6.11: Conjugación: Un método para transferir resistencia a ampicilina de un donante a una E. Coli receptora

1. Configuración

1. Autoclave aproximadamente 1L de medio Luria-Bertani (LB). Este LB estéril se utilizará para hacer aproximadamente 5 ml de LB que contengan 0,3 mM de ácido diaminopimelico (DAP).
2. Recoger las siguientes placas: placas de agar LB con 1X Tet y 0.3 mM DAP, placas de agar LB con 1X Tet solamente, y placas de agar LB con 1X Amp/Tet solamente.
3. Asegúrese de que un poco de glicerol y una caja de puntas de pipeta de plástico preesterilizadas estén cerca.
4. Antes de comenzar cualquier trabajo que involucre microbios, esterilice el espacio de trabajo con 70% de etanol. Use siempre el equipo de protección personal necesario, incluyendo una capa de laboratorio y guantes.
5. Una vez terminado, esterilizar todas las superficies y guantes con 70% de etanol y lavarse las manos.

2. Preparación de la tensión del donante y del receptor

1. Preparar cultivos bacterianos de 5 ml del donante y las cepas receptoras y cultivarlas durante la noche a 37 oC con aireación y agitación a 220 rpm. La cepa del donante debe cultivarse en LB con 0,3 mM DAP.
2. Gire hacia abajo 1 ml de ambos cultivos (3000 rpm durante 5 minutos) y lave las células con PBS.
3. Resuspenda las células en 500 sl de solución salina tamponada de fosfato (PBS).

3. Conjugación

1. Combinar 50 l de células receptoras con 50 l de células de donante en un tubo de microcentrífuga y mezclar mediante pipeteo.
2. Incubar la mezcla celular durante 1 hora a 37oC. Esto mejorará la eficiencia de la conjugación antes y durante el siguiente paso de chapado.
3. Pipet 100 l de la mezcla de células en una placa de agar con 1X Tet y 0,3 mM DAP. No se extienda sobre la placa.
4. Pipet 100 l de cultivo de celda receptora en una placa de agar con 1X Tet y 0,3 mM DAP. No se extienda sobre la placa.
5. Incubar ambas placas durante la noche a 37oC.
6. Raspar la mezcla de células de conjugación y el cultivo de la célula receptora con un rascador de células estériles. Transfiera las células al tubo de microcentrífuga estéril y resuspenda las células en 1 ml de PBS.
7. Vortex las células y girar suavemente hacia abajo (3000 rpm durante 5 minutos).
8. Resuspenda las celdas en 1 ml de PBS.
9. Placar la mezcla de células de reacción de conjugación en una placa de agar LB con 1X Amp/Tet solamente. En esta placa, sólo se espera que crezcan las bacterias receptoras que obtuvieron con éxito el gen de resistencia del amplificador a través de la conjugación.
10. Placa relparte las células receptoras a una placa de agar LB con 1X Tet solamente. En esta placa, sólo se espera que crezcan las bacterias receptoras no conjugadas, que no tienen el gen de resistencia amperio.
11. Incubar las placas durante la noche a 37oC.
12. Recoger colonias individuales de ambas placas y utilizarlas para cultivar cultivos nocturnos en 5 ml de medios (37 oC con aireación a 220 rpm).

4. Aislamiento de ADN

1. Aísle el ADN de los cultivos previamente preparados utilizando 4,5 ml del volumen de cultivo total por minipreparación de ADN.
2. Para ello, eluir el ADN usando 35 l de agua libre de nucleasas.
3. El ADN puro generará una relación de absorbancia (A_260/280)de aproximadamente 1,8.
4. Utilice los 0,5 ml restantes de cada cultivo para preparar las existencias de glicerol haciendo una mezcla de 1:1 de cultivo bacteriano y 100% glicerol.
5. Almacene las existencias del congelador a -80 oC.

