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Advanced Biology

Transformación de células E. coli mediante un procedimiento con cloruro de calcio

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Microbiology

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Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

6.9: Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

6.11: Conjugation: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

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10:54 min

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April 30, 2023

Overview

Fuente: Natalia Martin¹, Andrew J. Van Alst¹, Rhiannon M. LeVeque¹, y Victor J. DiRita¹
¹ Departamento de Microbiología y Genética Molecular de la Universidad Estatal de Michigan

Las bacterias tienen la capacidad de intercambiar material genético (ácido desoxirribonucleico, ADN) en un proceso conocido como transferencia de genes horizontal. La incorporación de ADN exógeno proporciona un mecanismo mediante el cual las bacterias pueden adquirir nuevos rasgos genéticos que les permiten adaptarse a las condiciones ambientales cambiantes, como la presencia de antibióticos o anticuerpos (1) o moléculas que se encuentran en hábitats naturales (2). Existen tres mecanismos de transferencia génica horizontal: transformación, transducción y conjugación (3). Aquí nos centraremos en la transformación, la capacidad de las bacterias para tomar ADN libre del medio ambiente. En el laboratorio, el proceso de transformación consta de cuatro pasos generales: 1) Preparación de células competentes, 2) Incubación de células competentes con ADN, 3) Recuperación de células y 4) Placado de las células para el crecimiento de los transformadores (Figura 1).

Figura 1: Pasos generales del proceso de transformación. El proceso de transformación tiene cuatro pasos generales: 1) Preparación de células competentes, 2) Incubación con ADN, 3) Recuperación de las células y 4) Células de chapado para el crecimiento de los transformadores.

Para que se produzca la transformación, las bacterias receptoras deben estar en un estado conocido como competencia. Algunas bacterias tienen la capacidad de llegar a ser naturalmente competentes en respuesta a ciertas condiciones ambientales. Sin embargo, muchas otras bacterias no se vuelven competentes naturalmente, o las condiciones para este proceso son aún desconocidas. La capacidad de introducir ADN en bacterias tiene una gama de aplicaciones de investigación: generar múltiples copias de una molécula de ADN de interés, para expresar una gran cantidad de proteínas, como un componente en los procedimientos de clonación, y otros. Debido al valor de la transformación a la biología molecular, existen varios protocolos destinados a hacer que las células sean artificialmente competentes cuando se desconocen las condiciones de competencia natural. Se utilizan dos métodos principales para preparar células artificialmente competentes: 1) a través del tratamiento químico de las células y 2) la exposición de las células a pulsos eléctricos (electroporación). El primero utiliza diferentes productos químicos dependiendo del procedimiento para crear atracción entre el ADN y la superficie celular, mientras que el segundo utiliza campos eléctricos para generar poros en la membrana celular bacteriana a través de la cual pueden entrar las moléculas de ADN. El enfoque más eficiente para la competencia química es la incubación con cationes divalentes, sobre todo calcio (Ca²⁺) (4,5) Competencia inducida por calcio es el procedimiento que se describirá aquí (6). Este método se utiliza principalmente para la transformación de bacterias Gram-negativas, y ese será el foco de este protocolo.

El procedimiento de transformación química implica una serie de pasos en los que las células están expuestas a cationes para inducir la competencia química. Estos pasos son seguidos posteriormente por un cambio de temperatura – choque de calor – que favorece la absorción de ADN extraño por la célula competente (7). Los sobres de las células bacterianas se cargan negativamente. En bacterias Gram-negativas como Escherichia coli, la membrana externa se carga negativamente debido a la presencia de lipopolisacárido (LPS) (8). Esto resulta en la repulsión de las moléculas de ADN cargadas negativamente de manera similar. En la inducción de competencia química, los iones de calcio cargados positivamente neutralizan esta repulsión de carga permitiendo la absorción del ADN en la superficie celular (9). El tratamiento del calcio y la incubación con ADN se realizan sobre hielo. Posteriormente, se realiza una incubación a temperaturas más altas (42oC), el choque de calor. Este desequilibrio de temperatura favorece aún más la aceptación del ADN. Las células bacterianas deben estar en la fase de crecimiento exponencial medio para soportar el tratamiento de choque térmico; en otras etapas de crecimiento las células bacterianas son demasiado sensibles al calor, lo que resulta en una pérdida de viabilidad que disminuye significativamente la eficiencia de transformación.

