Transfección in vitro basada en magnetofelicción: una técnica asistida por campo magnético para administrar plásmidos en células neuronales primarias de ratón utilizando nanopartículas magnéticas

Comience con ADN plasmídico fluorescente que codifica proteínas o suspensión de ADNp en el medio. Agregue nanopartículas magnéticas biocompatibles recubiertas de polímeros catiónicos a la suspensión de ADNp e incube.

Los polímeros catiónicos cargados positivamente interactúan electrostáticamente y se conjugan con el ADNp cargado negativamente, lo que da como resultado la condensación del ADNp y la formación de "poliplexores magnéticos" con una carga positiva general.

Ahora, transfiera la mezcla de polyplex a una placa de pocillos múltiples que contenga un cultivo de células neuronales primarias de ratón adheridas. Monte la placa de pocillos múltiples sobre una placa magnética e incube.

El campo magnético generado por la placa magnética hace que los poliplexores se sedimenten y se acumulen sobre la superficie de la célula neuronal. Este estrecho contacto con la superficie celular facilita la unión no específica de poliplexos cargados positivamente a proteoglicanos asociados a la membrana celular cargados negativamente.

Posteriormente, los poliplexos se internalizan a través de la endocitosis, un proceso en el que las regiones locales de la membrana celular se invaginan y se pellizcan para formar vesículas unidas a la membrana llamadas endosomas.

Dentro del citoplasma, los polímeros catiónicos del poliplex inducen la acumulación de protones en el endosoma. La afluencia simultánea de iones de cloruro para mantener la neutralidad de la carga aumenta la fuerza iónica endosómica, lo que lleva a la entrada de agua.

Eventualmente, los endosomas se hinchan y se rompen debido a la presión osmótica, liberando poliplex en el citoplasma. El ADNp condensado dentro de los poliplexos facilita una mayor motilidad citosólica, mientras que los polímeros catiónicos protegen el ADNp de la degradación de las nucleasas citoplasmáticas.

Después de la disociación de los poliplex, el ADNp liberado, durante la fase apropiada del ciclo celular cuando la membrana nuclear se desmonta temporalmente, se transloca al núcleo. Las células transfectadas con éxito con ADNp expresan proteínas fluorescentes.

Para cultivar neuronas motoras, diluirlas a 5.000 a 10.000 células en 500 microlitros de medio de cultivo por pocillo en una placa de 24 pocillos. A continuación, retire la solución laminada con una punta de pipeta P1000. Transfiera inmediatamente las neuronas motoras diluidas en medio de cultivo a las placas de recubrimiento para evitar que se sequen.

Para preparar el ADN, resuspenda 1 microgramo de ADN en 50 microlitros de medio de cultivo neuronal y vórtice durante 5 segundos. Para preparar el tubo de perlas, vuelva a suspender 1,5 microlitros de perlas en 50 microlitros de medio de cultivo neuronal. Agregue 50 microlitros de solución de perlas a 50 microlitros de solución de ADN e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Durante esta incubación, retire 100 microlitros de medio de cultivo del pocillo que se transfectará. Posteriormente, transfiera 100 microlitros de la mezcla de perlas de ADN a cada pocillo e incube la placa de 24 pocillos de 20 a 30 minutos en la placa magnética a 37 grados centígrados.