por lo general toma alrededor de 1-5 días para que aparezcan las placas(Figura 4B),pero el momento varía considerablemente dependiendo de las condiciones de incubación, medio, y las especies bacterianas.

3. Análisis de datos y resultados

Contar placas
1. Asegúrese de que no haya placas visibles en las placas marcadas como “control”, ya que esto indicaría contaminación viral.
2. Comience con las placas etiquetadas 10^-6, que contengan la muestra de bacteriófago más diluida. Cuente las placas sin quitar la tapa, marcándolas con un bolígrafo a medida que vaya para indicar qué placas ya se han contado.
3. Cuente las placas restantes. Algunas placas pueden tener muy pocas o demasiadas placas para contar. Utilice las placas con 10-150 placas para su posterior análisis.
Cálculo de PFU
1. Divida el número de placas por el factor de dilución(porejemplo, 10^-6 para la muestra más diluida) para obtener el número de unidades formadoras de placas (PFU) en 100 ml de mezcla de fago.
  Nota: Si realiza el ensayo en triplicado, utilice el número medio de placas de las tres placas.
2. Para determinar la concentración (en PFU/ml) de la muestra original, multiplique por un factor de dilución adicional de 10, ya que sólo se celado 100 ml de la muestra. (es decir)
3. Calcular el valor medio de la PFU/ml para todas las diluciones que tenían entre 10 y 150 placas para lograr un resultado más confiable.

Los bacteriófagos, también llamados fagos, son virus que infectan específicamente a las bacterias y podemos confirmar su presencia y cuantificarlas utilizando una herramienta llamada ensayo de placa. Los bacteriófagos infectan a sus huéspedes susceptibles uniéndose primero a la pared celular bacteriana e inyectando su material genético. Luego, secuestran la maquinaria biosintética de la célula para replicar su ADN y producir numerosas partículas de fago de progenie, que luego liberan al lysing y matar a la célula huésped.

Esta actividad lítica es la base de una técnica de enumeración de fagos ampliamente utilizada conocida como el ensayo de placa o el ensayo de doble capa de agar. Aquí, una mezcla de bacteriófagos se prepara primero en un caldo de nutrientes fundidos que contiene agar de baja concentración. Todas las bacterias utilizadas en la mezcla deben estar vivas y dividiendo activamente en la fase de registro de su crecimiento, lo que asegurará que un gran porcentaje de las bacterias son viables y capaces de formar un césped denso alrededor de las placas. A continuación, esta mezcla de agar bacteriano-faa fundido se extiende sobre un medio de nutrientes de agar concentrado más sólido que ya está solidificado en un plato de Petri. En la incubación a temperatura ambiente, el caldo de bacterias de agar-fago de baja concentración también se solidifica para formar una superposición de agar suave.

Aquí, las células bacterianas pueden derivar nutrientes adicionales de la capa inferior y deben multiplicarse rápidamente para producir un césped confluente de bacterias. Sin embargo, como las partículas de fago también están presentes en la capa blanda, estas infectarán y replicarán su material genético dentro de las bacterias, culminando en lisis celular, que libera progenie múltiple. Esta progenie de fago entonces infecta las células vecinas, ya que el estado semisólido de la capa bacteria-fago restringe su movimiento a las células huésped más distantes. Este ciclo de infección y lisis continúa a lo largo de múltiples rondas, matando a un gran número de bacterias en un área localizada. El efecto de las células vecinas que se destruyen, es producir una sola zona circular clara, llamada placa, que puede ser vista a simple vista, amplificando efectivamente la actividad lítica bacteriana del fago y permitiendo su enumeración.

El número de placas en una placa Petri se conoce como Unidades formadoras de placas, o PfUs, y, siempre que la concentración inicial de bacteriófagos fuera suficientemente diluido, debe corresponder directamente al número de partículas de fago infecciosos en la muestra original. Esta técnica también se puede utilizar para la caracterización de la morfología de la placa, para ayudar en la identificación de tipos de fagos, o para aislar a los mutantes de fagos. En este laboratorio, aprenderá a realizar el ensayo de placa para enumerar fagos, utilizando el fago T7 de E. coli como ejemplo.