Diferentes fuentes de ADN se pueden utilizar para la transformación. Típicamente, plásmidos, pequeñas moléculas circulares de ADN de doble cadena, se utilizan para la transformación en la mayoría de los procedimientos de laboratorio en E. coli. Para que los plásmidos se mantengan en la célula bacteriana después de la transformación, deben contener un origen de replicación. Esto permite que se repliquen en la célula bacteriana independientemente del cromosoma bacteriano. No todas las células bacterianas se transforman durante el procedimiento de transformación. Por lo tanto, la transformación produce una mezcla de células transformadas y células no transformadas. Para distinguir entre estas dos poblaciones, se utiliza un método de selección para identificar las celdas que han adquirido el plásmido. Los plásmidos suelen contener marcadores seleccionables, que son genes que codifican un rasgo que confiere una ventaja para el crecimiento (es decir, resistencia a un antibiótico o químico o rescate de una auxotrofia de crecimiento). Después de la transformación, las células bacterianas se chapan en medios selectivos, lo que sólo permite el crecimiento de las células transformadas. En el caso de las células transformadas con un plásmido que confiere resistencia a un antibiótico dado, los medios selectivos serán medios de crecimiento que contengan ese antibiótico. Se pueden utilizar varios métodos diferentes para confirmar que las colonias cultivadas en los medios selectivos son transformadores (es decir, han incorporado el plásmido). Por ejemplo, los plásmidos pueden recuperarse de estas células utilizando métodos de preparación de plásmidos (10) y digeridos para confirmar el tamaño del plásmido. Alternativamente, la PCR de colonia se puede utilizar para confirmar la presencia del plásmido de interés (11).

El objetivo de este experimento es preparar las células químicamente competentes de E. coli DH5, utilizando una adaptación del procedimiento de cloruro de calcio (12), y transformarlas con el plásmido pUC19 para determinar la eficiencia de transformación. La cepa de E. coli DH5 es una cepa comúnmente utilizada en aplicaciones de biología molecular. Debido a su genotipo, específicamente el recA1 y endA1, esta cepa permite una mayor estabilidad de la plaquita y mejorar la calidad del ADN plásmido en preparaciones posteriores. Dado que la eficiencia de transformación disminuye con el aumento del tamaño del ADN, el plásmido pUC19 se utilizó en este protocolo debido a su pequeño tamaño (2686 bp) (ver https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html para un vectores). pUC19 confiere resistencia a la ampicilina y, por lo tanto, este fue el antibiótico utilizado para la selección.

Procedure

Este protocolo describe la preparación y transformación de E. coli DH5 competente utilizando una adaptación del procedimiento de cloruro de calcio (12).

1. Configuración

Equipo
- Espectrofotómetro
- Centrífuga Sorval (o equivalente)
- Centrífuga de sobremesa
- Bloque de calor o baño de agua
- Agitador orbital
- Incubadora estacionaria
- Bandeja de fundición de gel
- Bueno peines
- Fuente de tensión
- Caja de gel
- Fuente de luz UV
- Microondas
Soluciones y reactivos
- Caldo Luria-Bertani (LB) (10 g de hidrolizado enzimático de caseína, extracto de levadura de 5 g y 5 g de cloruro sódico en 1000 ml de H₂O)
- Caldo super óptimo con represión catabolita (SOC): (2% (p.v) triptona, 0,5% (p/v) extracto de levadura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM MgCl_2,10 mM MgSO₄y 20 mM de glucosa)
- CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂) solución.
- M CaCl₂ solución (si las células se transformarán inmediatamente) o 0.1M CaCl₂ solución que contiene 10% (v/ v) glicerol (si las células se congelarán para uso futuro).
- Placas de agar LB
- Placas selectivas de agar LB (para este experimento, ya que el plásmido utilizado confiere resistencia a la ampicilina, se utilizaron placas de agar LB que contienen ampicilina 100 g/ml)
- Cepa de E. coli DH5
- ADN plásmido pUC19 (100 pg/l)
- Kit de miniprep de giro QIAprep (Qiagen)
- Hind III enzima de restricción
- 1 kb más escalera de ADN
- Bajo punto de fusión Agarose
- 1X tacolcha TAE (base Tris de 40 mM, ácido acético de 20 mM y EDTA de 1 mM)
- Bromuro de etidio (10mg/ml)
Notas generales de seguridad
E. coli DH5 está clasificado como Nivel de Bioseguridad 1 (BSL1). Los microbios de esta categoría representan poca o ninguna amenaza de infección en adultos sanos. Sin embargo, se requiere una manipulación cuidadosa del microorganismo.

