Introducción a la microscopía de fluorescencia
La fluorescencia es un fenómeno que ocurre cuando una sustancia absorbe luz a una determinada longitud de onda y emite luz a otra longitud de onda. La fluorescencia se produce cuando un electrón, que ha sido excitado a un estado de energía más altos y más inestable, se relaja a su estado de tierra y emite un fotón de luz. La luz que se encarga de la excitación, o mover el electrón a un estado de mayor energía, es de menor longitud de onda y mayor energía que la emisión de fluorescencia, que tiene una longitud de onda más larga, menor energía y diverso color.
Microscopía de fluorescencia combina las propiedades de aumento del microscopio de luz con tecnología de fluorescencia que permite la excitación de- y la detección de las emisiones de fluoróforos - compuestos químicos fluorescentes. Con microscopía de fluorescencia, los científicos pueden observar la ubicación de tipos de células específicas dentro de tejidos o moléculas dentro de las células.
Los principales componentes del microscopio de fluorescencia se traslapan grandemente con el microscopio óptico tradicional. Sin embargo las 2 principales diferencias son el tipo de fuente de luz y el uso de los elementos filtrantes especializados.
Microscopía de fluorescencia requiere una fuente de luz muy potente como una lámpara de arco de xenón o mercurio como el que se muestra aquí. La luz emitida por la lámpara de arco de mercurio es de 10 - 100 veces más brillante que la mayoría de las lámparas incandescentes y proporciona una luz en una amplia gama de longitudes de onda del ultravioleta a los infrarrojos. Esta fuente de luz de alta potencia es la parte más peligrosa de la configuración del microscopio de fluorescencia como mirando directamente a la luz sin filtrar puede dañar sus retinas y mal manejo de los bulbos puede hacer que explote.
El fundamento de la microscopía de fluorescencia es simple. La luz sale de la lámpara de arco es dirigido a través de un filtro excitador, que selecciona la longitud de onda de excitación.
Esta luz es reflejada hacia la muestra por un espejo especial llamado un espejo dicroico, que está diseñado para reflejar la luz solamente en la longitud de onda de excitación. La luz reflejada pasa por el objetivo que se centra en la muestra fluorescente. Las emisiones de la muestra son a su vez, pasa hacia arriba a través del objetivo – donde se produce la ampliación de la imagen – y ahora a través del espejo dicroico.
Esta luz es filtrada por el filtro de la barrera, que selecciona la longitud de onda de emisión y filtra contaminantes luz de la lámpara de arco o de otras fuentes que se reflejan en los componentes del microscopio. Por último, la emisión fluorescente filtrada se envía a un detector, donde la imagen puede ser digitalizada, o se transmite en el ocular para la visión óptica.
El filtro excitador, espejo dicroico y filtro de barrera pueden ser reunidos en un componente conocido como el cubo de filtro. Cubos de filtro diferente pueden cambiar durante la muestra viendo para cambiar la longitud de onda de excitación, y una serie de connexión puede utilizarse para modificar la intensidad de la excitación.
Cuando se trata de realizar microscopía de fluorescencia, el fluoróforo puede ser tan importante como el microscopio de sí mismo, y el tipo de fluoróforo se va a examinar dicta la longitud de onda de excitación utilizado y la longitud de onda de emisión que se detecta. Las longitudes de onda de excitación contienen una pequeña gama de energías que puede ser absorbida por el fluoróforo y provocar su transición a un estado excitado. Una vez excitado, una amplia gama de emisiones, o las transiciones al estado inferior de energía, es posible dando por resultado un espectro de emisión.
La diferencia entre el pico de la absorción, o la curva de excitación y el pico de la curva de emisión se conoce como cambio de Stoke. Cuanto mayor sea la distancia en este cambio, más fácil es separar las dos longitudes de onda diferentes. Además, cualquier espectro superpuesto debe eliminarse por los componentes del cubo del filtro de fondo reducido y una calidad de imagen mejorada.
Exposición de fluoróforo excitación prolongada hará que se photobleach, que es un debilitamiento o pérdida de la fluorescencia. Para reducir el fotoblanqueo, puede Agregar un medio de montaje anti-fade a la diapositiva y sellar los bordes con esmalte de uñas. La diapositiva debe estar también en la oscuridad cuando no se va a examinar.
