Carga de perlas para introducir ácidos nucleicos en células cultivadas adherentes: una técnica para cargar plásmidos fluorescentes que codifican proteínas en células de mamíferos adherentes

Comience con un cultivo de células de mamíferos adherentes en una placa de cultivo. Transfiera perlas de vidrio esterilizadas, tratadas con álcali y de tamaño micrométrico a la cámara de un aparato de carga de perlas personalizado. Cubra la abertura de la cámara con una malla con aberturas de tamaño óptimo para permitir que las perlas pasen durante la carga. Asegure la malla con un conjunto de cámara de imágenes.

Retire el papel de la placa. Pipetee una suspensión de ADN plasmídico que codifica proteínas reporteras fluorescentes en la placa para una distribución uniforme sobre las células. Con el aparato de carga de perlas, disperse suavemente una monocapa de perlas de vidrio sobre las celdas. Golpee brevemente la placa de cultivo con la fuerza adecuada.

Las perlas de vidrio ruedan brevemente sobre las células adherentes, mientras que el tratamiento alcalino las hace menos adherentes a las células. El impacto de las colisiones entre perlas y células transmite una tensión adecuada creando interrupciones localizadas en las membranas celulares. Estos poros transitorios formados de pequeñas dimensiones facilitan la absorción de ADN plasmídico en las células al tiempo que evitan la entrada de perlas grandes.

Durante el período de recuperación, la membrana celular se vuelve a sellar, restaurando la integridad de la membrana y atrapando el ADN plasmídico. Agregue medios a la placa y aspire con cuidado las perlas flotantes visibles de la placa. Incuba el plato.

Las células transfectadas con éxito que contienen ADN plasmídico expresan las proteínas reporteras fluorescentes, que se pueden visualizar bajo un microscopio de fluorescencia.

Retire el medio de las celdas y aspire suavemente todo el medio de alrededor de los bordes de la cámara. Luego, incline la cámara en un ángulo de aproximadamente 45 grados y retire la gota restante de medio en el micropocillo central. Pipetear suavemente la solución de carga de perlas sobre el micropocillo de vidrio presente en el centro de la cámara.

Utilice el aparato de carga de perlas para dispersar suavemente una monocapa de perlas de vidrio sobre las celdas. Asegúrese de que las perlas cubran las celdas por completo. Pellizca la cámara con dos dedos. Levántelo alrededor de dos pulgadas y bájelo firmemente con una fuerza aproximadamente equivalente a dejar caer el plato desde esa altura.

Vuelva a añadir suavemente el medio en la cámara pipeteando lentamente en el lado de plástico de la cámara. Aspire las perlas flotantes sin perturbar las células. Todo el procedimiento de carga de perlas debe realizarse con relativa rapidez, para que las celdas no se sequen cuando no tienen medio. Luego, incube las células durante 0,5 a 2 horas en la incubadora.