5. Confirmación de la Conjugación de Transferencia de Plásmido por PCR

1. Preparar dos mezclas maestras de PCR, cada una con un conjunto diferente de imprimaciones hacia adelante y hacia atrás, una dirigida a un segmento de par base 500 dentro del gen de resistencia a la ampicilina y la otra dirigida a un segmento dentro de un gen de limpieza.
   1. Las imprimaciones genéticas de limpieza se diseñaron para amplificar un segmento de ADN dentro de la codificación del gen bacteriano para la gengensa b (14) del ADN.
   2. Se utilizaron los siguientes volúmenes de reactivos para preparar 90 ml de cada mezcla maestra:
      7,5 ml de imprimación delantera de 10 m
      7,5 ml de imprimación inversa de 10 m
      75 l de mezcla maestra de PCR 2X
2. Preparar las siguientes seis reacciones de PCR utilizando una mezcla maestra de 15 l, 10 ng de ADN de plantilla y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 25 l.
   Reacción de conjugación INTRODUCciones de ADN y ampicilina
   Reacción de conjugación ADN y imprimaciones de limpieza
   Primers de ADN y ampicilina de control negativo
   El ADN de control negativo y las imprimaciones de limpieza
   Sin introducciones de ADN y ampicilina
   Sin ADN ni imprimaciones de limpieza
3. Transfiera estas reacciones a una máquina PCR con el bloque precalentado a 98 C y comience el termocycling en las siguientes condiciones:
   98 oC durante 30 segundos
   25-35 ciclos de 98oC durante 5-10 segundos, 45-72oC durante 10 a 30 segundos y 72oC durante 15-30 segundos por kb
   72 oC durante 5-10 minutos
   Sostener a 4 oC
4. Cargue las seis reacciones de PCR en un gel de agarosa del 1% y corra a 150 V durante unos 20 minutos.
5. Visualice el producto de PC utilizando un iluminador UV.

Las células bacterianas, como la E. coli, son capaces de transferir información genética de célula a célula. La conjugación difiere de otros mecanismos de transferencia de ADN, como la transducción o la transformación, en que requiere contacto físico entre las células.

Para continuar, la conjugación requiere una célula donante que exprese el factor de fertilidad, o F, y una célula receptora sin él, una célula F menos. El proceso requiere dos pasos. El primero es el establecimiento de un contacto directo de célula a célula. Para ello, la célula donante genera una estructura filamentosa extracelular llamada pilus sexual. Se llama así porque la conjugación es una forma de apareamiento para las bacterias que se reproducen asexualmente, pero hay que tener en cuenta que no es una verdadera reproducción sexual ya que no se intercambian gametos y no se forman descendencias.

El segundo paso es la entrega de ADN a la célula receptora. Después de que el pilus sexual establece contacto entre dos células, se construye un conducto llamado sistema de secreción Tipo IV que permite la transferencia de ADN. A continuación, la célula donante comienza a replicar el ADN extracromosómico que se va a transferir, seleccionado en función de la presencia de un elemento genético conocido como OriT u origen de la transferencia. Un extremo del ADN recién replicado se enhebra en el conducto a través de la unión a proteínas del ADN. A medida que el ADN se replica aún más, se bombea a través del canal, facilitado por un complejo de proteínas codificadas por genes ubicados cerca del OriT. Una vez que el ADN se transfiere por completo, formará un plásmido cromosómico adicional o puede integrarse en el cromosoma de la célula receptora. Cualquiera que sea el punto final del ADN transferido, se expresarán los genes que codifica. Esta expresión génica se puede utilizar para confirmar el éxito de la conjugación.