IMPORTANTE todos los pasos de este protocolo deben llevarse a cabo utilizando técnicas asépticas y sobre temperaturas de hielo o de 4oC a menos que se indique.

2. Protocolo

A partir de un stock congelado de E. coli DH5 (congelado en 20% glicerol de un cultivo nocturno cultivado en LB) raya las bacterias para el aislamiento en una placa de agar LB. Incubar a 37oC durante la noche (16-20 horas).
Inocular una sola colonia en 3 ml de caldo LB en un tubo. Crecer agitando a 210 rpm a 37oC durante la noche (16-20 horas).
Mida el OD600 de la cultura nocturna. Utilice el cultivo nocturno para inocular 100 ml de caldo LB en un matraz de 1 litro a un OD600-0.01. Incubar el cultivo agitando vigorosamente (210 rpm) a 37oC monitoreando OD600 en el espectrofotómetro cada 15-20 min, hasta que el cultivo alcance OD600-0,35 (aproximadamente 3 horas).
NOTA: Para que la transformación sea eficiente, las células bacterianas deben estar en la fase de crecimiento exponencial medio. El número máximo de células debe ser de 10⁸ células/ml, que para la mayoría de las cepas de E. coli corresponde a OD600-0.4. El uso del espectrofotómetro permite medir el OD600, lo que permite determinar que las células se encuentran en la etapa de crecimiento adecuada. Si este protocolo se utilizará para otras cepas de bacterias, la calibración para determinar el número de colonias que forman unidades en valores OD600 específicos será necesaria para determinar esta correlación.
Transfiera los 50 ml del cultivo a cada una de las 2 botellas de centrífuga de polipropileno helada. Coloque las botellas sobre hielo durante 20 minutos para enfriarlas.
Recuperar las células por centrifugación a 2700g (4100 rpm en un rotor Sorval GSA) durante 10 min a 4oC.
Retire el sobrenadante. Escurra los últimos rastros de medios colocando la botella boca abajo sobre una almohadilla o una toalla de papel.
Resuspenda cada pellet bacteriano en 30 ml de una solución helada CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl_2). Primero agregue 5 ml de la solución, gire cuidadosamente hasta que el pellet se haya disuelto por completo y luego agregue los 25 ml restantes de solución.
Repita el paso 2.4.
Repita el paso 2.5.
Si las células competentes van a ser transformadas directamente, resuspende cada pellet bacteriano en 2 ml de una solución helada CaCl₂ (0.1 M) girando los tubos cuidadosamente. Si el pellet no se resuspende con este método, resuspende pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo (evitando la formación de burbujas).
Alternativamente, las células competentes se pueden congelar y almacenar para su uso posterior. Para preparar las existencias congeladas de células competentes, resuspenda el pellet en 2 ml de una solución caCl₂ de 0,1M que contenga 10% (v/v) de glicerol. Esta solución debe estar helada. Suspensión de células alícuotas en tubos de polipropileno de 1,5 ml de hielo (160 ml por tubo). Congele las células competentes inmediatamente en un baño de hielo seco/etanol. Transfiera los tubos a un congelador de -70oC.
Para transformar las células tratadas con CaCl_2,transfiera 50 ml de células competentes a cada uno de los 2 tubos de polipropileno de 1,5 ml. Añadir los 1 l (100 pg) de ADN plásmido pUC19 a uno de los tubos y dejar el segundo tubo sin ADN (control negativo). Mezclar suavemente (evitar la formación de burbujas). Incubar durante 30 minutos sobre hielo.
NOTA: No se deben utilizar más de 50 ng de ADN en un volumen de 10 ml o menos en la transformación.
Transfiera los tubos al bloque de calor e incubar a 42oC durante 45 s exactamente.
NOTA: El choque por calor es un paso crítico. No exceda la temperatura ni el tiempo de incubación.
Transfiera fácilmente los tubos al hielo. Incubar durante 2 min.
Añadir 950 l de medios SOC e incubar los tubos durante 1 hora a 37 oC para permitir que las bacterias se recuperen y expresen el marcador resistente a los antibióticos codificado en el plásmido.
Diluir 10 ml de la suspensión celular en 1000 ml en SOC (1/100 de dilución) y 100 l de la suspensión celular en 1000 ml en SOC (1/10 de dilución). Placa 100 l de las diluciones, así como el control, en placas selectivas, y se extiende nifique utilizando una espátula. Por lo general, el chapado de 100 ml de una dilución de 1/100 y 1/10 producirá un número suficiente de unidades formadoras de colonias (cfu) por placa. Idealmente, este número debe oscilar entre 30-300 cfu para que haya suficientes colonias pero separadas entre sí. Sin embargo, el número de cfu dependerá de la eficiencia de la transformación (consulte la Sección análisis de datos y resultados).
Incubar las placas a 37oC. Las colonias transformadas deben aparecer en 12-16 horas (este rango dependerá de la cepa celular y el método de selección). Ninguna colonia debe crecer en el control negativo.
Contar el cfu/placa obtenido para la transformación (Tabla 1).
Para verificar que los transformadores albergan el plásmido pUC19, se realizará una preparación plásmido y posterior digestión. Para ello, inocular una sola colonia en 3 ml de caldo LB en un tubo. Crecer agitando a 210 rpm a 37oC durante la noche (16-20 horas).
Prepare una preparación de plásmido utilizando el kit miniprep QIAprep Spin, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Digerir el 1 g de pUC19 purificado con la enzima de restricción HindIII a 37oC durante 1 hora.
NOTA: Cualquier enzima que corte en el sitio de clonación múltiple pUC19 se puede utilizar para este paso.

