Transducción de fagos: Un método para transferir resistencia a ampicilina de un donante una E. coli receptora

Las bacterias pueden adaptarse rápidamente a un entorno que cambia rápidamente mediante el intercambio de material genético y una forma de hacerlo es a través de la transducción, el intercambio de material genético mediado por virus bacterianos. Un bacteriófago, a menudo abreviado como fago, es un tipo de virus que infecta a las bacterias adhiriéndose primero a la superficie del huésped y luego inyectando su ADN en la célula bacteriana. A continuación, degrada el propio ADN de la célula huésped y replica su genoma viral, al tiempo que secuestra la maquinaria de la célula para sintetizar muchas copias de sus proteínas. Estas proteínas de fagos luego se autoensamblan y empaquetan los genomas de los fagos para formar múltiples progenies. Sin embargo, debido a la baja fidelidad del mecanismo de empaquetamiento del ADN, ocasionalmente, el fago empaqueta fragmentos de ADN bacteriano en la cápside del fago. Después de inducir la lisis del huésped, se libera la progenie del fago y, una vez que dicho fago infecta a otra célula huésped, transfiere el fragmento de ADN de su huésped anterior. Esto puede recombinarse e incorporarse permanentemente al cromosoma del nuevo huésped, mediando así la transferencia de genes entre las dos bacterias.

Para llevar a cabo la transducción de fagos en el laboratorio se requiere una cepa donante que contenga un gen de interés, una cepa receptora que carezca de él, un fago que pueda infectar ambas cepas y un método para seleccionar las bacterias transducidas. En la mayoría de los casos, se tratará de un medio de crecimiento sólido selectivo que favorece el crecimiento de las bacterias transducidas, pero inhibe el crecimiento de las no transducidas. Para empezar, la cepa donante que contiene el gen de interés se cultiva en un medio de crecimiento líquido. Cuando todas las bacterias se están dividiendo activamente en la fase logarítmica de su crecimiento, el cultivo se inocula con el fago objetivo. Después de tres o cuatro horas de incubación, cuando casi todas las bacterias se han lisado y liberado las partículas de fagos, el lisado de fagos donante se inocula en un cultivo recién crecido de la cepa bacteriana receptora. Después de una breve incubación de una hora, el cultivo debe contener una mezcla de células bacterianas transducidas y no transducidas, que se examina para detectar las células transducidas esparciendo una fracción de la suspensión sobre un medio de crecimiento sólido selectivo adecuado. Tras una incubación posterior, las células transducidas deben crecer y multiplicarse para producir colonias visibles. A continuación, estas colonias se pueden seleccionar para su posterior análisis utilizando una variedad de métodos para confirmar aún más el éxito de la transducción, como la PCR de colonias, la secuenciación de ADN o la PCR cuantitativa.

Antes de comenzar el procedimiento, póngase cualquier equipo de protección personal adecuado, incluida una bata de laboratorio y guantes. A continuación, esterilice el espacio de trabajo con etanol al 70% y limpie la superficie.

Después de esto, prepare tres alícuotas de un mililitro de solución salina LB. Ahora, prepare un cultivo de cepa donante agregando 100 microlitros de E. coli a un vial cónico de 15 mililitros que contiene cinco mililitros de medio de crecimiento LB con 500 microgramos de ampicilina. Luego, cultive el cultivo durante la noche a 37 grados centígrados con aireación y agitación a 220 rpm. Al día siguiente, limpie la mesa de trabajo con etanol al 70% antes de retirar el cultivo de la incubadora agitadora. A continuación, diluya el cultivo nocturno de uno a 100 añadiendo 10 microlitros de cepa donante a 990 microlitros de LB fresco suplementado con solución salina.

Deje que la dilución bacteriana crezca a 37 grados centígrados durante dos horas con aireación y agitación a 220 rpm. Una vez que las células hayan alcanzado la fase logarítmica temprana, retire el cultivo de la incubadora, agregue 40 microlitros de fago P1 al cultivo y vuelva a incubar. Continúe monitoreando las células durante una a tres horas hasta que el cultivo haya lisado. A continuación, agregue de 50 a 100 microlitros de cloroformo al lisado y mezcle por vórtice. Luego, centrifuga el lisado para eliminar los desechos y transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo. Agregue unas gotas de cloroformo al sobrenadante y guárdelo a cuatro grados centígrados durante no más de un día.

Para comenzar el procedimiento de transducción, obtenga un cultivo de un mililitro de la cepa receptora. A continuación, transfiera 100 microlitros de lisado de fagos donante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros e incube a 37 grados centígrados con la tapa abierta durante 30 minutos para permitir que se evapore el cloroformo restante. Mientras se incuba el lisado del fago donante, granule las células de la cepa receptora mediante una centrifugación suave. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 300 microlitros de LB fresco que contenga 100 milimolares de sulfato de magnesio y cinco milimolares de cloruro de calcio.