En primer lugar, identificar un medio adecuado para el cultivo de las células bacterianas huésped y el bacteriófago. Aquí el caldo de lisabagenia, o medio LB, se utilizaba para cultivar E. coli y el fago T7. A continuación, tome tres botellas de vidrio limpias y etiquételas con medios, nombre, y luego la primera como LB-Broth, la segunda como Agar LB-Bottom, y la tercera como Agar LB-Top. Ahora, pesa cuatro gramos de polvo LB pre-formulado en tres conjuntos y luego transfiere un conjunto de medios secos pesados en cada botella. Añadir 200 mililitros de agua a la primera botella. Mezclar el contenido con una barra de agitación magnética.

A continuación, utilizando un medidor de pH y agitación constante, lleve el pH final a 7,4 a través de la adición de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico. Repita también la adición de agua y el ajuste del pH para las otras dos botellas restantes. Ahora, pesa tres gramos de agar en polvo y agrécalo a la segunda botella para hacer un agar inferior del 1,5 %. Finalmente, pesa 1. 2 gramos de agar y agréguelo a la tercera botella para hacer el agar superior .6 % LB. La condición del caldo en la botella uno no necesita una adición de agar. Tapar la botella de forma semi-apretada y luego, esterilizar los medios mediante el autoclave a 121 grados Celsius durante 20 minutos. Una vez completadas, retire las botellas de medios del autoclave e gire inmediatamente las tapas de las botellas para cerrarlas por completo para evitar la contaminación. Mantenga el LB-Broth y los medios de agar LB-Top en el banco para su uso posterior. Coloque el agar LB-Bottom para enfriar en un baño de agua que esté preajustado a aproximadamente 45 grados centígrados.

Cuando el agar LB-Bottom alcance aproximadamente 45 grados centígrados, transfiéralo al banco de trabajo. A continuación, esterilice el espacio de trabajo con un 70 % de etenol. A continuación, añadir 450 microlitros de un cloruro de calcio molar estéril al agar inferior fundido para hacer una concentración final de 2,25 milimolares. Gire suavemente la botella para mezclarla. Luego, pon siete platos limpios de Petri. Etiquete cada plato de la parte inferior con el nombre del medio y la fecha de preparación. Luego, vierte 15 mililitros del agar inferior en cada uno de los siete platos de Petri. Deje que las placas se ajusten durante unas horas o durante la noche a temperatura ambiente. Una vez establecidas, las placas de cultivo se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante varios días si es necesario, al revés para minimizar la condensación. Transfiera los platos de Petri del refrigerador de cuatro grados Celsius a una incubadora de 37 grados Celsius una hora antes del ensayo.

El día antes de que el ensayo se preforme, el E. coli debe ser cultivado. Aquí, 10 microlitros de cultivo de E. coli se inocularon en 10 mililitros de LB-Broth. Colocar las bacterias para crecer durante la noche en una incubadora de temblores establecida a 37 grados Celsius a 160 RPM. Luego, el día del ensayo, retire el cultivo bacteriano de la incubadora. Semilla de 10 mililitros de caldo fresco LB con 0,5 mililitros del cultivo nocturno. Coloque estas células para crecer en una incubadora de temblores establecida en 37 grados Celsius a 160 RPM. A continuación, utilice un espectrofotómetro para comprobar cuándo este cultivo alcanza el crecimiento de la fase log, indicado por una densidad óptica de 0,5 a 0,7. Una vez que el OD alcanza este nivel, detenga la incubación transfiriendo el cultivo celular al banco. Ahora están listos para ser utilizados para el ensayo de superposición de fagos.