Para iniciar la proyección de imagen de fluorescencia, encienda la fuente de luz de xenón o mercurio y deje que se caliente durante 15 minutos a fin de alcanzar la iluminación constante.
A continuación, coloque la muestra en el escenario y asegúrelo en su lugar. Luego, encienda la fuente de luz blanca de su microscopio. Se centran en su muestra con el objetivo de menor potencia ajustando las perillas de enfoque grueso y fino. Continuación, utilice los botones de ajuste de fase para encontrar su área de interés.
A continuación, apague la fuente de luz blanca, así como todas las luces de sala innecesarios para reducir el fondo.
Selecciona el cubo de filtro adecuado para el tinte que es imagen y abra el obturador para iluminar la muestra.
Por último, hacer los ajustes de foco fino y dirigir la luz a la cámara de salida. Probable que necesite realizar ajustes en el tiempo de exposición para cada fluoróforo diferente o colorante fluorescente utilizado. Sin embargo, es importante mantener constante el tiempo de exposición al comparar las características con el mismo tinte en diferentes muestras.
Para colorantes múltiples en la misma muestra de la imagen, cambiar el cubo de filtro para coincidir con cada fluoróforo y grabar la nueva imagen.
Después de cada colorante en la muestra ha sido reflejada, imágenes individuales pueden ser overlaid y combinados.
Muchos tipos diferentes de experimentos pueden hacer uso de la microscopía fluorescente e implican a diferentes tipos de fluoróforos una de las aplicaciones más comunes de microscopia fluorescente es la proyección de imagen de proteínas que han sido marcados con anticuerpos que se unen o "conjugado" a compuestos fluorescentes... Aquí, un anticuerpo hacia proteínas superficiales leptoespiral fue detectado usando un anticuerpo secundario conjugado a alexafluor 488 que es verde cuando está excitado.
Otra forma de resaltar una característica específica con fluorescencia es integrar el código para una proteína fluorescente como la proteína verde fluorescente o GFP, en el ADN de un organismo. El gen de la GFP fue aislado originalmente de medusas y puede ser expresado o producido por cultivos de células en respuesta a desencadenantes específicos o como parte de un tipo de célula específica como el tumor de las células se muestra brillante en esta imagen
Otra aplicación de imágenes por fluorescencia es moteado de microscopía de fluorescencia que es una tecnología que utiliza fluorescencia etiquetada asambleas macromoleculares como la red de F-actina vistos aquí, al movimiento de estudio y cinética de la rotación de este importante proteínas citoesqueléticas.
Una técnica avanzada conocida como recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo o FRAP, se realiza por photobleaching intencionalmente una pequeña región de una muestra con el fin de controlar la tasa de difusión de moléculas fluorescente etiquetadas de nuevo en el photobleached región.
Sólo ha visto la introducción de Zeus para microscopía de fluorescencia.
En este video que aprendimos el concepto de fluorescencia, como microscopía de fluorescencia difiere de microscopía de luz y cómo tomar una imagen de fluorescencia a través del colonoscopio. También hemos aprendido sobre algunas aplicaciones básicas y avanzadas que usan la fluorescencia. Gracias por ver y no olvidar al fotoblanqueo se ve gran en los dientes no es tan bueno para sus muestras.
Microscopía de fluorescencia es una herramienta analítica muy poderosa que combina las propiedades de aumento de la microscopia ligera con la visualiz…
La fluorescencia es un fenómeno que ocurre cuando una sustancia absorbe luz a una determinada longitud de onda y emite luz a otra longitud de onda. La fluorescencia se produce cuando un electrón, que ha sido excitado a un estado de energía más altos y más inestable, se relaja a su estado de tierra y emite un fotón de luz. La luz que se encarga de la excitación, o mover el electrón a un estado de mayor energía, es de menor longitud de onda y mayor energía que la emisión de fluorescencia, que tiene una longitud de onda más larga, menor energía y diverso color.
Microscopía de fluorescencia combina las propiedades de aumento del microscopio de luz con tecnología de fluorescencia que permite la excitación de- y la detección de las emisiones de fluoróforos - compuestos químicos fluorescentes. Con microscopía de fluorescencia, los científicos pueden observar la ubicación de tipos de células específicas dentro de tejidos o moléculas dentro de las células.