A continuación, configure la reacción de transducción combinando 100 microlitros de la cepa receptora y 100 microlitros del lisado de fagos donante en un tubo de microcentrífuga. A continuación, configure el control negativo combinando 100 microlitros de la cepa receptora y 100 microlitros de la LB con sulfato de magnesio y cloruro de calcio. Después de la incubación, agregue 200 microlitros de citrato de sodio molar y un mililitro de LB a ambos tubos, y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Luego, después de que los tubos se hayan incubado durante una hora, granule suavemente las células mediante centrifugación.

Después de centrifugar, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células peletizadas en 100 microlitros de LB con citrato de sodio 100 milimolares. Agite las soluciones y pipetee toda la muestra transducida en una placa de agar LB con ampicilina 1X. Por último, pipetee todo el volumen de la mezcla de células de control negativo en una placa de agar LB sin ampicilina. Después de incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados, use una punta de pipeta estéril para recoger tres o cuatro colonias de la placa de transducción y clavarlas en una nueva placa de agar LB que contenga 1X ampicilina y 100 microlitros de citrato de sodio molar. Repita este método de recubrimiento para el control negativo en otra placa de agar LB que contenga solo 100 microlitros de citrato de sodio molar. Luego, incube las placas a 37 grados centígrados durante la noche para permitir que crezcan colonias libres de fagos.

Al día siguiente, limpie la mesa de trabajo con etanol al 70% antes de retirar las placas de la incubadora. Con una punta de pipeta estéril, elija tres colonias de la placa de transducción y agréguelas cada una a un tubo separado que contenga cinco mililitros de medio LB. Luego, seleccione tres colonias de la placa de control negativo y agréguelas a otro tubo que contenga cinco mililitros de medio LB. Cultive los cultivos durante la noche a 37 grados centígrados con aireación y agitación a 220 rpm. Después de esterilizar la mesa de trabajo como se demostró anteriormente, utilice un kit de minipreparación de ADN para aislar el ADN de 4,5 mililitros de cada cultivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, eluir el ADN con 35 microlitros de agua libre de nucleasas y medir la concentración resultante con un espectrofotómetro de laboratorio. Por último, prepare las reservas de glicerol añadiendo los 0,5 mililitros restantes de ambas soluciones bacterianas a 0,5 mililitros de glicerol al 100%.

Para confirmar la transducción, primero prepare dos mezclas maestras de qPCR para 24 reacciones de qPCR. Para la primera mezcla maestra, agregue 150 microlitros de mezcla tampón de qPCR a un tubo de microcentrífuga y 12 microlitros de un cebador directo e inverso diseñado para amplificar el gen de resistencia a la ampicilina. A continuación, prepare una segunda mezcla maestra de qPCR agregando 150 microlitros de mezcla maestra de qPCR a un tubo de microcentrífuga y luego agregando 12 microlitros de un cebador directo y otro de cebador inverso diseñados para amplificar un gen de limpieza.

Para cada reacción de qPCR, combine 100 microgramos de ADN experimental de cada reacción con 14,5 microlitros de mezcla maestra de qPCR. Ahora, prepare las reacciones restantes como se demostró anteriormente. Transfiera las reacciones a un termociclador precalentado a 94 grados centígrados y luego inicie el programa. Por último, utilice los valores de cuantificación del ciclo, o Cq, generados por qPCR para calcular la eficiencia de transducción normalizada del gen de resistencia a la ampicilina.

Los valores de cuantificación del ciclo, o Cq, para los genes de interés se tabularon para cada uno de los controles negativos y las muestras transducidas. Los valores bajos de Cq, normalmente por debajo de 29 ciclos, como las muestras transducidas en este ejemplo, indican cantidades altas de la secuencia objetivo.

Un gen de mantenimiento, también tabulado aquí, se utiliza como control de carga para normalizar la cantidad de ADN en cada reacción y como control positivo para garantizar que la qPCR esté funcionando. Siempre que se carguen las mismas cantidades del gen de limpieza, se encuentra a una tasa relativamente igual en cada muestra.

A continuación, para calcular el valor delta de Cq para cada muestra, reste el valor de Cq del gen de mantenimiento de cada muestra del valor de Cq de su gen objetivo correspondiente. Por ejemplo, el delta Cq del primer control negativo es 13,54. A continuación, utilice este valor para calcular la eficiencia de transducción normalizada de cada muestra utilizando la fórmula que se muestra aquí. Finalmente, se puede calcular la eficiencia promedio de transducción normalizada para cada grupo de muestra.