Los lanzadores de Phage pueden variar exponencialmente entre diferentes tipos de fagos y muestras. Así que con el fin de contarlos eficazmente, deben diluirse para generar una amplia gama de concentraciones de fago. El día del ensayo, generar una serie de diluciones de fago que van desde una décima a una millonésima sconcentraciones, siguiendo una técnica de dilución de 10 veces. Para obtener datos estadísticamente significativos y precisos, realice la dilución en serie en triplicado.

A continuación, derretir el agar machacante LB-top usando un microondas. A continuación, colóquelo en un baño de agua que esté preajustado a 45 grados centígrados durante una hora. Después de una hora, recoja los platos De Petri que contienen la capa inferior de agar de la incubadora. Etiquete las placas con la concentración de fagos y la fecha del ensayo. A continuación, ponga siete tubos de ensayo limpios. Etiquete cada tubo de ensayo con el número de dilución de fago en serie y designe uno como control.

Cuando el agar LB-top alcance los 45 grados Centígrados, transfiéralo al banco de trabajo. Ahora, agregue 450 microlitros de un cloruro de calcio molar al agar de 200 mililitros para hacer una concentración final de 2,25 milimolares. Gire suavemente la botella para mezclarla. A continuación, agregue 35 mililitros de agar LB-top y cuatro mililitros de suspensión bacteriana a un tubo cónico estéril. Gire suavemente para distribuir uniformemente las células, pero evite agitar para evitar la formación de espuma.

Ahora, alícuota cinco mililitros de esta mezcla de agar superior de bacterias a cada uno de los siete tubos de ensayo. A continuación, transfiera 100 microlitros de las muestras de bacteriófagos diluidos en serie y los medios de control, que deben ser simplemente medios sin bacteriófagos, a los tubos de ensayo etiquetados respetuosamente. Gire suavemente la mezcla para asegurar una mezcla adecuada. Transfiera suavemente cinco mililitros de mezcla de bacteriófagos a la placa Petri respectiva. Extienda uniformemente la mezcla por toda la superficie girando suavemente la placa Petri.

Una vez que todas las placas Petri están en capas con la mezcla, permitir la solidificación de la capa superior mediante la incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de completar estos pasos, repita el proceso para el segundo y luego el tercer conjunto de los platos Petri utilizando los dos conjuntos restantes de diluciones de fago. Selle cada plato con parafilm e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Coloque la placa de cultivo boca abajo a una temperatura adecuada durante 24 horas o hasta que se desarrollen las placas. Aquí, las placas se colocaron en una incubadora de 37 grados Celsius por un día, una condición de crecimiento estimulante para E. coli y el fago T7.

Las placas aparecerán después de uno a cinco días de incubación, dependiendo de las especies bacterianas, las condiciones de incubación y la elección del medio. Aquí, las placas eran visibles después de un día de incubación a 37 grados centígrados. Comience por comprobar las placas marcadas control y asegúrese de que no se formaron placas en estas placas, ya que esto indicaría contaminación viral. Para determinar el título de fago en la muestra original, comience con las placas que contienen la muestra de fago más diluida primero y cuente las placas sin quitar las tapas, marcándolas para indicar cuáles ya se han contado. Repita el conteo para cada plato en cada juego. Algunas placas pueden tener demasiadas o muy pocas placas para ser contadas. Considere de 10 a 150 como un recuento de placas ideal.

