Generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto Multititre

L'obiettivo generale del seguente esperimento è differenziare cellule staminali pluripotenti umane, o H PSCs, in neuroni utilizzando un formato a piastre con pozzetti multipli. Questo viene ottenuto raccogliendo e seminando una sospensione monocellulare di H PSCs in piastre a 96 pozzetti con fondo a V per formare corpi embrionali, o EBS, durante la notte.

Successivamente, gli EBS vengono trasferiti in piastre ultra-low ad attacco a forma di U contenenti mezzo di differenziamento per indurre la formazione del neuroectoderma. In seguito, gli EBS vengono seminati in piatti rivestiti con matrigel per favorire l'espansione dei neuroni. I risultati possono essere ottenuti intorno al giorno otto e mostrano la presenza di marcatori neuronali tipici mediante immunofluorescenza.

I protocolli di colorazione per differenziare cellule staminali umane pluripotenti in neuroni sono spesso complicati e laboriosi. In modo del tutto accidentale, abbiamo scoperto un procedimento molto semplice per ottenere neuroni da cellule staminali umane pluripotenti.

Da un punto di vista tecnico, il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che è semplice da eseguire, rapida ed economicamente efficiente. Allo stesso tempo, la procedura sarà presentata dal dott. MI Z del laboratorio. Preparare il mezzo per la formazione di EB e il mezzo di differenziamento come indicato nel protocollo scritto.

Coltivare le hPSC in condizioni libere da feeder, ad esempio in un mezzo condizionato con met, su piastre rivestite con matrigel, oppure utilizzando sistemi di coltura chimicamente definiti, in condizioni di crescita attiva e subconfluenti. Utilizzando un microscopio stereoscopico e la punta sterile di una pipetta di plastica, rimuovere meccanicamente le colonie che si sono differenziate spontaneamente. Lavare le colonie indifferenziate rimanenti con PBS ed utilizzare Accutase contenente un x inibitore ROCK per la digestione in cellule singole.

Centrifugare le cellule singole a 200 G per due minuti e risospendere in un piccolo volume di mezzo di formazione degli EB. Utilizzare un emocitometro per determinare il titolo cellulare. Aggiungere ulteriori cellule al mezzo di formazione degli EB rimanente fino a ottenere un titolo compreso tra 40.000 e 80.000 cellule per millilitro.

Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri per pozzetto in una piastra a fondo V da 96 pozzetti, ottenendo da 4.000 a 8.000 cellule per pozzetto. Centrifugare la piastra in una centrifuga con rotor a braccio oscillante a 400 ×g per un minuto per raccogliere tutte le cellule sul fondo dei pozzetti. Trasferire le cellule in un incubatore e lasciare formare gli EBS durante la notte; il giorno successivo osservare al microscopio stereoscopico.

Raccogliere l'EBS e trasferirlo in un piccolo volume in una piastra batterica da 3,5 centimetri contenente due millilitri di mezzo di differenziamento. Lavare le cellule ruotando delicatamente la piastra. Aggiungere 100 microlitri di mezzo di differenziamento in ogni pozzetto di una piastra a bassa adesione.

Piastra da 96 pozzetti inferiore sotto un microscopio stereoscopico. Trasferire l'EBS in piccoli volumi dalla capsula di lavaggio nei pozzetti U da 96. Incubare l'EBS per quattro giorni per consentire la formazione del neuroectoderma al quarto giorno.

Lavare le cellule nel mezzo di differenziazione e seminarle singolarmente nei pozzetti di una piastra multiwell rivestita con matrigel, ad esempio una piastra a 12 pozzetti. Le cellule devono essere distribuite in modo uniforme all'interno dei pozzetti per consentire una crescita indisturbata dei neuroni. Lasciare che gli EBS si attacchino debolmente al matrigel per circa 10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi trasferire con attenzione la piastra nell'incubatore. Nei prossimi quattro giorni, i neuroni cresceranno radialmente a partire dagli EBS seminati. In precedenza abbiamo dimostrato che, in accordo con molti altri studi, gli EBS derivati da H PSCs possono essere generati semplicemente ripiastrendo gli aggregati ottenuti durante la suddivisione abituale degli H HPCs in piastre a bassa adesività.

Questo di solito porta a una vasta distribuzione delle dimensioni cellulari. Un altro problema è che gli EBS mantenuti in sospensione tendono ad aggregarsi tra loro, causando un'eterogeneità dimensionale ancora maggiore. Per evitare questo, singole cellule staminali pluripotenti umane sono state seminate in pozzetti a basso attaccamento, ma ciò ha comportato l'assenza di formazione di EBS e la morte cellulare. Tuttavia, combinando la molecola che favorisce la sopravvivenza cellulare, Y 2 7 6 3 2, con alcool polivinilico, che è stato dimostrato migliorare la formazione di EBS da cellule staminali ematopoietiche, è stato possibile ottenere la formazione di EBS da sospensioni di singole cellule staminali embrionali umane in una sola notte.

Convenientemente, le dimensioni degli EB in questo formato di piastra multi-titer potevano essere strettamente controllate seminando un numero diverso di cellule per pozzetto. A differenza delle tecniche convenzionali, dopo il trasferimento degli EB in piastre 96 U con attacco ultra-basso, la formazione del neuroectoderma è stata indotta mediante un cocktail di molecole di piccole dimensioni costituito dagli inibitori F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA due e BP SMA uno, permettendo così alle cellule di essere seminate su matrigel per dare origine a neuroni. L'avvio della formazione degli EB a partire da circa 8.000 cellule ha prodotto la migliore capacità di differenziazione neuronale, caratterizzata da evidenti prolungamenti neuronali provenienti dagli EB seminati.

Centri necrotici ridotti negli EB dopo la semina e alta espressione di marcatori sensoriali e pan-neuronali come B rrn tre A e beta tre tubulina. Le efficienze complessive di differenziazione neuronale sembrano essere paragonabili alla procedura originale, applicabile finora sia a HSC che a iPSC umane. Tre linee indipendenti di cellule staminali pluripotenti umane, inclusi embrioni staminali umani (HES) e cellule iPSC, sono state testate con successo nella procedura in pozzetti multipli, anche se in generale non si può escludere una variabilità dipendente dalla linea cellulare e dalle efficienze di differenziazione.

Questa figura mostra cellule neuroectodermiche singole dissociate del giorno quattro, piastrate come cellule singole e differenziate con successo con un'efficienza di circa il 60%. La manipolazione degli EBS nella piattaforma multipozzetto richiede un po' di allenamento all'inizio, ma dopo qualche tempo si rivelerà piuttosto semplice.