Name: Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Scopri l'imaging time-lapse di cellule epiteliali mammarie preneoplastiche primarie da modelli murini geneticamente modificati. Questo metodo consente di analizzare il comportamento cellulare in tempo reale e identificare correlazioni tra lesioni genetiche specifiche e dinamiche cellulari distinte.

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Gli autori desiderano ringraziare Bofan Wu e Christian Raithel per l&#39;assistenza tecnica e Michael Rieger per la sua introduzione al live-cell imaging. Supportato da NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 rif. 316 (REN), Dipartimento della Difesa W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) programma attraverso la Fondazione per la Ricerca Nazionale della Corea finanziato dal Ministero dell&#39;Istruzione, della Scienza e della Tecnologia (R31-10069) (PAF ), NIH RR025828 IG20-01 (Barriera Attrezzature Roditore Fondo), e NCI NIH 5P30CA051008 (Microscopia e Imaging Risorse e degli animali condivise).

<html> 1. Schema generale <ol><li> Generazione di colture primarie di cellule epiteliali mammarie preneoplastiche da ghiandole mammarie di ingegneria genetica e controllo topi wild-type. </li><li> Cattura immagini dal vivo di cellule ogni 15 min con un&#39;immagine software Volocity di acquisizione (versione 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) per un massimo di 5 giorni. </li><li> Vista time-lapse immagini direttamente per valutare i tempi e meccanismo di formazione delle cellule epiteliali colonie, l&#39;incidenza di apoptosi, e la graduale di cambiamenti morfologici. </li><li> Convertire Volocity generato. Pile TIFF a. File JPG utilizzando Automation Microscopia MetaMorph &amp; Analysis Software immagini (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) e rinominare i file di immagini digitali (la ridenominazione 2.1.6, <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get / Sistema / Gestione di file / THE-Rename.shtml</a> ) per garantire la compatibilità con il software di monitoraggio strumento Timm (TTT,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html). </li><li> Utilizzando TTT, generare mappe cellulari destino per la determinazione del tempo che intercorre tra divisioni cellulari (vite cellulari) e dei modelli di divisione cellulare (simmetrica rispetto asimmetrica). </li><li> Analizzare i dati quantitativi di passaggi 3 e 5 di cui sopra per determinare se ci sono differenze statisticamente significative tra i diversi modelli di topi geneticamente modificati e / o di tipo selvatico controlli. </li></ol> 2. Generazione di colture primarie di cellule epiteliali mammarie <ol><li> Preparare supporti completi per l&#39;isolamento di singole cellule epiteliali mammarie a seguito di una variazione di istruzioni del produttore (EpiCult-B mouse Media Kit, Stemcell Technologies, Vancouver, BC). Combinare 450 ml Epi-Cult-B media, 50 ml Epi-Cult B integratore proliferazione, 5% siero fetale bovino (FBS), 50 ug / ml di penicillina / streptomicina (PenStrep) e 10 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF). </li><li> Preparare dissociazione supporti combinando 1 parte di un 10x Collagenasi / Ialuronidasi miscela con 9 parti multimediali complete da 2.1. </li><li> Eutanasia mouse e procedere immediatamente a necroscopia. Posizionare il mouse sul dorso su una piattaforma necroscopia polistirolo e fissare tutti e quattro gli arti così la pelle ventrale è tesa. Saturare pelle ventrale e capelli, compresa quella sovrastante gli arti, con il 70% di etanolo. Esporre # 2/3 (toracica) e # 4/5 (inguinale) ghiandole mammarie facendo una incisione mediana attraverso la pelle (non inserire il peritoneo), che si estende in un Y-incisione attraverso la pelle mediale di ciascun arto anteriore e rovesciata incisione a Y attraverso la cute mediale di ogni arto posteriore. </li><li> Utilizzando smussa, separare la pelle dal underlyingperitoneum, tirare indietro su entrambi i lati della pelle fino a quando non è teso, e fissarlo alla piattaforma necroscopia polistirolo con perni. Partendo dal lato esterno, utilizzare smussa con uso giudizioso di Disseforbici ction per isolare il inguinale intatto e / o toracici ghiandole mammarie dal sottostante tessuto connettivo e muscolare. Inserire non più di due ghiandole mammarie in un 10 cm piastra di Petri sterile e passare alla cappa di coltura tissutale. </li><li> Nella cappa di coltura, per esaminare le ghiandole linfonodi mammari che sono identificati come piccole, ben circoscritti noduli con un colore giallastro. Rimuovere linfonodi dalla ghiandola circostante con bisturi sterile e pinzette. Tritare tessuto mammario in ~ 1 mm 3 cubi con due bisturi sterili, uno in ogni mano. </li><li> Posto tritata tessuto mammario in 5 ml di dissociazione Media, mescolare delicatamente pipettando su e giù 2-3 volte usando una pipetta 10 ml, ed incubare una notte (fino a ~ 16 ore) in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 in un provetta da 50 ml con tappo allentato. </li><li> La mattina dopo, preparare una miscela fredda di soluzione salina bilanciata di Hanks 1 parte &#39;(HBSS) contenente 2% di FBS e 4 parti tamponata di cloruro di ammonio soluzione per promuovere rosso bllisi cellulare ood (HFAmCl) nonché HBSS freddo addizionato con 2% FBS (HF). Pre-riscaldare Tripsina-EDTA (0,25%), 5 mg / ml in dispasi soluzione salina bilanciata di Hank Modified, 1 mg / ml DNasi I, e mezzi completi. </li><li> Rimuovere il tubo conico da centrifuga con il tessuto mammario dal termostato e delicatamente impulsi vortice 2-3 sec due volte. Centrifugare la provetta a 450 g per 5 min (temperatura ambiente oa 4 ° C), ed eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in un minimo di 10 HFAmCl ml e centrifugare a 450 g per 5 min (temperatura ambiente oa 4 ° C) ed eliminare