Transformación de células E. coli mediante un procedimiento con cloruro de calcio

Este protocolo describe la preparación y transformación de E. coli DH5 competente utilizando una adaptación del procedimiento de cloruro de calcio (12).

1. Configuración

1. Equipo
   • Espectrofotómetro
   • Centrífuga Sorval (o equivalente)
   • Centrífuga de sobremesa
   • Bloque de calor o baño de agua
   • Agitador orbital
   • Incubadora estacionaria
   • Bandeja de fundición de gel
   • Bueno peines
   • Fuente de tensión
   • Caja de gel
   • Fuente de luz UV
   • Microondas
2. Soluciones y reactivos
   • Caldo Luria-Bertani (LB) (10 g de hidrolizado enzimático de caseína, extracto de levadura de 5 g y 5 g de cloruro sódico en 1000 ml de H₂O)
   • Caldo super óptimo con represión catabolita (SOC): (2% (p.v) triptona, 0,5% (p/v) extracto de levadura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM MgCl_2,10 mM MgSO₄y 20 mM de glucosa)
   • CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂) solución.
   • M CaCl₂ solución (si las células se transformarán inmediatamente) o 0.1M CaCl₂ solución que contiene 10% (v/ v) glicerol (si las células se congelarán para uso futuro).
   • Placas de agar LB
   • Placas selectivas de agar LB (para este experimento, ya que el plásmido utilizado confiere resistencia a la ampicilina, se utilizaron placas de agar LB que contienen ampicilina 100 g/ml)
   • Cepa de E. coli DH5
   • ADN plásmido pUC19 (100 pg/l)
   • Kit de miniprep de giro QIAprep (Qiagen)
   • Hind III enzima de restricción
   • 1 kb más escalera de ADN
   • Bajo punto de fusión Agarose
   • 1X tacolcha TAE (base Tris de 40 mM, ácido acético de 20 mM y EDTA de 1 mM)
   • Bromuro de etidio (10mg/ml)
3. Notas generales de seguridad
   E. coli DH5 está clasificado como Nivel de Bioseguridad 1 (BSL1). Los microbios de esta categoría representan poca o ninguna amenaza de infección en adultos sanos. Sin embargo, se requiere una manipulación cuidadosa del microorganismo.

IMPORTANTE todos los pasos de este protocolo deben llevarse a cabo utilizando técnicas asépticas y sobre temperaturas de hielo o de 4oC a menos que se indique.

