Imágenes in vivo de dos fotones de la dinámica microglial en el hipocampo del ratón

Tomemos un ratón transgénico anestesiado que expresa proteínas fluorescentes en la microglía. Asegúrelo en un marco estereotáxico con una platina motorizada bajo un microscopio de dos fotones.

El cráneo está equipado con un tubo de metal con fondo de vidrio que aplana suavemente el alveo por encima de la región córnea amonis 1 o CA1 del hipocampo, lo que garantiza una interfaz óptica clara sin

una presión excesiva sobre el tejido subyacente.

Llene el tubo de metal con agua para optimizar la transmisión óptica.

Active el láser pulsado en la longitud de onda de excitación.

Usando la fluorescencia del parénquima cerebral y la luz reflejada del tubo de metal, ajuste el enfoque en la región CA1.

Vuelva a colocar la cabeza del mouse para alinear la parte inferior del vidrio paralela al plano de la imagen, lo que garantiza un enfoque uniforme en todo el campo de visión.

Ajuste el objetivo para una resolución óptima y observe la dinámica microglial in vivo en la región CA1.

A continuación, obtenga una imagen de la circunvolución dentada, donde la microglía fluorescente confirma la integridad de CA1.

Coloque el mouse en el dispositivo de sujeción de la cabeza debajo de la lente del objetivo del microscopio de dos fotones y en la platina de escaneo XY motorizada. A continuación, rellene el espacio entre el fondo de cristal y la lente del objetivo con agua sin crear burbujas de aire. Ajuste el enfoque, a CA1 con la guía de la fluorescencia emitida por el parénquima cerebral y la luz reflejada desde el borde del tubo de metal, bajo iluminación continua por el láser pulsado.

Ajuste el ángulo de la cabeza del ratón inclinando el dispositivo de sujeción de la cabeza para que la parte inferior del cristal quede paralela al plano de la imagen. Luego, ajuste el collar de corrección del objetivo para lograr la resolución más alta a una profundidad de la estructura objetivo en el CA1. A continuación, confirme que las células fluorescentes en la capa molecular de la circunvolución dentada, o DG, a una profundidad de 500 micrómetros desde el fondo del vidrio, se visualizan en todo el campo de visión. Solo en caso de una cirugía exitosa, las señales DG se pueden detectar de inmediato.

Asegurarse de que la microglía haya recuperado su morfología ramificada. A continuación, realice imágenes in vivo en la capa de interés en el CA1.