il surnatante. </li><li> Aggiungere 3 ml di Tripsina-EDTA al pellet e mescolare prima con una pipetta da 5 ml e poi con una micropipetta P1000 fino filamentoso (1-3 min). Aggiungere 10 ml di HF, centrifugare a 450 g per 5 min (temperatura ambiente oa 4 ° C) ed eliminare il surnatante. </li><li> Aggiungere 2 ml di 5 mg / ml dispasi e 200 microlitri di 1 mg / ml DNasi I pellet e mescolare con una micropipetta P1000 per 1 min. Campione deve essere cloudy ma non filante. Se filante, aggiungere 100 ml di DNasi I e mescolare ancora. </li><li> Aggiungere 10 ml fredda HF, filtrare con un colino cella 40 um e centrifugare a 450 g per 5 min (temperatura ambiente oa 4 ° C) ed eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet finale in Media completi. Quantificare il numero totale di cellule (utilizzando un emocitometro o Coulter Counter). Due ghiandole mammarie ottenere approssimativamente 1 x 10 6 a 1 x 10 7 cellule. Piastra cellule primarie epiteliali in un fondo piatto piastra da 6 pozzetti ad una densità di 1,5 x 10 5 cellule per pozzetto. </li></ol> 3. Live-cell imaging <ol><li> Subito dopo placcatura cellule, posizionare il piastra da 6 pozzetti sicuro su un palco microscopio di un 5% di CO 2 / saturo humidity/37 ° C Temperatura della camera di incubazione. Regolare il condensatore per l&#39;illuminazione Kohler e il centro degli anelli di fase. Per gli esperimenti qui presentati, una rovesciata Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Spinning Disc Confocalsistema di microscopia in contrasto di fase widefield modalità con una lente obiettivo 10x è stato utilizzato. </li><li> Aprire il software di acquisizione delle immagini, creare e denominare una biblioteca per i time-lapse immagini, e salvare in una posizione con spazio sufficiente per i file di grandi dimensioni. Gli esperimenti qui presentati utilizzato un&#39;immagine software Volocity di acquisizione (versione 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA). </li><li> Consentire alla piastra di equilibrare nel microscopio incubatore per almeno 15 min. Abbassare le lenti per evitare la fase-obiettivo interferenze. Sotto il titolo &quot;Stage&quot;, selezionare &quot;Calibrare Stage&quot;. Riacquisire il piano focale, insieme Z = zero ai punti di imaging x, y, z scheda e segnare selezionando &quot;Aggiungi punto&quot; nella sezione &quot;Stage&quot; voce. Inserire punti al centro di ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti per l&#39;imaging come l&#39;imaging a contrasto di fase possono essere distorte vicino alla periferia di pozzi di plastica. Disporre i punti in una piazza in 4 x 4 campi (650 micron x 700 micron campi), ciascuno con una sovrapposizione di piccole dimensioni (circa il 5%). Salvare i punti selezionati in &quot;Stage. &quot; </li><li> In &quot;Stage&quot; selezionare &quot;Crea mappa focus&quot; e seguire le istruzioni per impostare la messa a fuoco di ogni punto. Impostare tempi di acquisizione dell&#39;immagine e catturarne 4 immagini all&#39;ora (ogni 15 min). Questo può essere regolato a seconda delle esigenze del test specifico. Salvare la mappa di messa a fuoco in &quot;Stage&quot;. </li><li> Fare clic destro sulla destra &quot;Acquisizione di immagini di&quot; strumento bar a bordo e salvare le impostazioni di imaging. Premere il pulsante di registrazione per iniziare l&#39;imaging. Dopo 1 ora, controllare la messa a fuoco delle immagini per vedere se è necessaria una regolazione. </li><li> Monitorare e continuare l&#39;imaging dal vivo per 5 giorni, che termina quando le cellule diventano confluenti. </li></ol> 4. Visualizzazione diretta di time-lapse immagini per valutare i tempi e Meccanismo di Formazione Iniziale epiteliale Colony cellulare, Incidenza di apoptosi, e fase di cambiamenti morfologici <ol><li> Visione diretta del time-lapse immagini possono essere effettuare compatibile con qualsiasi software di visualizzazione video (ad esempio <a href="http://www.real.com/" target="_blank">http:</a>/ / Www.real.com/ realplayer o altri software freeware o disponibile in commercio). Le immagini possono essere visualizzate in formato. TIFF in questo passaggio o dopo la conversione in file JPG. (Vedere il punto 5). </li><li> Per determinare meccanismo di formazione della colonia iniziale, inizia con una immagine singola pila rappresenta un sito di imaging sulla piastra. In frames iniziali, le cellule saranno galleggiante. Seguire immagini seriali per determinare quando la prima cellula epiteliale aderisce alla piastra. In questa fase, le cellule epiteliali possono essere identificati e differenziati da fibroblasti di loro morfologia più cuboidale. Segui questa singola cellula epiteliale attraverso immagini seriali e seguire il suo destino nei successivi 24 ore. Registrare se diventa circondata da altre cellule epiteliali o subisce divisione cellulare o apoptosi. Se circondata da cellule epiteliali, il meccanismo di formazione di colonie può essere determinata direttamente visualizzando se le cellule circostanti sono derivati ​​da cellule galleggianti che poi aggregato con la cellula iniziale aderente (s) odalla divisione della cellula iniziale aderente. Registrare il numero di colonie formate da aggregazione cellulare rispetto divisione cellulare durante le prime 24 ore. </li><li> Per determinare il numero di cellule aderenti inizialmente che subiscono apoptosi in un periodo di tempo specifico, seguite immagini seriali per la comparsa di caratteristiche classiche di sviluppo apoptosi in una cellula che è stata aderente ( <a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a> ), e il numero di cellule apoptotiche identificati durante l&#39;intera durata del imaging o in tempi specifici registrata. </li><li> Nel corso del tempo, le cellule epiteliali in coltura alterare la loro morfologia da una forma iniziale cuboidali ad un aspetto più