Componente	Cantidad
10X Búfer de resumen de restricción	2,5 l
Plásmido pUC19	1 g
Hind Ⅲ	1 l
H₂O	20,5 l (a 25 l)

Ejecuta una escalera de peso molecular, ADN pUC19 digerido y la misma cantidad de ADN pUC19 no digerido en un gel de agarosa del 1% que contiene bromuro de etidio de 1 g/ml durante 1 hora a 95 V.
NOTA: el tiempo y el voltaje variarán dependiendo del equipo utilizado.
Visualice el gel bajo luz UV. Compare el tamaño del ADN pUC19 digerido y no digerido(Figura 2) (consulte la Sección Análisis de datos y resultados).
Continúe con los pasos necesarios necesarios para verificar la transformación de acuerdo con el objetivo de cada experimento de transformación en particular.

Figura 2: Digestión del ADN plásmido recuperado de células transformadas DH5. El ADN del plásmido se recuperó de las células transformadas de DH5, digerido con HindIII, ejecutado en un gel de agarosa del 1% y visualizado con una fuente UV (pasos 2.19 a 2.22).

3. Análisis de datos y resultados

Para calcular la eficiencia de la transformación, es necesario contar un indicador de lo bien que las células tomaron el ADN extracelular, las colonias obtenidas en la transformación:

Dilución	Ufc
1/100	34
1/10	246

Tabla 1: Unidades formadoras de colonias (cfu) contadas a partir del experimento de transformación.

La eficiencia de transformación (TE) es una medida del número de cfu resultante de la transformación de 1 g de plásmido en un volumen determinado de células competentes. Muchos parámetros afectan a la eficiencia de la transformación: tamaño plásmido, genotipo celular, etapa de crecimiento durante la preparación de la competencia, métodos de transformación, etc.). Al calcular el TE es importante considerar qué dilución (si la hay) se realizó antes del enchapado e incorporarla en el cálculo del número total de cfu. La eficiencia de transformación (TE) se calcula con la siguiente ecuación:

En primer lugar, divida el cfu por el g de ADN, en este ejemplo 0.0001 g. A continuación, divida el resultado por el factor de dilución. En este ejemplo, se utilizó una dilución de 1/10 y se celenó 100 ml de una solución de 1 ml (dilución: 1/10 a 100 l /1000 l a 0,01).

