Conjugación: Un método para transferir resistencia a ampicilina de un donante a una E. Coli receptora

1. Configuración

1. Autoclave aproximadamente 1L de medio Luria-Bertani (LB). Este LB estéril se utilizará para hacer aproximadamente 5 ml de LB que contengan 0,3 mM de ácido diaminopimelico (DAP).
2. Recoger las siguientes placas: placas de agar LB con 1X Tet y 0.3 mM DAP, placas de agar LB con 1X Tet solamente, y placas de agar LB con 1X Amp/Tet solamente.
3. Asegúrese de que un poco de glicerol y una caja de puntas de pipeta de plástico preesterilizadas estén cerca.
4. Antes de comenzar cualquier trabajo que involucre microbios, esterilice el espacio de trabajo con 70% de etanol. Use siempre el equipo de protección personal necesario, incluyendo una capa de laboratorio y guantes.
5. Una vez terminado, esterilizar todas las superficies y guantes con 70% de etanol y lavarse las manos.

2. Preparación de la tensión del donante y del receptor

1. Preparar cultivos bacterianos de 5 ml del donante y las cepas receptoras y cultivarlas durante la noche a 37 oC con aireación y agitación a 220 rpm. La cepa del donante debe cultivarse en LB con 0,3 mM DAP.
2. Gire hacia abajo 1 ml de ambos cultivos (3000 rpm durante 5 minutos) y lave las células con PBS.
3. Resuspenda las células en 500 sl de solución salina tamponada de fosfato (PBS).

3. Conjugación

1. Combinar 50 l de células receptoras con 50 l de células de donante en un tubo de microcentrífuga y mezclar mediante pipeteo.
2. Incubar la mezcla celular durante 1 hora a 37oC. Esto mejorará la eficiencia de la conjugación antes y durante el siguiente paso de chapado.
3. Pipet 100 l de la mezcla de células en una placa de agar con 1X Tet y 0,3 mM DAP. No se extienda sobre la placa.
4. Pipet 100 l de cultivo de celda receptora en una placa de agar con 1X Tet y 0,3 mM DAP. No se extienda sobre la placa.
5. Incubar ambas placas durante la noche a 37oC.
6. Raspar la mezcla de células de conjugación y el cultivo de la célula receptora con un rascador de células estériles. Transfiera las células al tubo de microcentrífuga estéril y resuspenda las células en 1 ml de PBS.
7. Vortex las células y girar suavemente hacia abajo (3000 rpm durante 5 minutos).
8. Resuspenda las celdas en 1 ml de PBS.
9. Placar la mezcla de células de reacción de conjugación en una placa de agar LB con 1X Amp/Tet solamente. En esta placa, sólo se espera que crezcan las bacterias receptoras que obtuvieron con éxito el gen de resistencia del amplificador a través de la conjugación.
10. Placa relparte las células receptoras a una placa de agar LB con 1X Tet solamente. En esta placa, sólo se espera que crezcan las bacterias receptoras no conjugadas, que no tienen el gen de resistencia amperio.
11. Incubar las placas durante la noche a 37oC.
12. Recoger colonias individuales de ambas placas y utilizarlas para cultivar cultivos nocturnos en 5 ml de medios (37 oC con aireación a 220 rpm).

4. Aislamiento de ADN

1. Aísle el ADN de los cultivos previamente preparados utilizando 4,5 ml del volumen de cultivo total por minipreparación de ADN.
2. Para ello, eluir el ADN usando 35 l de agua libre de nucleasas.
3. El ADN puro generará una relación de absorbancia (A_260/280)de aproximadamente 1,8.
4. Utilice los 0,5 ml restantes de cada cultivo para preparar las existencias de glicerol haciendo una mezcla de 1:1 de cultivo bacteriano y 100% glicerol.
5. Almacene las existencias del congelador a -80 oC.

5. Confirmación de la Conjugación de Transferencia de Plásmido por PCR

1. Preparar dos mezclas maestras de PCR, cada una con un conjunto diferente de imprimaciones hacia adelante y hacia atrás, una dirigida a un segmento de par base 500 dentro del gen de resistencia a la ampicilina y la otra dirigida a un segmento dentro de un gen de limpieza.
   1. Las imprimaciones genéticas de limpieza se diseñaron para amplificar un segmento de ADN dentro de la codificación del gen bacteriano para la gengensa b (14) del ADN.
   2. Se utilizaron los siguientes volúmenes de reactivos para preparar 90 ml de cada mezcla maestra:
      7,5 ml de imprimación delantera de 10 m
      7,5 ml de imprimación inversa de 10 m
      75 l de mezcla maestra de PCR 2X
2. Preparar las siguientes seis reacciones de PCR utilizando una mezcla maestra de 15 l, 10 ng de ADN de plantilla y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 25 l.
   Reacción de conjugación INTRODUCciones de ADN y ampicilina
   Reacción de conjugación ADN y imprimaciones de limpieza
   Primers de ADN y ampicilina de control negativo
   El ADN de control negativo y las imprimaciones de limpieza
   Sin introducciones de ADN y ampicilina
   Sin ADN ni imprimaciones de limpieza
3. Transfiera estas reacciones a una máquina PCR con el bloque precalentado a 98 C y comience el termocycling en las siguientes condiciones:
   98 oC durante 30 segundos
   25-35 ciclos de 98oC durante 5-10 segundos, 45-72oC durante 10 a 30 segundos y 72oC durante 15-30 segundos por kb
   72 oC durante 5-10 minutos
   Sostener a 4 oC
4. Cargue las seis reacciones de PCR en un gel de agarosa del 1% y corra a 150 V durante unos 20 minutos.
5. Visualice el producto de PC utilizando un iluminador UV.