allungato coerente con EMT. Segui le immagini seriali per determinare il giorno / ora dopo placcatura quando ciò si verifica. </li></ol> 5. Image File Modifica <ol><li&gt; Tramite il software Volocity, esportare i file di immagine TIFF a pile. Qui Automation Microscopia MetaMorph &amp; Analysis Software immagini (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) è stato utilizzato per aprire i file TIFF di stack e sono stati poi salvati in MetaMorph come immagini JPG singole.. </li><li> Rinominare le cartelle di immagini e file in base ai requisiti per il software Tracking Tool Timm Utilizzare un programma freeware come il 2.1.6 Rinomina ( <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml</a> ) per rinominare i file in gruppi. Creare una cartella contenente tutte le cartelle ei file della sperimentazione e il nome della cartella (ad esempio, </em&gt; EXPERIMENTNAME). </li><li> Creare una sottocartella per ogni punto / posizione in cui è stato ripreso la cultura. Denominare le sottocartelle: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Il numero di posizione dovrebbe avere 3 cifre. Esempio: 072511RN_p001. Mettere tutti i file di immagine di tale posizione individuale nella sottocartella. </li><li> Aggiungere il timepoint (utilizzando 5 cifre) e numero di canale (poiché vi è un solo canale in campo chiaro, utilizzare &quot;0&quot;) alla fine di ogni nome di file in questo formato: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg </li><li> Generare un file di log per ogni posizione per prima cosa scaricare il programma gratuito TTTlogfileconverter dal sito TTT. Avviare il programma TTTlogfileconverter e selezionare la cartella esperimento. Un intervallo di ingresso dell&#39;immagine (in secondi). Per una foto scattata ogni 15 minuti, immettere 900 sec. Quindi, premere il pulsante verde segreto dei file di log. </li></ol> 6. Generazione di Mappe Cellulari destino delle cellule singole Utilizzo TTT <ol><li> CReate una cartella chiamata TTTexport e una sottocartella denominata TTTfiles in cui tutti i dati delle celle di tracciamento saranno conservati secondo le istruzioni del software TTT </li><li> Avviare il programma di TTT, selezionare iniziali dell&#39;utente e fare clic su &quot;Continua&quot;. </li><li> Premere il tasto &quot;Set NAS&quot;, selezionare l&#39;utente creato cartella &quot;TTTexport&quot;, e fare clic su Ok. Nel browser, selezionare una cartella di esperimento, selezionare una cartella di posizione, quindi premere &quot;posizione Carica&quot; ​​pulsante. </li><li> Impostare il fattore oculare di &quot;10x&quot;. Caricare il numero di immagini richieste (carico tutte le immagini è raccomandato per la prima volta). </li><li> Nella finestra della cella editor, selezionare &quot;Nuova colonia&quot; nel menu File. Nella finestra del filmato, premere il tasto &quot;cella Track&quot; o F2 per iniziare a tracciare una cella. </li><li> Identificare una cella del MOvie finestra e uso del mouse per posizionare il cursore sulla cella. Un cerchio con il numero della cella dovrebbe apparire dopo F2 è stato fatto clic. Utilizzare il tasto &quot;0&quot; sul tastierino numerico della tastiera per monitorare il posizionamento della cella e passare alla foto successiva. Spostare il cursore per rispettare la posizione di ogni cella in ogni fotogramma. Per cancellare una traccia e tornare alla precedente immagine premere il tasto &quot;Canc&quot; del tastierino numerico. Per spostare i fotogrammi in avanti senza il tracciamento della stampa cella &quot;3&quot;, e per tornare indietro senza di monitoraggio premere il tasto &quot;1&quot; del tastierino numerico. </li><li> Per contrassegnare una divisione cellulare fare clic sul pulsante &quot;divisione&quot; nella finestra del filmato. Per celebrare la morte cellulare fare clic su &quot;morte cellulare&quot; nella finestra del filmato. Una volta che si è verificata una divisione, le cellule figlie possono essere monitorati nella stessa mappa destino della cellula facendo clic destro sul simbolo del cerchio della cellula figlia designato nella finestra dell&#39;editor cella per iniziare a monitorare automaticamente in modalità. </li><li> Premere F10 per salvare l&#39;albero. Ogni albero salverà nella piega di uscita designatoer (TTTExport). Per avviare una nuova mappa destino cellulare, selezionare &quot;Nuova colonia&quot; sotto &quot;File&quot; e poi dal menu &quot;Apri&quot; nella finestra dell&#39;editor cella. </li><li> Riportino in una tabella i dati di durata delle celle dopo aver raccolto da &quot;Cell dati&quot; scheda nella finestra dell&#39;editor cella. </li></ol> 7. Analisi statistiche <ol><li> Utilizzare Student t-test (se confrontare due genotipi) o ANOVA (se confrontando&gt; due genotipi) per determinare se le differenze nei dati parametrici come il numero di colonie di cellule iniziali, la durata delle cellule o ore fino alla comparsa di EMT tra diversi genotipi sono statisticamente significativa. Frequenza apoptotica può essere paragonato come il numero / numero totale di cellule placcati con Student t-test o ANOVA o con Mann-Whitney o Kruskal-Wallis quando derivato come percentuale di cellule aderenti. </li><li> Eseguire i test di potenza usando i dati da una analisi dei primi esperimenti per determinare il numero di repliche sperimentali devono svolgere e mappe destino cellulare generato da ciascun campione replicato per s adeguatopotenza tatistical utilizzando freeware disponibile (ad esempio <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a> ). Negli esperimenti qui presentati, colture di cellule derivate da tre topi per genotipo sono stati sufficienti a determinare se ci fossero differenze statisticamente significative nella formazione delle cellule delle colonie e la durata delle celle quando specifiche modificazioni genetiche sono state fatte. </li></ol>