2. Protocolo

1. A partir de un stock congelado de E. coli DH5 (congelado en 20% glicerol de un cultivo nocturno cultivado en LB) raya las bacterias para el aislamiento en una placa de agar LB. Incubar a 37oC durante la noche (16-20 horas).
2. Inocular una sola colonia en 3 ml de caldo LB en un tubo. Crecer agitando a 210 rpm a 37oC durante la noche (16-20 horas).
3. Mida el OD600 de la cultura nocturna. Utilice el cultivo nocturno para inocular 100 ml de caldo LB en un matraz de 1 litro a un OD600-0.01. Incubar el cultivo agitando vigorosamente (210 rpm) a 37oC monitoreando OD600 en el espectrofotómetro cada 15-20 min, hasta que el cultivo alcance OD600-0,35 (aproximadamente 3 horas).
   NOTA: Para que la transformación sea eficiente, las células bacterianas deben estar en la fase de crecimiento exponencial medio. El número máximo de células debe ser de 10⁸ células/ml, que para la mayoría de las cepas de E. coli corresponde a OD600-0.4. El uso del espectrofotómetro permite medir el OD600, lo que permite determinar que las células se encuentran en la etapa de crecimiento adecuada. Si este protocolo se utilizará para otras cepas de bacterias, la calibración para determinar el número de colonias que forman unidades en valores OD600 específicos será necesaria para determinar esta correlación.
4. Transfiera los 50 ml del cultivo a cada una de las 2 botellas de centrífuga de polipropileno helada. Coloque las botellas sobre hielo durante 20 minutos para enfriarlas.
5. Recuperar las células por centrifugación a 2700g (4100 rpm en un rotor Sorval GSA) durante 10 min a 4oC.
6. Retire el sobrenadante. Escurra los últimos rastros de medios colocando la botella boca abajo sobre una almohadilla o una toalla de papel.
7. Resuspenda cada pellet bacteriano en 30 ml de una solución helada CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl_2). Primero agregue 5 ml de la solución, gire cuidadosamente hasta que el pellet se haya disuelto por completo y luego agregue los 25 ml restantes de solución.
8. Repita el paso 2.4.
9. Repita el paso 2.5.
10. Si las células competentes van a ser transformadas directamente, resuspende cada pellet bacteriano en 2 ml de una solución helada CaCl₂ (0.1 M) girando los tubos cuidadosamente. Si el pellet no se resuspende con este método, resuspende pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo (evitando la formación de burbujas).
    Alternativamente, las células competentes se pueden congelar y almacenar para su uso posterior. Para preparar las existencias congeladas de células competentes, resuspenda el pellet en 2 ml de una solución caCl₂ de 0,1M que contenga 10% (v/v) de glicerol. Esta solución debe estar helada. Suspensión de células alícuotas en tubos de polipropileno de 1,5 ml de hielo (160 ml por tubo). Congele las células competentes inmediatamente en un baño de hielo seco/etanol. Transfiera los tubos a un congelador de -70oC.
11. Para transformar las células tratadas con CaCl_2,transfiera 50 ml de células competentes a cada uno de los 2 tubos de polipropileno de 1,5 ml. Añadir los 1 l (100 pg) de ADN plásmido pUC19 a uno de los tubos y dejar el segundo tubo sin ADN (control negativo). Mezclar suavemente (evitar la formación de burbujas). Incubar durante 30 minutos sobre hielo.
    NOTA: No se deben utilizar más de 50 ng de ADN en un volumen de 10 ml o menos en la transformación.
12. Transfiera los tubos al bloque de calor e incubar a 42oC durante 45 s exactamente.
    NOTA: El choque por calor es un paso crítico. No exceda la temperatura ni el tiempo de incubación.
13. Transfiera fácilmente los tubos al hielo. Incubar durante 2 min.
14. Añadir 950 l de medios SOC e incubar los tubos durante 1 hora a 37 oC para permitir que las bacterias se recuperen y expresen el marcador resistente a los antibióticos codificado en el plásmido.
15. Diluir 10 ml de la suspensión celular en 1000 ml en SOC (1/100 de dilución) y 100 l de la suspensión celular en 1000 ml en SOC (1/10 de dilución). Placa 100 l de las diluciones, así como el control, en placas selectivas, y se extiende nifique utilizando una espátula. Por lo general, el chapado de 100 ml de una dilución de 1/100 y 1/10 producirá un número suficiente de unidades formadoras de colonias (cfu) por placa. Idealmente, este número debe oscilar entre 30-300 cfu para que haya suficientes colonias pero separadas entre sí. Sin embargo, el número de cfu dependerá de la eficiencia de la transformación (consulte la Sección análisis de datos y resultados).
16. Incubar las placas a 37oC. Las colonias transformadas deben aparecer en 12-16 horas (este rango dependerá de la cepa celular y el método de selección). Ninguna colonia debe crecer en el control negativo.
17. Contar el cfu/placa obtenido para la transformación (Tabla 1).
18. Para verificar que los transformadores albergan el plásmido pUC19, se realizará una preparación plásmido y posterior digestión. Para ello, inocular una sola colonia en 3 ml de caldo LB en un tubo. Crecer agitando a 210 rpm a 37oC durante la noche (16-20 horas).
19. Prepare una preparación de plásmido utilizando el kit miniprep QIAprep Spin, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
20. Digerir el 1 g de pUC19 purificado con la enzima de restricción HindIII a 37oC durante 1 hora.
    NOTA: Cualquier enzima que corte en el sitio de clonación múltiple pUC19 se puede utilizar para este paso.

21. Ejecuta una escalera de peso molecular, ADN pUC19 digerido y la misma cantidad de ADN pUC19 no digerido en un gel de agarosa del 1% que contiene bromuro de etidio de 1 g/ml durante 1 hora a 95 V.
    NOTA: el tiempo y el voltaje variarán dependiendo del equipo utilizado.
22. Visualice el gel bajo luz UV. Compare el tamaño del ADN pUC19 digerido y no digerido(Figura 2) (consulte la Sección Análisis de datos y resultados).
    Continúe con los pasos necesarios necesarios para verificar la transformación de acuerdo con el objetivo de cada experimento de transformación en particular.

Figura 2: Digestión del ADN plásmido recuperado de células transformadas DH5. El ADN del plásmido se recuperó de las células transformadas de DH5, digerido con HindIII, ejecutado en un gel de agarosa del 1% y visualizado con una fuente UV (pasos 2.19 a 2.22).

3. Análisis de datos y resultados

Para calcular la eficiencia de la transformación, es necesario contar un indicador de lo bien que las células tomaron el ADN extracelular, las colonias obtenidas en la transformación:

Tabla 1: Unidades formadoras de colonias (cfu) contadas a partir del experimento de transformación.

La eficiencia de transformación (TE) es una medida del número de cfu resultante de la transformación de 1 g de plásmido en un volumen determinado de células competentes. Muchos parámetros afectan a la eficiencia de la transformación: tamaño plásmido, genotipo celular, etapa de crecimiento durante la preparación de la competencia, métodos de transformación, etc.). Al calcular el TE es importante considerar qué dilución (si la hay) se realizó antes del enchapado e incorporarla en el cálculo del número total de cfu. La eficiencia de transformación (TE) se calcula con la siguiente ecuación:

En primer lugar, divida el cfu por el g de ADN, en este ejemplo 0.0001 g. A continuación, divida el resultado por el factor de dilución. En este ejemplo, se utilizó una dilución de 1/10 y se celenó 100 ml de una solución de 1 ml (dilución: 1/10 a 100 l /1000 l a 0,01).