Integración de genes dirigidos mediada por TALEN: uso de nucleasas específicas de secuencia modificadas para la inserción precisa de genes de proteínas fluorescentes en hiPSC

Comience con células madre pluripotentes inducidas por humanos o suspensión de hiPSC en el medio. Agregue un par de nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción o plásmidos que codifican TALEN. Suplementar con un plásmido donante que lleve un gen de proteína fluorescente, acoplado a un gen de resistencia a los antibióticos, con brazos de homología adyacentes para una alineación específica con los loci diana.

Electroporar la mezcla para generar poros transitorios en las membranas celulares, lo que permite la internalización del plásmido. Una vez dentro de las células, los plásmidos que codifican TALEN se procesan, produciendo TALEN, proteínas quiméricas compuestas por un dominio de unión al ADN TALE específico del sitio fusionado con un dominio de escisión de endonucleasa de restricción FokI no específico.

Cada monómero TALEN a través de su dominio de unión al ADN, que comprende módulos de repetición de aminoácidos en tándem, reconoce y se une a los loci diana, un módulo por nucleótido, en cada hebra de ADN en orientaciones opuestas, separadas por una secuencia espaciadora. Los dominios FokI luego dimerizan y escinden el ADN dentro de la secuencia espaciadora, creando rupturas de doble hebra con voladizos.

En presencia de plásmido donante que contiene brazos de homología complementarios a las regiones que flanquean el sitio escindido, se produce una reparación dirigida por homología utilizando la secuencia homóloga como molde para la síntesis de reparación del ADN para salvar las roturas de doble cadena. Después de la ligadura de las muescas, la proteína fluorescente intermedia y los genes de resistencia a los antibióticos se integran en el genoma del huésped.

Trate las hiPSC, sembradas en una capa de células alimentadoras para apoyar el crecimiento, con medios que contengan antibióticos. El gen de resistencia a los antibióticos sin promotor, impulsado por un promotor endógeno aguas arriba, facilita la selección de células editadas con TALEN.

Comience lavando los cultivos de iPSC una vez cada uno con PBS, luego agregue 1 mililitro de reactivo de disociación celular suave a 37 grados Celsius a cada pocillo e incube las células a 37 grados Celsius durante aproximadamente 5 minutos. Cuando más del 50% de las células se hayan disociado del recipiente de cultivo, utilice una pipeta P1000 para interrumpir mecánicamente los grupos celulares restantes o las células adheridas. Luego, agregue 2 mililitros de medio E8 a cada pocillo y use una pipeta de 10 mililitros para desagregar aún más los cultivos en suspensiones unicelulares.

Ahora, vierta las células recolectadas en un tubo cónico de 15 mililitros y gírelas hacia abajo. Vuelva a suspender el gránulo en una cantidad mínima de medio E8 para contar. Luego, después de confirmar la viabilidad de los cultivos mediante la exclusión del azul de tripano, así como su disociación suficiente, transfiera 3 millones de células a cada uno de los dos tubos cónicos de 15 mililitros.

Mientras las células centrifugan, configure el sistema de electroporación en el programa específico del tipo de célula para la línea de células madre embrionarias humanas, H9. Luego, agregue 10 microgramos del donante de recombinación homólogo solo a 1 sedimento para la muestra de control y 10 microgramos del plásmido del donante de recombinación homólogo junto con 5 microgramos de cada plásmido TALEN para la muestra experimental.

A continuación, agregue 100 microlitros de solución completa de transfección de células primarias P3 a temperatura ambiente a cada uno de los gránulos de control y experimentales, y vuelva a suspender las células. Transfiera las muestras a cubetas individuales y luego, electropore las muestras. Inmediatamente después de la transfección, agregue 500 microlitros de medio E8 a temperatura ambiente a cada cubeta y luego, transfiera las muestras de iPSC seccionadas gota a gota a placas individuales de 10 centímetros que contengan fibroblastos embrionarios de ratón DR4.