<ol><li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li>
<li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li>
<li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+M+%22Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer%22">Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer</a>. Ip, M., Asch, B. , Kluwer Academic, Plenum Press. (2000).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li>
<li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li>
<li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+hematology%22%5BJournal%5D)">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li>
<li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li>
<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Passaggi critici È importante garantire che ghiandole mammarie sono raccolti da topi della stessa età per controllare legate all&#39;età variabilità mammaria comportamento delle cellule epiteliali. Quando le cellule placcatura, lo stesso numero di celle deve essere placcato in ogni pozzetto per ogni esperimento. Le cellule devono essere relativamente sparsa quando placcatura in modo che le culture non diventino confluenti troppo rapidamente rendendo possibile seguire più celle individuali attra...

Modelli di topi geneticamente ingegnerizzati sono strumenti per studiare e capire come diverse lesioni genetiche contribuiscono al rischio di sviluppare il cancro al seno. Ad esempio, i topi geneticamente modificati hanno dimostrato che la combinazione di tre fattori: perdita del full-length del cancro al seno 1, ad esordio precoce (BRCA1) gene in cellule epiteliali mammarie, proteina p53 tumore (TP53) della linea germinale haploinsufficiency, e delle ghiandole mammarie epiteliali cellula bersaglio up-regolata estrogeni recettore alfa (ERa) risultati di espressione nello sviluppo del cancro mammario nel 100% dei Brca1 floxed (f) Virus del tumore 11/f11/Mouse mammaria (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse transattivatore della tetraciclina (rtTA topi di 12 mesi di età rispetto alle percentuali più basse riportate in Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - topi senza ERa over-espressione (~ 50 - 60%) e BRCA1 topi f11/f11/MMTV-Cre senza TP53 haploinsufcienza (&lt;5%). 1 Dinamica time-lapse imaging del comportamento di preneoplastiche primarie cellule epiteliali mammarie rivela differenze nel comportamento cellulare che sono meno facilmente apprezzati in sezioni di tessuto statiche. Alterazioni nella proliferazione e la differenziazione sono stati osservati in cellule primarie mammarie dai vettori umani mutazione BRCA1. 2 Creazione di monocellulari sospensioni primarie di cellule epiteliali mammarie normali e di topi geneticamente ingegnerizzati sono generati attraverso la dissociazione enzimatica del tessuto ghiandolare mammario asportato. 3 Time-lapse le immagini vengono visualizzate per valutare meccanismi ed i tempi di comparsa delle cellule delle colonie e l&#39;incidenza di cambiamenti morfologici nelle cellule tra cui transizione epitelio-mesenchimale (EMT) e l&#39;apoptosi. Generazione di mappe destino cellulare, la quantificazione del periodo di tempo tra divisioni cellulari (cellule vite), e la determinazione di modelli di divisione cellulare è facilitata dall&#39;utilizzo di singola cellula inseguimento. TimmTracking Tool &#39;s (TTT) è un software disponibile pubblicamente usato per generare monocellulari mappe destino. La sua utilità nel chiarire i meccanismi di destino cellulare è stata stabilita 4,5 esaminando normale sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche 6-9 e la generazione di neuroni. 10