A continuación, genere una tabla que muestre los valores de número de placa para las diferentes diluciones y réplicas. A continuación, calcule los valores del número medio de placa para las placas de dilución que contenían el número ideal de recuentos de placas. En este ejemplo, estos fueron el número promedio de placas formadas en el 10 a los menos tres y 10 a las menos cuatro placas de dilución. Ahora, ajuste el factor de dilución del fago dividiendo los valores medios de placa obtenidos por los factores de dilución del fago respectivos. Aquí, el número promedio de placas formadas a la 10 a la menos tres y 10 a las menos cuatro placas de dilución, se dividieron por sus respectivos factores de dilución para obtener el número de unidades formadoras de placas, o PFUs, en 100 microlitros de mezcla de fago. Para convertir el valor a PFU por mililitro, multiplique los valores generados por 10, ya que sólo se utilizaron 100 microlitros de mezcla de dilución de fago durante el paso de preparación de la superposición de bacteriófagos, produciendo un factor de dilución adicional de 10. Por último, calcular el promedio de los valores obtenidos a partir de las diferentes placas de dilución. Esto dará el número promedio de PFUs por mililitro. El número de PPU corresponde al número de partículas de fago infecciosos en la muestra original.

Applications and Summary

A pesar de los múltiples avances tecnológicos, los ensayos de placas siguen siendo el estándar de oro para la determinación del titer viral (como PFU) y esenciales para el aislamiento de las poblaciones de bacteriófagos puros. Las células huésped susceptibles se cultivan en la capa superior de una placa de agar de dos capas, formando un lecho homogéneo que permite la replicación viral. El evento inicial donde un bacteriófago aislado en el ciclo de vida lítico infecta una célula, se replica dentro de ella, y finalmente la lyses, es demasiado pequeño para observar. Sin embargo, los viriones liberados infectarán las células adyacentes, dando lugar posteriormente a una zona de limpieza, o placa, que denota la presencia de una sola PFU.

References

Twort, F. An investigation on the nature of ultra-microscopic viruses. Lancet. 186 (4814): 1241-1243. (1915)
d'Hérelle, F. An invisible antagonist microbe of dysentery bacillus. Comptes Rendus Hebdomadaires Des Seances De L Academie Des Sciences. 165: 373-375. (1917)
Cisek AA, Dąbrowska I, Gregorczyk KP, Wyżewski Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2):277-283. (2017)
Mirzaei MK, Maurice CF. Ménage à trois in the human gut: interactions between host, bacteria and phages. Nature Reviews Microbiology. 15 (7):397. (2017)
Breitbart M, Bonnain C, Malki K, Sawaya NA. Phage puppet masters of the marine microbial realm. Nature Microbiology. 3 (7):754-766. (2018)
Leung CY, Weitz JS. Modeling the synergistic elimination of bacteria by phage and the innate immune system. Journal of Theoretical Biology. 429:241-252. (2017)
Dulbecco R. Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 38 (8):747-752. (1952)
Juarez D, Long KC, Aguilar P, Kochel TJ, Halsey ES. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J Virol Methods. 187 (1):185-9. (2013)
Clokie MRJ, Millard AD, Letarov AV, Heaphy S. 2011. Phages in nature. Bacteriophage. 1 (1):31-45. (2011)
Moldovan R, Chapman-McQuiston E, Wu XL. On kinetics of phage adsorption. Biophys J. 93 (1):303-15. (2007)
Garneau JE, Dupuis M-È, Villion M, Romero DA, Barrangou R, Boyaval P, Fremaux C, Horvath P, Magadán AH, Moineau S.. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320):67. (2010)

Transcript

Bacteriophages, also called phages, are viruses that specifically infect bacteria and we can confirm their presence and quantify them using a tool called the plaque assay. Bacteriophages infect their susceptible hosts by first attaching to the bacterial cell wall and injecting their genetic material. Then, they hijack the cell’s biosynthetic machinery to replicate their DNA and produce numerous progeny phage particles, which they then release by lysing and killing the host cell.

This lytic activity is the basis of a widely used phage enumerating technique known as the plaque assay or double agar layer assay. Here, a bacteriophage mix is first prepared in a molten nutrient broth containing low concentration agar. All bacteria used in the mix should be alive and actively dividing in the log phase of their growth, which will ensure that a large percentage of the bacteria are viable and able to form a dense lawn around the plaques. Next, this molten bacterial-phage agar mix is spread over a more solid, concentrated agar nutrient medium which is already solidified on a Petri dish. On incubation at room temperature, the low concentration agar-phage-bacteria broth also solidifies to form a soft agar overlay.

