Transducción de fagos: Un método para transferir resistencia a ampicilina de un donante una E. coli receptora

1. Configuración

1. Antes de empezar cualquier trabajo que involucre microbios, esterilice el espacio de trabajo con 70% de etanol. Utilice siempre el EPP necesario (abrigo de laboratorio y guantes).
2. Asegúrese de que las placas de agar LB con 1x ampicilina, solución de lysato de fago P1 disponible en el uso comercial, cloroformo, citrato de sodio 1 M, glicerol y una caja de puntas de pipeta de plástico preesterilizadas y esparcidores celulares están cerca.
3. Preparar el LB estéril mediante autoclave y utilizarlo para hacer tres alícuotas de 1 ml de solución de sal LB.
   1. mM MgCl₂ (952.11-2.3803 g), 5 mM CaCl₂ (11.098 mg), 0.1-0.2% glucosa (100-200 g)
   2. mM MgSO₄ (12.0366 mg), 5 mM CaCl₂ (11.098 mg)
   3. citrato de sodio mM (25.806 mg)
4. Una vez terminado, esterilizar todas las superficies, así como los guantes con 70% de etanol y lavarse las manos.

2. Protocolo

1. Preparación del donante Phage Lysate
   1. Preparar un cultivo de 1 ml de cepa W3110 del donante E. coli en LB con 1x ampicilina cultivada durante la noche a 37oC con aireación y agitación a 220 rpm.
   2. Diluir este cultivo nocturno 1:100 en 1 mL de LB fresco complementado con 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂y 0.1-0.2% glucosa.
   3. Cultivar esta dilución bacteriana a 37oC durante 2 horas con aireación y agitación a 220 rpm.
   4. Una vez que estas células han alcanzado la fase de crecimiento logarítmico temprano (crecimiento notable y ligera turbidez), añadir 40 l de fago P1 disponible comercialmente y dejar a 37 oC con aireación y temblor a 220 rpm.
      1. Antes de la adición de fago, la densidad óptica medida a 600 nm de estas células debe ser aproximadamente 0,4 (6).
   5. Supervise las células durante 1-3 horas hasta que el cultivo se haya lisado.
      1. La lisis resultará en un aumento de los desechos celulares, así como una disminución notable en la turbidez (es decir, las células se considerarán lysed una vez que uno es capaz de ver a través del cultivo).
   6. Añadir varias gotas (50-100 l) de cloroformo al lisado y mezclar por vórtice.
      1. El cloroformo esteriliza el lisato del fago matando las células restantes del donante, dejando sólo fago y aumentando el titer de este lisato.
   7. El lisado de centrífuga a 14.000 rpm durante 2 minutos para eliminar los escombros y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
   8. Añadir unas gotas de cloroformo y almacenar a 4 oC durante no más de un día.
2. Transducción
   1. Preparar un cultivo de 1 ml de cepa Receptora J53 E. coli cultivada durante la noche en LB a 37oC con aireación y agitación a 220 rpm.
   2. Transfiera 100 ml de lisato de fago donante (2.1) a un tubo de microfúgelo de 1,5 ml e incubar con tapa abierta a 37 oC durante 30 minutos.
      1. Esta incubación permite que cualquier cloroformo restante en la solución de lisato P1 se evapore antes de ser añadido a las células receptoras.
   3. Células de deformación de cepa receptoras de pellets suavemente por centrifugación a 6.000 rpm durante 5 minutos.
   4. Resuspenda estas células en 300 ml de LB fresco que contenga 100 mM MgSO₄ y 5 mM CaCl₂. (P1 fago requiere que el calcio sea infeccioso).
   5. Configurar dos reacciones utilizando las células bacterianas receptoras y el lisato de fago de donante preparado: 1) reacción de transducción combinando cepa J53 receptor a 100 l E53 y lisato de fago donante de 100 ol, y 2) control negativo que combina cepa J53 receptor de 100 l E. coli y 100 l de LB que contienen 100 mM MgSO₄ y 5 mM CaCl₂.
   6. Incubar a 37oC durante 30 minutos con agitación a 220 rpm.
   7. Añadir 1 ml de LB y citrato de sodio de 200 ml y 1 M (pH-5,5) e incubar durante 1 hora a 37 oC con agitación a 220 rpm.
      1. El citrato se utiliza para reducir la infectividad de P1 quelándose con calcio, evitando la lisis de las bacterias receptoras.
      2. La incubación de esta solución permite la expresión del marcador de resistencia a la ampicilina.
   8. Células de pelet por centrifugación a 6.000 rpm durante 5 minutos.
   9. Resuspender los gránulos celulares en 100 ml de LB con citrato de sodio de 100 mM (pH 5.5). Vórtice y solución entera de placas para ambas reacciones en dos placas de agar LB.
      1. La placa LB debe tener 1 x amperio para la muestra transducida y ningún amplificador para el control negativo.
      2. La contaminación por fago P1 en esta placa requiere volver a rayar antes de que se puedan preparar las existencias del congelador.
      3. Si no se elimina el fago, los cultivos cultivados de estas colonias no crecerán a menos que en presencia de un quelante de calcio.
   10. Escoja alrededor de 3-4 colonias de ambas placas y vuelva a rayar en dos placas de agar LB esparcidas con 100 ml de citrato de sodio de 1 M (pH-5,5).
       1. La placa LB debe tener 1 x amperio para la muestra transducida y ningún amplificador para el control negativo.
   11. Incubar las placas a 37oC durante la noche para permitir que crezcan colonias libres de fagos.
   12. Recoger las colonias de ambas placas y utilizarlas para cultivar cultivos nocturnos en 5 mL de LB a 37 oC con aireación y agitación a 220 rpm.
   13. Aísle el ADN de estos cultivos mediante el miniajuste de ADN utilizando 4,5 ml del volumen total de cultivo.
       1. Eluda el ADN con 35 ml de agua libre de nucleasas.
       2. Mida la concentración resultante por Nanodrop. El ADN puro generará una relación de absorbancia (A_260/280)de aproximadamente 1,8.
   14. Utilice los 0,5 ml restantes de cada cultivo para preparar 1 ml de reservas de glicerol haciendo una mezcla de 1:1 de 100% glicerol y cultivo bacteriano.
   15. Conservar las existencias de glicerol bacteriano a -80 oC.