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> EpiCult-B mouse medio basale </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B proliferazione Integratori mouse </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td> ricombinante umana Epidermal Growth Factor (rhEGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi / ialuronidasi </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td> Scapels monouso </td><td> Piuma </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Salt Hanks &#39;soluzione equilibrata </td><td> StemCell Technologies </td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> Lammonium Chloride </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispasi </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 filtro cella pm </td><td> StemCell Technologies </td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging può essere usato per confrontare il comportamento di colture primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da diversi modelli murini geneticamente di cancro al seno. Ad esempio, il tempo tra le divisioni cellulari (vite cellulari), i numeri di cellulare per apoptosi, l&#39;evoluzione dei cambiamenti morfologici, e il meccanismo di formazione di colonie possono essere quantificati e confrontati in cellule che trasportano specifiche lesioni genetiche. Colture primarie di cellule epiteliali mammarie sono generati da ghiandole mammarie, senza tumore palpabile. Ghiandole sono accuratamente asportato con una chiara separazione dal muscolo adiacente, linfonodi vengono rimossi, e sospensioni monocellulari arricchite di cellule epiteliali mammarie sono generati sminuzzando tessuto mammario seguita da dissociazione enzimatica e filtrazione. Monocellulari sospensioni vengono piastrate e posti direttamente sotto un microscopio all&#39;interno di una camera incubatore per live-cell imaging. Sedici 650 micron x 700 micron campi in una configurazione 4x4 per ogni well di una piastra da 6 pozzetti vengono esposte ogni 15 min per 5 giorni. Time-lapse immagini vengono esaminati direttamente a misurare i comportamenti cellulari che possono includere meccanismi e la frequenza della formazione delle cellule colonia entro le prime 24 ore di placcatura cellule (aggregazione contro proliferazione cellulare), l&#39;incidenza di apoptosi, e la graduale eliminazione di cambiamenti morfologici. Singola cella di monitoraggio viene utilizzato per generare mappe di cellule destino per la misurazione della durata delle singole celle e le indagini dei modelli di divisione cellulare. I dati quantitativi sono analizzati statisticamente per valutare le differenze significative nel comportamento correlati con specifiche lesioni genetiche.