Por ejemplo, considere un escenario en el que la cepa donante expresa resistencia a la ampicilina y la transmite en el ADN conjugado a la bacteria receptora, pero la cepa receptora también tiene un gen de resistencia a la tetraciclina que no está presente en el donante. En este caso, cuando las células se siembran en medios LB que contienen tetraciclina y ampicilina, las colonias deben crecer solo a partir de bacterias conjugadas con éxito, que expresarán ambos fenotipos de resistencia. Para confirmar aún más el éxito de la conjugación, se puede recolectar ADN plasmídico de estas colonias y luego se puede amplificar una sección de ADN específica del plásmido transferido mediante reacción en cadena de la polimerasa o PCR. Cuando el producto de PCR se ejecuta en un gel de electroforesis junto a una escalera de tamaños estándar, un fragmento de PCR de un tamaño conocido debe ser visible en el gel, lo que confirma aún más el éxito de la conjugación. En este experimento, se utilizará un plásmido para transferir el gen de resistencia a la ampicilina a través de la conjugación de una cepa donante a una cepa receptora resistente a la tetraciclina. Después de esto, para confirmar la conjugación, la mezcla de conjugación se incubará en una placa que contiene ambos antibióticos dejando solo las bacterias transformadas. Finalmente, el éxito de la conjugación se confirmará con la PCR.

Antes de comenzar el procedimiento, póngase el equipo de protección personal adecuado, que incluye una bata de laboratorio y guantes. A continuación, esterilice el espacio de trabajo con etanol al 70% para limpiar la superficie.

En este procedimiento, el gen de resistencia a la ampicilina se transferirá de la cepa WM3064 de E. coli a la cepa J53 de E. coli mediante conjugación. La cepa donante WM3064 es resistente a la tetraciclina y a la ampicilina y requiere ácido diaminopimélico, o DAP, para crecer. La cepa receptora J53 solo es resistente a la tetraciclina y no requiere DAP para crecer. Esto significa que las células conjugadas con éxito deben ser resistentes a la tetraciclina y a la ampicilina y pueden crecer sin DAP.

Prepare el cultivo de la cepa donante inoculando cinco mililitros de LB que contengan 0,3 milimoles de DAP con un trozo de la cepa donante congelada, caldo de glicerol. A continuación, prepare la cepa receptora inoculando cinco mililitros de caldo LB sin DAP con un trozo del caldo de glicerol de la cepa receptora congelada. Cultive estos cultivos durante la noche a 37 grados centígrados con aireación y agitación a 220 RPM en una incubadora agitadora. Una vez que los cultivos hayan crecido a un diámetro exterior de 600 de dos, retire un mililitro de cultivo de cada uno y colóquelo en dos nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros separados. Luego, centrifuga estas alícuotas a 3000 RPM durante cinco minutos para peletizar las células bacterianas. Deseche el sobrenadante y lave cada pellet con 250 microlitros de 1X PBS. Centrifugar las muestras de nuevo y, después de desechar el sobrenadante, volver a suspender cada pellet en 500 microlitros de PBS.

Para comenzar el procedimiento de conjugación, primero combine 50 microlitros de células receptoras con 50 microlitros de células donantes en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente. A continuación, pipetee 100 microlitros del cultivo celular receptor en otra placa de tetraciclina 1X que contenga DAP. A continuación, prepare su control negativo pipeteando 100 microlitros del cultivo celular receptor solo en una placa de agar no selectiva que contenga DAP. Luego, incube las placas de conjugación y control negativo durante la noche a 37 grados centígrados.

Al día siguiente, tome un raspador de células estéril y recoja las células de la placa de conjugación recolectando colonias. A continuación, transfiera las colonias a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de 1X PBS. Repita este proceso para recoger las células receptoras de la otra placa.

Después de esto, vórtice las muestras para mezclar. Después de mezclar, transfiera los tubos a una centrífuga para granular suavemente las células. Deseche el sobrenadante, luego lave los gránulos celulares en un mililitro de PBS y agite los tubos para resuspender las células. Vuelva a pellet las células por centrifugación. Deseche el sobrenadante nuevamente y vuelva a suspender ambos gránulos celulares en un mililitro de PBS. Ahora, utilizando una punta de pipeta estéril, coloque 100 microlitros de la mezcla de células de reacción de conjugación en una placa de agar LB sin DAP que contenga 1X tetraciclina y 1X ampicilina. Repita el método de recubrimiento utilizando 100 microlitros de una dilución diez veces mayor de la misma mezcla celular en PBS en otra placa de agar LB sin DAP que contenga 1X tetraciclina y 1X ampicilina.