3. Análisis de datos y resultados

1. Confirmación de transducción por qPCR
   1. Preparar dos mezclas maestras qPCR para seis reacciones qPCR, tres usando imprimaciones qPCR para el gen de resistencia a la ampicilina, y las otras tres usando imprimaciones qPCR para un gen de limpieza (14,5 l por reacción): mezcla tampón qPCR de 12,5 l + imprimación directa de 1 L + imprimación inversa de 1 L.
      1. En este experimento, usamos SYBR Green master mix.
      2. Las imprimaciones genéticas de limpieza se diseñaron para amplificar un segmento de ADN dentro de la codificación del gen bacteriano para la gengensa b (7) del ADN.
   2. Para cada reacción qPCR, combine 100 g de ADN de cada reacción (10,5 l) con 14,5 ml de mezcla maestra qPCR.
   3. Utilizando una máquina qPCR y el protocolo de termociclismo enumerado en la Tabla 1, la amplificación se midió para los genes de resistencia a la ampicilina y limpieza para las seis reacciones.
   4. Los valores Cq generados por qPCR se utilizaron para calcular la eficiencia normalizada de transducción del gen de resistencia a la ampicilina (Figura 3), confirmando la transducción exitosa del gen de resistencia a la ampicilina.
      1. El valor Cq, o valor de cuantificación de ciclo, de una muestra es el número de ciclo PCR más antiguo en el que se detecta una señal excedida el umbral de fondo. Los valores Bajos de Cq corresponden a más secuencia de destino, viceversa.
      2. La eficiencia normalizada de transducción de un gen dentro de una muestra se puede calcular utilizando estos valores Cq restando el valor del gen de limpieza del gen de destino, generando un valor de "Cq", que puede utilizarse para calcular la transducción normalizada eficiencia en 2^(-Cq).

	Temperatura	hora
Desnaturalización	94 oC	2 min
40 ciclos:
Desnaturalización	94 oC	15 seg
Lectura de recocido, extensión y fluorescencia	60 oC o 5 oC por debajo de la imprimación más baja Tm	1 min

Tabla 1: protocolo de termociclismo qPCR