Los principales componentes del microscopio de fluorescencia se traslapan grandemente con el microscopio óptico tradicional. Sin embargo las 2 principales diferencias son el tipo de fuente de luz y el uso de los elementos filtrantes especializados.
Microscopía de fluorescencia requiere una fuente de luz muy potente como una lámpara de arco de xenón o mercurio como el que se muestra aquí. La luz emitida por la lámpara de arco de mercurio es de 10 - 100 veces más brillante que la mayoría de las lámparas incandescentes y proporciona una luz en una amplia gama de longitudes de onda del ultravioleta a los infrarrojos. Esta fuente de luz de alta potencia es la parte más peligrosa de la configuración del microscopio de fluorescencia como mirando directamente a la luz sin filtrar puede dañar sus retinas y mal manejo de los bulbos puede hacer que explote.
El fundamento de la microscopía de fluorescencia es simple. La luz sale de la lámpara de arco es dirigido a través de un filtro excitador, que selecciona la longitud de onda de excitación.
Esta luz es reflejada hacia la muestra por un espejo especial llamado un espejo dicroico, que está diseñado para reflejar la luz solamente en la longitud de onda de excitación. La luz reflejada pasa por el objetivo que se centra en la muestra fluorescente. Las emisiones de la muestra son a su vez, pasa hacia arriba a través del objetivo – donde se produce la ampliación de la imagen – y ahora a través del espejo dicroico.
Esta luz es filtrada por el filtro de la barrera, que selecciona la longitud de onda de emisión y filtra contaminantes luz de la lámpara de arco o de otras fuentes que se reflejan en los componentes del microscopio. Por último, la emisión fluorescente filtrada se envía a un detector, donde la imagen puede ser digitalizada, o se transmite en el ocular para la visión óptica.
El filtro excitador, espejo dicroico y filtro de barrera pueden ser reunidos en un componente conocido como el cubo de filtro. Cubos de filtro diferente pueden cambiar durante la muestra viendo para cambiar la longitud de onda de excitación, y una serie de connexión puede utilizarse para modificar la intensidad de la excitación.
Cuando se trata de realizar microscopía de fluorescencia, el fluoróforo puede ser tan importante como el microscopio de sí mismo, y el tipo de fluoróforo se va a examinar dicta la longitud de onda de excitación utilizado y la longitud de onda de emisión que se detecta. Las longitudes de onda de excitación contienen una pequeña gama de energías que puede ser absorbida por el fluoróforo y provocar su transición a un estado excitado. Una vez excitado, una amplia gama de emisiones, o las transiciones al estado inferior de energía, es posible dando por resultado un espectro de emisión.
La diferencia entre el pico de la absorción, o la curva de excitación y el pico de la curva de emisión se conoce como cambio de Stoke. Cuanto mayor sea la distancia en este cambio, más fácil es separar las dos longitudes de onda diferentes. Además, cualquier espectro superpuesto debe eliminarse por los componentes del cubo del filtro de fondo reducido y una calidad de imagen mejorada.
Exposición de fluoróforo excitación prolongada hará que se photobleach, que es un debilitamiento o pérdida de la fluorescencia. Para reducir el fotoblanqueo, puede Agregar un medio de montaje anti-fade a la diapositiva y sellar los bordes con esmalte de uñas. La diapositiva debe estar también en la oscuridad cuando no se va a examinar.
Para iniciar la proyección de imagen de fluorescencia, encienda la fuente de luz de xenón o mercurio y deje que se caliente durante 15 minutos a fin de alcanzar la iluminación constante.
A continuación, coloque la muestra en el escenario y asegúrelo en su lugar. Luego, encienda la fuente de luz blanca de su microscopio. Se centran en su muestra con el objetivo de menor potencia ajustando las perillas de enfoque grueso y fino. Continuación, utilice los botones de ajuste de fase para encontrar su área de interés.
A continuación, apague la fuente de luz blanca, así como todas las luces de sala innecesarios para reducir el fondo.
Selecciona el cubo de filtro adecuado para el tinte que es imagen y abra el obturador para iluminar la muestra.
Por último, hacer los ajustes de foco fino y dirigir la luz a la cámara de salida. Probable que necesite realizar ajustes en el tiempo de exposición para cada fluoróforo diferente o colorante fluorescente utilizado. Sin embargo, es importante mantener constante el tiempo de exposición al comparar las características con el mismo tinte en diferentes muestras.
