Electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio para el análisis de proteínas: una técnica para separar y visualizar proteínas basada en el peso molecular

Comience tratando la muestra de proteína con un tampón desnaturalizante que comprende un detergente: dodecil sulfato de sodio, SDS y un agente reductor: beta-mercaptoetanol. Caliéntalo brevemente. Durante este paso, el beta-mercaptoetanol interrumpe los enlaces disulfuro, lo que genera una conformación desplegada en la proteína.

Las proteínas desplegadas con sus aminoácidos hidrófobos expuestos se unen a la SDS cargada negativamente y adquieren una carga negativa uniforme. Agregue un tinte de seguimiento adecuado a la muestra para una visualización en tiempo real.

Ahora, cargue la muestra y el marcador de tamaño molecular estándar en pocillos separados presentes en el gel de apilamiento, la capa superior del gel de poliacrilamida que contiene una menor concentración de polímeros de acrilamida reticulados.

Conecte el aparato de gel lleno de tampón a la fuente de alimentación.

En presencia de un campo eléctrico, las proteínas cargadas negativamente migran libremente hacia el ánodo y se apilan para ingresar al gel de resolución, la capa inferior que contiene un gel de mayor concentración.

En el gel de resolución, las proteínas comienzan a migrar según su tamaño molecular, y las proteínas más pequeñas migran rápidamente, lo que da como resultado bandas de proteínas resueltas de manera óptima. A continuación, detenga la carrera y retire el gel.

Tiñe el gel con un tinte aniónico, azul de Coomassie, que se une electrostáticamente a los aminoácidos básicos de las proteínas, impartiéndoles coloración azul. A partir de entonces, detenga el gel en una solución de ácido acético para una mejor visualización.

Retire el gel e identifique las proteínas separadas en función de sus pesos moleculares estimados.

Prepare dos geles separadores como se describe en el manuscrito del texto. Vierta el gel entre las placas de vidrio con una pipeta de 1 mililitro, asegurándose de que los 2 centímetros superiores estén libres de la mezcla. Agregue etanol al 70% sobre el gel separador, creando una interfaz uniforme entre las dos capas.

Una vez que los geles separadores se hayan polimerizado, prepare los geles de apilamiento siguiendo las instrucciones del manuscrito de texto. Luego, retire el etanol de los geles separadores y agregue la solución de gel apilable. Inserte con cuidado un peine con el número deseado de bolsillos, sin introducir burbujas de aire, y deje que el gel polimerice durante 20 a 30 minutos.

Cargue 4 microlitros de cada muestra, así como la escalera de proteínas, en pocillos separados. Luego, ejecute el gel en tampón de funcionamiento Tris-Glycine a 144 voltios durante 45 minutos a temperatura ambiente. Use la solución Fairbanks A precalentada para teñir los geles en un balancín durante 30 minutos y la solución Fairbanks D precalentada para decolorar los geles en un balancín hasta lograr el fondo deseado.