Cellule epiteliali e fibroblasti può essere distinto da morfologia cellulare. Cellule epiteliali hanno una forma cubica (Figura 1A-B) e formano colonie di cellule (Figura 1A). Fibroblasti, un tipo di cellule stromali, hanno una morfologia allungata (Figura 1C). Le cellule sono state arrotondate e galleggianti all&#39;insorgenza di imaging (Figura 2A-D). Dopo fissaggio alla piastra piatta e sono diventati dimostrato un aspett...

Time-lapse imaging viene utilizzato per valutare il comportamento di primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da modelli murini geneticamente modificati di rischio di cancro al seno per determinare se ci sono correlazioni tra i parametri specifici di comportamento e distinte lesioni genetiche.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare se le lesioni genetiche predisposte al cancro al seno alterano il comportamento delle cellule di memoria plastica pineale in coltura primaria. Ciò si ottiene isolando le cellule epiteliali mammarie primarie da topi geneticamente modificati. Come seconda fase, l'imaging time-lapse su cellule vive viene eseguito nell'arco di cinque-sette giorni, creando un filmato per analizzare il comportamento delle cellule.Quindi viene utilizzato un programma software che tiene traccia delle singole cellule per quantificare e confrontare il comportamento delle cellule isolate da diversi modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno. I risultati mostrano che specifiche lesioni genetiche inducono comportamenti diversi nella memoria pre neoplastica. Cellule epiteliali basate su analisi comportamentali quantitative eseguite utilizzando il tracciamento di singole cellule.Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni su come diverse lesioni genetiche alterano il comportamento delle cellule epiteliali mammarie mam preneoplastiche. Può anche essere applicato ad altri sistemi come il preneoplastico, le cellule di altri organi, le ce

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Fonte:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Istituto di Scienze Biologiche, Università di Brasilia, 2Dipartimento di Processi Psicologici di Base, Istituto di Psicologia, Università di BrasiliaQuesto video mostra la procedura per monitorare la progressione del tumore in vivo...