Para colorantes múltiples en la misma muestra de la imagen, cambiar el cubo de filtro para coincidir con cada fluoróforo y grabar la nueva imagen.
Después de cada colorante en la muestra ha sido reflejada, imágenes individuales pueden ser overlaid y combinados.
Muchos tipos diferentes de experimentos pueden hacer uso de la microscopía fluorescente e implican a diferentes tipos de fluoróforos una de las aplicaciones más comunes de microscopia fluorescente es la proyección de imagen de proteínas que han sido marcados con anticuerpos que se unen o "conjugado" a compuestos fluorescentes... Aquí, un anticuerpo hacia proteínas superficiales leptoespiral fue detectado usando un anticuerpo secundario conjugado a alexafluor 488 que es verde cuando está excitado.
Otra forma de resaltar una característica específica con fluorescencia es integrar el código para una proteína fluorescente como la proteína verde fluorescente o GFP, en el ADN de un organismo. El gen de la GFP fue aislado originalmente de medusas y puede ser expresado o producido por cultivos de células en respuesta a desencadenantes específicos o como parte de un tipo de célula específica como el tumor de las células se muestra brillante en esta imagen
Otra aplicación de imágenes por fluorescencia es moteado de microscopía de fluorescencia que es una tecnología que utiliza fluorescencia etiquetada asambleas macromoleculares como la red de F-actina vistos aquí, al movimiento de estudio y cinética de la rotación de este importante proteínas citoesqueléticas.
Una técnica avanzada conocida como recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo o FRAP, se realiza por photobleaching intencionalmente una pequeña región de una muestra con el fin de controlar la tasa de difusión de moléculas fluorescente etiquetadas de nuevo en el photobleached región.
Sólo ha visto la introducción de Zeus para microscopía de fluorescencia.
En este video que aprendimos el concepto de fluorescencia, como microscopía de fluorescencia difiere de microscopía de luz y cómo tomar una imagen de fluorescencia a través del colonoscopio. También hemos aprendido sobre algunas aplicaciones básicas y avanzadas que usan la fluorescencia. Gracias por ver y no olvidar al fotoblanqueo se ve gran en los dientes no es tan bueno para sus muestras.
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La fluorescencia es un fenómeno que ocurre cuando una sustancia absorbe luz a una determinada longitud de onda y emite luz a otra longitud de onda. La fluorescencia se produce cuando un electrón, que ha sido excitado a un estado de energía más altos y más inestable, se relaja a su estado de tierra y emite un fotón de luz. La luz que se encarga de la excitación, o mover el electrón a un estado de mayor energía, es de menor longitud de onda y mayor energía que la emisión de fluorescencia, que tiene una longitud de onda más larga, menor energía y diverso color.
Microscopía de fluorescencia combina las propiedades de aumento del microscopio de luz con tecnología de fluorescencia que permite la excitación de- y la detección de las emisiones de fluoróforos - compuestos químicos fluorescentes. Con microscopía de fluorescencia, los científicos pueden observar la ubicación de tipos de células específicas dentro de tejidos o moléculas dentro de las células.
Los principales componentes del microscopio de fluorescencia se traslapan grandemente con el microscopio óptico tradicional. Sin embargo las 2 principales diferencias son el tipo de fuente de luz y el uso de los elementos filtrantes especializados.
Microscopía de fluorescencia requiere una fuente de luz muy potente como una lámpara de arco de xenón o mercurio como el que se muestra aquí. La luz emitida por la lámpara de arco de mercurio es de 10 - 100 veces más brillante que la mayoría de las lámparas incandescentes y proporciona una luz en una amplia gama de longitudes de onda del ultravioleta a los infrarrojos. Esta fuente de luz de alta potencia es la parte más peligrosa de la configuración del microscopio de fluorescencia como mirando directamente a la luz sin filtrar puede dañar sus retinas y mal manejo de los bulbos puede hacer que explote.
El fundamento de la microscopía de fluorescencia es simple. La luz sale de la lámpara de arco es dirigido a través de un filtro excitador, que selecciona la longitud de onda de excitación.