Finalmente, pipetee 100 microlitros de la mezcla de celdas de control negativo en una sola placa de agar LB con solo tetraciclina 1X. Después de la incubación nocturna a 37 grados centígrados, las colonias deben ser visibles. Con una punta de pipeta estéril, elija una sola colonia de la placa de reacción de conjugación y agréguela a un tubo que contenga cinco mililitros de medios LB selectivos que contengan ambos antibióticos. Luego, repita el aislamiento de la colonia seleccionando una sola colonia de la placa de celda receptora. Cultive estos cultivos durante la noche a 37 grados centígrados con aireación a 220 RPM.

Al día siguiente, limpie la mesa de trabajo con etanol al 70% y retire las placas de la incubadora. Use un mini kit de preparación de ADN para aislar el ADN de 4. 5 mililitros de cada cultivo según las instrucciones del fabricante. Después de completar la mini preparación de ADN, eluya el ADN usando 35 microlitros de agua libre de nucleasas. Por último, utilice el 0 restante. 5 mililitros de cada cultivo para preparar un mililitro de reservas de glicerol añadiendo 0,5 mililitros de glicerol al 100% para una dilución uno a uno. Coloque estas alícuotas a menos 80 grados centígrados para almacenarlas hasta que las necesite.

Para confirmar la conjugación exitosa por PCR, primero prepare una mezcla maestra de PCR agregando 75 microlitros de mezcla maestra de PCR 2X a un tubo de microcentrífuga. A continuación, añada 7,5 microlitros de un cebador directo de 10 micromolares y un cebador inverso de 10 micromolares diseñado para amplificar el gen de resistencia a la ampicilina del plásmido. A continuación, prepare una segunda mezcla maestra de PCR agregando 75 microlitros de mezcla maestra de PCR 2X a un tubo de microcentrífuga y luego agregue 7,5 microlitros de un cebador directo de 10 micromolares y un cebador inverso de 10 micromolares diseñado para amplificar un gen de limpieza, en este caso la ADN girasa B.

Ahora, agregue 15 microlitros de la primera mezcla maestra a un tubo de PCR y luego agregue 10 nanogramos, aproximadamente dos microlitros del ADN experimental molde al mismo tubo. Lleve la reacción hasta un volumen final de 25 microlitros con agua libre de nucleasas. Repita estos pasos para producir las cinco reacciones restantes, de modo que los tubos contengan los componentes que se muestran aquí. Ahora, transfiera estas reacciones a un termociclador con el bloque precalentado a 98 grados centígrados y luego inicie el programa. Una vez finalizada la PCR, retire los tubos de la máquina. A continuación, cargue dos microlitros de cada reacción mezclados con dos microlitros de colorante de carga y cuatro microlitros de un marcador de peso molecular en pocillos consecutivos de un gel de agarosa al 1%. Configure el gel para que funcione a 150 voltios durante 20 minutos. Por último, visualiza el gel con un iluminador UV.

En este experimento, se confirmó la transferencia exitosa del gen de resistencia a la ampicilina a través de la conjugación mediante PCR. Aquí, se debe observar una banda de aproximadamente 500 pares de bases en el pocillo que contiene el ADN conjugado y los cebadores de ampicilina, el pozo dos en este ejemplo. Un gen de mantenimiento, la ADN girasa B, se cargó en los pocillos tres y cinco con ADN conjugado y ADN de la célula receptora, respectivamente. Las bandas observadas en estos pocillos actúan como un control positivo para garantizar que la plantilla de ADN esté presente y que la PCR haya sido exitosa. No se deben observar bandas en el pocillo que contiene la reacción para el ADN de la célula receptora y el par de cebadores de ampicilina, el pocillo cuatro en este ejemplo, porque las células receptoras no son resistentes a la ampicilina. Además, no se deben observar bandas en las reacciones que carecen de ADN molde, pozos seis y siete aquí. Si se cumplen estas condiciones, esto confirmará la transferencia exitosa del gen de resistencia a la ampicilina, confiriendo resistencia a la ampicilina de la cepa WM3064 de E. coli a la cepa J53 de E. coli.