Imaging bioluminescente della progressione del tumore al seno in un modello murino femmina

Si descrive un metodo per l'imaging di risposta...

Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

Attivazione di mutazioni latenti con adenovirus-Cre nei risultati mammarie sistema duttale in un carcinoma mammario metastatico clinicamente rilevante. Incorporazione di un promotore YFP consente di tenere traccia di cellule tumorali metastatiche distali. Questo modello è utile per studiare metastasi latente, immunità anti-tumorale, e per la progettazione di nuove immunoterapie per trattare il cancro al seno.

Avvio del carcinoma metastatico della mammella dalla Targeting del duttale con Adenovirus-Cre: A Novel modello di topo transgenico di cancro al seno

Coltura cellulare primaria utilizzando organoidi tessuto intatto fornisce un sistema modello che simula il microambiente multi-cellulare in vivo. Abbiamo sviluppato un primo modello di coltura di tessuti epitelio mammario senza siero che perpetua linee di colture cellulari miste e mostre differenziati morfologia, senza interruzione del tessuto enzimatico. Organoidi seno rimangono vitali per&gt; 6 mesi.

Non enzimatica, siero-libero Tissue Culture delle lesioni mammarie pre-invasive per la generazione spontanea di mammospheres

Un modello di tumore primario del cancro al seno ortotopica e la rimozione chirurgica del tumore primario di estendere la vita del mouse per generare metastasi spontanee sono descritti. La crescita del tumore e la progressione sono monitorati e quantificati mediante imaging di fluorescenza luciferasi.

Un modello murino ortotopico di spontanea Breast Cancer metastasi

Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multiphoton effettuare prolungato time-lapse imaging di interazioni multicellulari in tempo reale, in vivo a risoluzione singola cellula.

Esteso Time-lapse Imaging intravitale del Real-time multicellulare Dynamics nel microambiente tumorale

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere un nuovo approccio di modellazione del cancro al seno basato sull'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime Cre nelle ghiandole mammarie dei topi. Questo approccio consente la manipolazione sia di tipo cellulare che di un organo degli eventi oncogeni in modo controllato temporaneamente.

Modellare il cancro al seno tramite un'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime la creminazione nella ghiandola mammaria del topo

In questo studio è stata esaminata l'attività fagocitica dei macrofagi contro le cellule tumorali, in particolare le cellule carcinoma mammario dei topi da 4T1. Il modello di cocoltura a cellule vive è stato stabilito e osservato utilizzando una combinazione di microscopia a contrasto di interferenza fluorescente e differenziale. Questa valutazione è stata immaginata utilizzando un software di imaging per sviluppare video time-lapse multipunto.

Time-Lapse 2D Imaging dell'attività fagocitica in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Questo protocollo descrive una nuova finestra di imaging mammario con un coperchio sostituibile (R.MIW). La microscopia intravitale dopo l'impianto del R.MIW consente l'imaging longitudinale e di più giorni della ghiandola mammaria sana e malata con una risoluzione cellulare durante le diverse fasi dello sviluppo.

Microscopia intravitale longitudinale utilizzando una finestra di imaging mammario con coperchio sostituibile

Il presente protocollo descrive una tecnica semplice per l'imaging intravitale della ghiandola mammaria del topo in allattamento mediante microscopia confocale e multifotonica a scansione laser.

Microscopia subcellulare intravitale della ghiandola mammaria

Il manoscritto descrive una metodologia per l'instaurazione e il monitoraggio longitudinale della crescita delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari iniettati ortotopicamente, suscettibili di intervento in tutte le fasi della cascata metastatica.

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Scopri l'imaging time-lapse di cellule epiteliali mammarie preneoplastiche primarie da modelli murini geneticamente modificati. Questo metodo consente di analizzare il comportamento cellulare in tempo reale e identificare correlazioni tra lesioni genetiche specifiche e dinamiche cellulari distinte.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno (Video) | JoVE Journal

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

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