Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:26 min. • July 8th, 2025
Las células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, son células sanguíneas circulatorias con núcleos grandes y únicos, que comprenden linfocitos B y T, células asesinas naturales, monocitos y células dendríticas. Las PBMC almacenan el excedente de glucosa en forma polimérica como glucógeno, un polisacárido ramificado, en su citoplasma.
Para detectar la presencia de glucógeno en las PBMC, prepare un frotis uniforme de PBMC aislados en un portaobjetos de vidrio. Trate las células con formalina, una solución fijadora que reticula las biomoléculas celulares, preservando la integridad estructural de las PBMC.
Sumerja parcialmente el portaobjetos en solución de amilasa. Esta enzima ingresa a las células e hidroliza el glucógeno en las células tratadas. Esto da como resultado dos poblaciones celulares distintas: células ricas en glucógeno tratadas con enzimas y células ricas en glucógeno no tratadas con amilasa.
Cúbralos con una solución de ácido peryódico que convierte oxidativamente los grupos hidroxilo de las moléculas de glucógeno en aldehídos.
Enjuague el portaobjetos con agua para detener la reacción de oxidación y eliminar el exceso de ácido periódico. Tratar el portaobjetos con el reactivo Schiff, que reacciona con los grupos aldehídos del glucógeno tratado con ácido peryódico, generando un complejo insoluble de color magenta.
Aplique medios de montaje para restringir las células durante la obtención de imágenes. Coloque un cubreobjetos para esparcir el medio de montaje por toda la superficie del portaobjetos para una mejor visualización. Imagen de las células teñidas.
Las células no tratadas con amilasa contienen gránulos de glucógeno magenta, ausentes en las células tratadas con enzimas.
En este paso, coloque el portaobjetos sobre una superficie plana. Aplique 2 mililitros de solución de ácido peryódico sobre la muestra e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, enjuague el portaobjetos varias veces con agua destilada. Aplique 2 mililitros de reactivo de Schiff en el portaobjetos e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Posteriormente, lave el portaobjetos con agua destilada durante 5 minutos y luego déjelo secar al aire. A continuación, aplique 100 microlitros de medios de montaje en el portaobjetos y cúbralo con un cubreobjetos grande, o aplique 50 microlitros y use dos cubreobjetos pequeños. Después de eso, aplique esmalte de uñas transparente en los bordes del cubreobjetos. Déjalos secar durante la noche.
Luego, obtenga imágenes con el microscopio de luz binocular utilizando el objetivo 100X.