Las bacterias son notablemente adaptables y un mecanismo que facilita esta adaptación es su capacidad para tomar moléculas externas de ADN. Un tipo de ADN que las bacterias pueden tomar se llama plásmido, una pieza circular de ADN que con frecuencia contiene información útil, como genes de resistencia a antibióticos. El proceso de modificación de bacterias por nueva información genética incorporada de una fuente externa se conoce como transformación. La transformación se puede realizar fácilmente en el laboratorio utilizando Escherichia coli, o E. coli.

Para ser transformados, las células de E. coli deben ser obligadas primero, lo que significa ser capaces de tomar moléculas de ADN de su entorno. El protocolo para lograr esto es sorprendentemente simple, una incubación corta de las células en una solución de cloruro de calcio. Esta incubación hace que las células se vuelvan permeables a las moléculas de ADN. Después de que las células son peletadas por centrifugación, se extrae el sobrenadante. El ADN plásmido ahora se añade a las células competentes. Después de incubar las células con ADN, la mezcla se calienta brevemente a 42 grados Celsius, seguido de un enfriamiento rápido en el hielo. Este choque térmico hace que el ADN se transfiera a través de la pared y las membranas de la célula. Las células se incuban en medios frescos. Luego, las bacterias se colocan a 37 grados para permitirles volver a sellar sus membranas y expresar proteínas resistentes.

Esas células que han tomado en los plásmidos copiarán fielmente el ADN y lo transmitirán a su progenie y expresarán cualquier proteína que pueda ser codificada por él, incluidos los mediadores de resistencia a los antibióticos. Esos genes de resistencia se pueden utilizar como marcadores seleccionables para identificar bacterias que se han transformado con éxito porque las células que no han tomado el plásmido no expresarán el producto del gen de resistencia. Esto significa que cuando las células están chapadas en un medio sólido que contiene el antibiótico apropiado, sólo las células que han tomado el plásmido crecerán. La transformación de las células en una colonia en crecimiento se puede confirmar aún más mediante el cultivo de esas células en medios líquidos durante la noche para aumentar el rendimiento antes de extraer el ADN de la muestra. Una vez que el ADN está aislado, se puede llevar a cabo una enzima de restricción diagnóstica. Debido a que las enzimas de restricción cortan el ADN en lugares predecibles, ejecutar estos digeridos en un gel debe mostrar un patrón predecible si el plásmido deseado se transformó con éxito. Por ejemplo, si pUC19 está preparado y cortado con la enzima de restricción HindIII, se debe ver una sola banda de 2686 nucleótidos en el gel.

En este laboratorio, transformará la cepa de E. coli DH-5 Alpha con pUC19, y luego confirmará la transformación exitosa por electroforesis de gel de ADN.

Antes de iniciar el procedimiento, ponte el equipo de protección personal adecuado, incluyendo una capa de laboratorio y guantes. A continuación, esterilizar el espacio de trabajo con 70% de etanol.

Ahora, prepare células químicamente competentes depositando un bucle lleno de bacterias en una placa de agar LB estéril y rayando las bacterias con un nuevo lazo. Luego, incubar la placa a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, esterilizar la parte superior del banco con 70% de etanol de nuevo, y retirar la placa de la incubadora.

Inocular una sola colonia bien aislada en 3 mililitros de caldo LB en un tubo con un lazo estéril. Luego, hacer crecer el cultivo a 37 grados centígrados durante la noche, con temblores a 210 RPM. Al día siguiente, medir la densidad óptica del cultivo nocturno con un espectrofotómetro. Luego, agregue 100 mililitros de caldo LB a un matraz de un litro, e inocularlo con el cultivo nocturno a una densidad óptica de 0. 01. Ahora, incubar la cultura a 37 grados centígrados con temblores, y comprobar el OD600 cada 15 a 20 minutos hasta que el cultivo alcance la fase de crecimiento medio exponencial.