Esta luz es reflejada hacia la muestra por un espejo especial llamado un espejo dicroico, que está diseñado para reflejar la luz solamente en la longitud de onda de excitación. La luz reflejada pasa por el objetivo que se centra en la muestra fluorescente. Las emisiones de la muestra son a su vez, pasa hacia arriba a través del objetivo – donde se produce la ampliación de la imagen – y ahora a través del espejo dicroico.
Esta luz es filtrada por el filtro de la barrera, que selecciona la longitud de onda de emisión y filtra contaminantes luz de la lámpara de arco o de otras fuentes que se reflejan en los componentes del microscopio. Por último, la emisión fluorescente filtrada se envía a un detector, donde la imagen puede ser digitalizada, o se transmite en el ocular para la visión óptica.
El filtro excitador, espejo dicroico y filtro de barrera pueden ser reunidos en un componente conocido como el cubo de filtro. Cubos de filtro diferente pueden cambiar durante la muestra viendo para cambiar la longitud de onda de excitación, y una serie de connexión puede utilizarse para modificar la intensidad de la excitación.
Cuando se trata de realizar microscopía de fluorescencia, el fluoróforo puede ser tan importante como el microscopio de sí mismo, y el tipo de fluoróforo se va a examinar dicta la longitud de onda de excitación utilizado y la longitud de onda de emisión que se detecta. Las longitudes de onda de excitación contienen una pequeña gama de energías que puede ser absorbida por el fluoróforo y provocar su transición a un estado excitado. Una vez excitado, una amplia gama de emisiones, o las transiciones al estado inferior de energía, es posible dando por resultado un espectro de emisión.
La diferencia entre el pico de la absorción, o la curva de excitación y el pico de la curva de emisión se conoce como cambio de Stoke. Cuanto mayor sea la distancia en este cambio, más fácil es separar las dos longitudes de onda diferentes. Además, cualquier espectro superpuesto debe eliminarse por los componentes del cubo del filtro de fondo reducido y una calidad de imagen mejorada.
Exposición de fluoróforo excitación prolongada hará que se photobleach, que es un debilitamiento o pérdida de la fluorescencia. Para reducir el fotoblanqueo, puede Agregar un medio de montaje anti-fade a la diapositiva y sellar los bordes con esmalte de uñas. La diapositiva debe estar también en la oscuridad cuando no se va a examinar.
Para iniciar la proyección de imagen de fluorescencia, encienda la fuente de luz de xenón o mercurio y deje que se caliente durante 15 minutos a fin de alcanzar la iluminación constante.
A continuación, coloque la muestra en el escenario y asegúrelo en su lugar. Luego, encienda la fuente de luz blanca de su microscopio. Se centran en su muestra con el objetivo de menor potencia ajustando las perillas de enfoque grueso y fino. Continuación, utilice los botones de ajuste de fase para encontrar su área de interés.
A continuación, apague la fuente de luz blanca, así como todas las luces de sala innecesarios para reducir el fondo.
Selecciona el cubo de filtro adecuado para el tinte que es imagen y abra el obturador para iluminar la muestra.
Por último, hacer los ajustes de foco fino y dirigir la luz a la cámara de salida. Probable que necesite realizar ajustes en el tiempo de exposición para cada fluoróforo diferente o colorante fluorescente utilizado. Sin embargo, es importante mantener constante el tiempo de exposición al comparar las características con el mismo tinte en diferentes muestras.
Para colorantes múltiples en la misma muestra de la imagen, cambiar el cubo de filtro para coincidir con cada fluoróforo y grabar la nueva imagen.
Después de cada colorante en la muestra ha sido reflejada, imágenes individuales pueden ser overlaid y combinados.
Muchos tipos diferentes de experimentos pueden hacer uso de la microscopía fluorescente e implican a diferentes tipos de fluoróforos una de las aplicaciones más comunes de microscopia fluorescente es la proyección de imagen de proteínas que han sido marcados con anticuerpos que se unen o "conjugado" a compuestos fluorescentes... Aquí, un anticuerpo hacia proteínas superficiales leptoespiral fue detectado usando un anticuerpo secundario conjugado a alexafluor 488 que es verde cuando está excitado.