Here, the bacterial cells can derive additional nutrients from the bottom layer and should rapidly multiply to produce a confluent lawn of bacteria. However, as phage particles are also present in the soft layer, these will infect and replicate their genetic material within the bacteria, culminating in cell lysis, which releases multiple progeny. These phage progeny then infect the neighboring cells, as the semi-solid state of the bacteria-phage layer restricts their movement to more distantly located host cells. This cycle of infection and lysis continues over multiple rounds, killing a large number of bacteria in a localized area. The effect of the neighboring cells being destroyed, is to produce a single circular clear zone, called a plaque, which can be seen by the naked eye, effectively amplifying the bacteria lytic activity of the phage and enabling their enumeration.

The number of plaques on a Petri dish are referred to as Plaque-Forming Units, or PFUs, and, providing the initial bacteriophage concentration was sufficiently dilute, should directly correspond to the number of infective phage particles in the original sample. This technique can also be used for characterization of plaque morphology, to aid in identification of phage types, or to isolate phage mutants. In this lab, you will learn how to perform the plaque assay for enumerating phages, using the T7 phage of E. coli as an example.

First, identify a suitable medium for the culturing of the host bacterial cells and the bacteriophage. Here lysogeny broth, or LB medium, was used to culture E. coli and the T7 phage. Next, take three clean glass bottles and label them with media, name, and then the first as LB-Broth, the second as LB-Bottom Agar, and the third as LB-Top Agar. Now, weigh out four grams of pre-formulated LB powder in three sets and then transfer one set of weighed dried media into each bottle. Add 200 milliliters of water to the first bottle. Mix the contents using a magnetic stir bar.

Then, using a pH meter and constant stirring, bring the final pH to 7.4 through the addition of sodium hydroxide or hydrochloric acid. Repeat the water addition and pH adjustment for the other two remaining bottles, as well. Now, weigh out three grams of agar powder and add it to the second bottle to make a 1.5 % bottom agar. Finally, weigh 1. 2 grams of agar and add it to the third bottle to make the .6 % LB top agar. The broth condition in bottle one does not need an agar addition. Cap the bottle semi-tightly and then, sterilize the media by autoclaving at 121 degrees Celsius for 20 minutes. Once complete, remove the media bottles from the autoclave and immediately twist the bottle caps to close them fully to prevent contamination. Keep the LB-Broth and LB-Top Agar media on the bench for later use. Place the LB-Bottom Agar to cool in a water bath that is preset to approximately 45 degrees Celsius.

When the LB-Bottom agar reaches approximately 45 degrees Celsius, transfer it to the work bench. Next, sterilize the workspace using 70 % ethenol. Next, add 450 microliters of sterile one molar calcium chloride to the molten bottom agar to make a final concentration of 2.25 millimolar. Gently swirl the bottle to mix. Then, set out seven clean Petri dishes. Label each dish on the bottom with the media name and preparation date. Then, pour 15 milliliters of the bottom agar into each of the seven Petri dishes. Allow the plates to set for a few hours or overnight at room temperature. Once set, the culture plates can be stored at four degrees Celsius for several days if needed, upside down to minimize condensation. Transfer the Petri dishes from the four degrees Celsius refrigerator to a 37 degrees Celsius incubator one hour before the assay.

The day before the assay is to be preformed, the E. coli should be cultured. Here, 10 microliters of E. coli culture was inoculated into 10 milliliters of LB-Broth. Place the bacteria to grow overnight in a shaking incubator set to 37 degrees Celsius at 160 RPM. Then, on the day of the assay, remove the bacterial culture from the incubator. Seed a fresh 10 milliliters of fresh LB broth with 0.5 milliliters of the overnight culture. Place these cells to grow into a shaking incubator set to 37 degrees Celsius at 160 RPM. Next, use a spectrophotometer to check when this culture reaches log phase growth, indicated by an optical density of 0.5 to 0.7. Once the OD reaches this level, stop the incubation by transferring the cell culture to the bench. They are now ready to be used for phage overlay assay.