Después de aproximadamente tres horas, transfiera 50 mililitros del cultivo a dos botellas de polipropileno heladas. Luego, vuelva a colocar las botellas en hielo durante 20 minutos para enfriarlas. A continuación, recupere las células a través de la centrifugación. Deseche los supernatantes y coloque las botellas boca abajo sobre una toalla de papel. A continuación, resuspenda el pellet bacteriano en cinco mililitros de solución de cloruro de magnesio de cloruro de calcio en frío y gire cuidadosamente hasta que el pellet se haya disuelto por completo. A continuación, agregue otros 25 mililitros de la solución al pellet bacteriano disuelto. Resuspenda el otro pellet bacteriano como se ha demostrado anteriormente. Después de esto, repita la centrifugación y retire los sobrenatantes.

Si las células competentes van a ser transformadas directamente, resuspenda cada pellet bacteriano en dos mililitros de una solución de cloruro de calcio de 0,1 molar es 0,1 hielo girando los tubos cuidadosamente. Para comenzar el procedimiento de transformación, transfiera 50 microlitros de células competentes a dos tubos de polipropileno de 1,5 mililitros etiquetados. Luego, agregue un microlitro de ADN plásmido pUC19 a uno de los tubos. Mezclar suavemente, evitando la formación de burbujas, e incubar ambos tubos durante 30 minutos sobre hielo. Después de la incubación, transfiera los tubos a un bloque de calor e incubar a 42 grados centígrados durante 45 segundos. Transfiera inmediatamente los tubos al hielo e incubar durante dos minutos. Ahora, agregue 950 microlitros de medios SOC a cada tubo e incubarlos durante una hora a 37 grados Celsius para permitir que las bacterias se recuperen, y exprese el marcador resistente a los antibióticos codificado en el plásmido.

Para hacer una dilución de 1 a 100, agregue 990 microlitros de medios SOC y 10 microlitros de suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros. Luego, hacer una dilución de 1 a 10 mediante la adición de 900 microlitros de medios SOC y 100 microlitros de suspensión celular a un tubo de 1.5 mililitros. A continuación, placa 100 microlitros de las suspensiones celulares diluidas y 100 microlitros del control negativo, en placas selectivas separadas que contienen ampicilina utilizando un esparcidor e incubar las placas a 37 grados centígrados durante 12 a 16 horas. Después de la incubación, cuente las unidades formadoras de colonias, o UFC, por placa, obtenidas a través de la transformación, y registre estos datos. Para verificar que los transformadores tienen el plásmido pUC19, elija una sola colonia bien aislada de una placa con un lazo estéril, e introdúzcalo en un tubo que contenga 3 mililitros de caldo LB. Luego, incubar la cultura a 37 grados centígrados con temblores, de la noche a la mañana. Al día siguiente, utilice un mini kit de preparación de ADN para aislar el ADN de 3 mililitros del cultivo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de completar la mini preparación del ADN, digiere el 1 microgramo de pUC19 purificado con una enzima de restricción a 37 grados Celsius durante 1 hora. Ahora, cargue 20 microlitros de una escalera de peso molecular, 1 microgramo de ADN de plásmido digerido y 1 microgramo de ADN plásmido no digerido en pozos consecutivos de un gel de agarosa del 1% que contiene 1 bromuro de etidio de microgramo por mililitro. A continuación, ejecute el gel durante 1 hora a 95 voltios. Por último, visualice el gel con un iluminador UV.

En este experimento, E. coli DH5 Alpha se prepararon células químicamente competentes utilizando una adaptación del procedimiento de cloruro de calcio, y luego se transformaron con el plásmido pUC19 para determinar la eficiencia de transformación. Para calcular la eficiencia de transformación, utilice los recuentos de UFC registrados para las diluciones 1 de cada 100 y 1 en 10, y cualquier otra dilución con CFU cuenta entre 30 y 300. En primer lugar, el recuento de UFC registrado, 246 en este ejemplo, se divide por la cantidad de ADN, .0001 microgramos aquí, que fue chapado. A continuación, este número se divide por el factor de dilución utilizado para dar la eficiencia de transformación en UFC por microgramo. En este ejemplo, se utilizó una dilución de 1 a 10 y se chaparon 100 microlitros de una solución de 1 mililitro, lo que le da un factor de dilución final de 0,01. En el carril plásmido no digerido, el ADN circular puede aparecer como dos o tres bandas diferentes de brillo variable. Esto se debe a que el ADN circular sin cortar puede existir en varios estados de conformación diferentes, como supercoiled, círculo abierto, o más lineal, y cada uno de estos se mueve nalto a través del gel a diferentes velocidades. El análisis de la digestión del ADN plásmido recuperado indicó que el plásmido utilizado tiene un tamaño esperado de ADN pUC19, 2.686 pares de bases.