Otra forma de resaltar una característica específica con fluorescencia es integrar el código para una proteína fluorescente como la proteína verde fluorescente o GFP, en el ADN de un organismo. El gen de la GFP fue aislado originalmente de medusas y puede ser expresado o producido por cultivos de células en respuesta a desencadenantes específicos o como parte de un tipo de célula específica como el tumor de las células se muestra brillante en esta imagen
Otra aplicación de imágenes por fluorescencia es moteado de microscopía de fluorescencia que es una tecnología que utiliza fluorescencia etiquetada asambleas macromoleculares como la red de F-actina vistos aquí, al movimiento de estudio y cinética de la rotación de este importante proteínas citoesqueléticas.
Una técnica avanzada conocida como recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo o FRAP, se realiza por photobleaching intencionalmente una pequeña región de una muestra con el fin de controlar la tasa de difusión de moléculas fluorescente etiquetadas de nuevo en el photobleached región.
Sólo ha visto la introducción de Zeus para microscopía de fluorescencia.
En este video que aprendimos el concepto de fluorescencia, como microscopía de fluorescencia difiere de microscopía de luz y cómo tomar una imagen de fluorescencia a través del colonoscopio. También hemos aprendido sobre algunas aplicaciones básicas y avanzadas que usan la fluorescencia. Gracias por ver y no olvidar al fotoblanqueo se ve gran en los dientes no es tan bueno para sus muestras.
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Q1: What is fluorescence and how does it occur at the molecular level?
Fluorescence occurs when a fluorophore absorbs light at a specific wavelength, exciting an electron to a higher energy state. As the electron relaxes back to its ground state, it emits a photon of light at a longer wavelength and lower energy than the absorbed light. This emission enables visualization of fluorescently labeled structures in microscopy applications.
Q2: How does fluorescence microscopy differ from light microscopy?
Fluorescence microscopy combines magnification with fluorescence detection, requiring specialized components beyond traditional light microscopy. Key differences include a powerful xenon or mercury arc lamp that is 10-100 times brighter than incandescent sources, specialized exciter and barrier filters, and a dichroic mirror to separate excitation and emission wavelengths. These additions enable detection of fluorescently labeled molecules within cells and tissues.
Q3: What is Stokes Shift and why does it matter in fluorescence microscopy?
Stokes Shift is the difference between the peak absorption wavelength and the peak emission wavelength of a fluorophore. A larger Stokes Shift makes it easier to separate excitation and emission wavelengths using filters, reducing background noise and improving image quality. This separation is critical for obtaining clear fluorescent images without contaminating light from the microscope components.
Q4: What causes photobleaching and how can you prevent it?
Photobleaching occurs when prolonged excitation weakens or eliminates a fluorophore's ability to fluoresce. To reduce photobleaching, add anti-fade mounting medium to slides and seal edges with nail polish. Additionally, keep slides in the dark when not being imaged to minimize unnecessary light exposure and preserve fluorescence intensity for accurate imaging.
Q5: What are the main components of a fluorescence microscope and their functions?
The exciter filter selects the excitation wavelength, the dichroic mirror reflects excitation light toward the sample while allowing emission light to pass through, and the barrier filter selects emission wavelength while blocking contaminating light. These three components can be assembled into a filter cube, which can be changed during imaging to accommodate different fluorophores and their specific wavelength requirements.
Q6: How do you prepare and image a fluorescence microscopy sample?
Allow the xenon or mercury light source to warm up for 15 minutes to reach constant illumination. Place the sample on the stage and focus using the lowest objective. Turn off room lights to reduce background, select the appropriate filter cube for your fluorophore, and open the shutter to illuminate the sample. Adjust exposure time as needed, keeping it constant when comparing samples with the same dye.
Q7: What are common methods for labeling samples in fluorescence microscopy?
Common labeling methods include conjugating fluorescent compounds to antibodies that target specific proteins, integrating fluorescent protein genes like GFP into organism DNA for expression in specific cell types, and labeling macromolecular assemblies such as the F-actin cytoskeletal network. Each method enables visualization of different cellular structures and molecular components for research and diagnostic applications.
Capítulos en este video
0:00
Introduction to Fluorescence Microscopy
1:19
Principles and Components of the Fluorescent Microscope
2:21
Basic Principles of Fluorescence Microscopy
5:25
Fluorescence Microscopy Imaging
6:59
Applications
8:45
Summary