Integración de genes dirigidos mediada por TALEN: uso de nucleasas específicas de secuencia modificadas para la inserción precisa de genes de proteínas fluorescentes en hiPSC

Comience con células madre pluripotentes inducidas por humanos o suspensión de hiPSC en el medio. Agregue un par de nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción o plásmidos que codifican TALEN. Suplementar con un plásmido donante que lleve un gen de proteína fluorescente, acoplado a un gen de resistencia a los antibióticos, con brazos de homología adyacentes para una alineación específica con los loci diana.

Electroporar la mezcla para generar poros transitorios en las membranas celulares, lo que permite la internalización del plásmido. Una vez dentro de las células, los plásmidos que codifican TALEN se procesan, produciendo TALEN, proteínas quiméricas compuestas por un dominio de unión al ADN TALE específico del sitio fusionado con un dominio de escisión de endonucleasa de restricción FokI no específico.

Cada monómero TALEN a través de su dominio de unión al ADN, que comprende módulos de repetición de aminoácidos en tándem, reconoce y se une a los loci diana, un módulo por nucleótido, en cada hebra de ADN en orientaciones opuestas, separadas por una secuencia espaciadora. Los dominios FokI luego dimerizan y escinden el ADN dentro de la secuencia espaciadora, creand