Results

Aunque TE depende de muchos factores, las preparaciones celulares competentes no comerciales, como esta, normalmente producen de 10⁶ a 10⁷ transformadores por microgramo de plásmido. Por lo tanto, esta preparación, con un TE de 2,46 x 10⁸ cfu/g, produjo un TE mucho más allá del rango esperado. Existen protocolos adicionales para fabricar celdas supercompetentes cuando se requieren mayores eficiencias de transformación para una aplicación determinada (13).

El análisis de la digestión del ADN plásmido recuperado de las células transformadas indicó que este plásmido tiene el tamaño esperado del ADN pUC19 (2686 bp).

Applications and Summary

La transformación es un método potente para introducir ADN exógeno en células bacterianas que es clave para muchas aplicaciones de biología molecular en el laboratorio. Además, desempeña un papel importante en la naturaleza al permitir que las células bacterianas intercambien material genético que podría resultar en una mayor variación genética y permitir la adquisición de diferentes rasgos beneficiosos para la supervivencia bajo una amplia gama de condiciones. Muchas cepas bacterianas codifican los genes necesarios para la competencia natural. Sin embargo, todavía se desconocen las condiciones en las que se inducen estos genes. Se requiere más investigación para determinar estas condiciones.

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Transcript

Bacteria are remarkably adaptable and one mechanism which facilitates this adaptation is their ability to take in external DNA molecules. One type of DNA that bacteria can uptake is called a plasmid, a circular piece of DNA that frequently contains useful information, such as antibiotic resistance genes. The process of bacteria being modified by new genetic information incorporated from an external source is referred to as transformation. Transformation can easily be performed in the laboratory using Escherichia coli, or E. coli.

In order to be transformed, E. coli cells must first be made competent, which means capable of taking in DNA molecules from their environment. The protocol for accomplishing this is surprisingly simple, a short incubation of the cells in a calcium chloride solution. This incubation causes the cells to become permeable to DNA molecules. After the cells are pelleted by centrifugation, the supernatant is removed. The plasmid DNA is now added to the competent cells. After incubating the cells with DNA, the mix is briefly heated to 42 degrees Celsius, followed by rapid cooling on ice. This heat shock causes the DNA to be transferred across the cell’s wall and membranes. The cells are then incubated in fresh media. Then, the bacteria are placed at 37 degrees to allow them to reseal their membranes and express resistant proteins.

Those cells which have taken in the plasmids will faithfully copy the DNA and pass it to their progeny and express any proteins that might be encoded by it, including antibiotic resistance mediators. Those resistance genes can be used as selectable markers to identify bacteria which have been successfully transformed because cells that have not taken up the plasmid will not express the resistance gene product. This means that when the cells are plated on a solid medium which contains the appropriate antibiotic, only cells that have taken up the plasmid will grow. Transformation of the cells in a growing colony can be further confirmed by culturing those cells in liquid media overnight to increase the yield before extracting the DNA from the sample. Once the DNA is isolated, a diagnostic restriction enzyme digest can be carried out. Because restriction enzymes cut DNA in predictable locations, running these digests on a gel should show a predictable pattern if the desired plasmid was successfully transformed. For example, if pUC19 is prepared and cut with the restriction enzyme HindIII, a single band of 2686 nucleotides should be seen on the gel.

In this lab, you will transform E. coli strain DH-5 Alpha with pUC19, and then confirm the successful transformation by DNA gel electrophoresis.

Before starting the procedure, put on the appropriate personal protective equipment, including a lab coat and gloves. Next, sterilize the workspace with 70% ethanol.

Now, prepare chemically competent cells by depositing a loopfull of bacteria onto a sterile LB agar plate and streaking the bacteria with a new loop. Then, incubate the plate at 37 degrees Celsius overnight. The next day, sterilize the bench top with 70% ethanol again, and remove the plate from the incubator.