Phage titers can vary exponentially across different phage types and samples. So in order to count them effectively, they should be diluted to generate a wide range of phage concentrations. On the day of the assay, generate a series of phage dilutions ranging from one tenth to one millionth concentrations, following a 10-fold dilution technique. To obtain statistically significant and accurate data, perform the serial dilution in triplicate.

Next, melt the solidified LB-top agar using a microwave. Then, place it in a water bath that is preset at 45 degrees Celsius for one hour. After one hour, collect the Petri dishes containing the bottom agar layer from the incubator. Label the plates with phage concentration and assay date. Then, set out seven clean test tubes. Label each test tube with the serial phage dilution number and designate one as control.

When the LB-top agar reaches 45 degrees Celsius, transfer it to the working bench. Now, add 450 microliters of one molar calcium chloride to the 200 milliliter agar to make a final concentration of 2.25 millimolar. Gently swirl the bottle to mix. Next, add 35 milliliters of LB-top agar and four milliliters of bacterial suspension to a sterile conical tube. Gently swirl to evenly distribute the cells but avoid shaking to prevent foaming.

Now, aliquot five milliliters of this bacteria- top agar mix to each of the seven test tubes. Then, transfer 100 microliters of the serially diluted bacteriophage samples and control media, which should be simply media with no bacteriophage, to the respectfully labeled test tubes. Swirl the mixture gently to ensure proper mixing. Gently transfer five milliliters of bacteriophage mix onto the respective Petri plate. Evenly spread the mix throughout the whole surface by gently swirling the Petri plate.

Once all of the Petri plates are layered with the mix, allow solidification of the top layer by incubating at room temperature for 15 minutes. After completion of these steps, repeat the process for the second and then the third sets of the Petri dishes using the remaining two sets of phage dilutions. Seal each dish with parafilm and incubate at room temperature for 15 minutes. Place the culture plate upside down at a suitable temperature for 24 hours or until plaques develop. Here, plates were placed in a 37 degrees Celsius incubator for one day, a stimulating growth condition for E. coli and the T7 phage.

Plaques will appear after one to five days of incubation, depending on the bacterial species, incubation conditions, and the choice of medium. Here, plaques were visible after one day of incubation at 37 degrees Celsius. Begin by checking the plates marked control and ensure that no plaques were formed in these plates, as this would indicate viral contamination. To determine the phage titer in the original sample, start with the plates containing the most diluted phage sample first and count the plaques without removing the lids, marking them to indicate which ones have already been counted. Repeat the counting for each plate in every set. Some plates might have too many or too few plaques to be counted. Consider 10 to 150 as an ideal plaque count.

Next, generate a table listing the plaque number values for the different dilutions and replicates. Then, calculate the mean plaque number values for the dilution plates that contained the ideal number of plaque counts. In this example, these were the average number of plaques formed in the 10 to the minus three and 10 to the minus four dilution plates. Now, adjust for phage dilution factor by dividing the obtained mean plaque values by the respective phage dilution factors. Here, the average number of plaques formed to the 10 to the minus three and 10 to the minus four dilution plates, were divided by their respective dilution factors to obtain the number of plaque forming units, or PFUs, in 100 microliters of phage mixture. To convert the value to PFU per milliliter, multiply the generated values by 10, as only 100 microliters of phage dilution mix was used during the bacteriophage overlay preparation step, producing an additional dilution factor of 10. Finally, calculate the average of the values obtained from the different dilution plates. This will give the average number of PFUs per milliliter. The number of PFUs corresponds to the number of infective phage particles in the original sample.

Tags

Valor vacío Emisión