Inoculate a single, well-isolated colony into 3 milliliters of LB broth in a tube with a sterile loop. Then, grow the culture at 37 degrees Celsius overnight, with shaking at 210 RPM. The next day, measure the optical density of the overnight culture with a spectrophotometer. Then, add 100 milliliters of LB broth to a one-liter flask, and inoculate it with the overnight culture at an optical density of 0. 01. Now, incubate the culture at 37 degrees Celsius with shaking, and check the OD600 every 15 to 20 minutes until the culture reaches mid-exponential growth phase.

After approximately three hours, transfer 50 milliliters of the culture to two ice-cold polypropylene bottles. Then, place the bottles back on ice for 20 minutes to cool. Next, recover the cells via centrifugation. Discard the supernatants and place the bottles upside down on a paper towel. Next, resuspend the bacterial pellet in five milliliters of ice-cold calcium chloride magnesium chloride solution and swirl carefully until the pellet has dissolved completely. Then, add another 25 milliliters of the solution to the dissolved bacterial pellet. Resuspend the other bacterial pellet as previously demonstrated. After this, repeat the centrifugation, and remove the supernatants.

If the competent cells are going to be directly transformed, resuspend each bacterial pellet in two milliliters of an ice-cold 0.1 molar calcium chloride solution by swirling the tubes carefully. To begin the transformation procedure, transfer 50 microliters of competent cells to two labeled 1.5 milliliter polypropylene tubes. Then, add one microliter of pUC19 plasmid DNA to one of the tubes. Mix gently, avoiding bubble formation, and incubate both tubes for 30 minutes on ice. After incubation, transfer the tubes to a heat block and incubate at 42 degrees Celsius for 45 seconds. Immediately transfer the tubes to ice, and incubate for two minutes. Now, add 950 microliters of SOC media to each tube and incubate them for one hour at 37 degrees Celsius to allow the bacteria to recover, and express the antibiotic resistant marker encoded in the plasmid.

To make a 1 to 100 dilution, add 990 microliters of SOC media and 10 microliters of cell suspension to a 1.5 milliliter tube. Then, make a 1 to 10 dilution by adding 900 microliters of SOC media and 100 microliters of cell suspension to a 1.5 milliliter tube. Next, plate 100 microliters of the diluted cell suspensions and 100 microliters of the negative control, onto separate selective plates containing ampicillin using a spreader and incubate the plates at 37 degrees Celsius for 12 to 16 hours. After incubation, count the colony-forming units, or CFUs, per plate, obtained through transformation, and record these data. To verify that the transformants have the pUC19 plasmid, pick a single, well-isolated colony from a plate with a sterile loop, and introduce it to a tube containing 3 milliliters of LB broth. Then, incubate the culture at 37 degrees Celsius with shaking, overnight. The next day, use a DNA mini prep kit to isolate DNA from 3 milliliters of the culture, according to the manufacturer’s instructions. After completing the DNA mini prep, digest the 1 microgram of purified pUC19 with a restriction enzyme at 37 degrees Celsius for 1 hour. Now, load 20 microliters of a molecular weight ladder, 1 microgram of digested plasmid DNA, and 1 microgram of undigested plasmid DNA into consecutive wells of a 1% agarose gel containing 1 microgram per milliliter ethidium bromide. Then, run the gel for 1 hour at 95 volts. Finally, visualize the gel with a UV illuminator.

In this experiment, E. coli DH5 Alpha chemically competent cells were prepared using an adaptation of the calcium chloride procedure, and then transformed with the plasmid pUC19 to determine transformation efficiency. To calculate the transformation efficiency, use the recorded CFU counts for the 1 in 100 and 1 in 10 dilutions, and any other dilutions with CFU counts between 30 and 300. First, the recorded CFU count, 246 in this example, is divided by the amount of DNA, .0001 micrograms here, that was plated. Then, this number is divided by the dilution factor used to give the transformation efficiency in CFUs per microgram. In this example, a 1 to 10 dilution was used and 100 microliters of a 1 milliliter solution was plated, giving a final dilution factor of 0.01. In the undigested plasmid lane, the circular DNA may appear as two or three different bands of varying brightness. This is because the circular, uncut DNA may exist in several different conformation states, such as supercoiled, open circle, or more linear, and each of these move through the gel at different rates. Analysis of the recovered plasmid DNA digestion indicated that the plasmid used has an expected size of pUC19 DNA, 2,686 base pairs.

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