Name: Lasermicrodissectie van neuronen van Gedifferentieerd Human Neuroprogenitor Cellen in Cultuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Leer lasermicrodissectie van neuronen uit gedifferentieerde humane neuroprogenitorcellen voor genexpressieanalyse. Deze methode isoleert zuivere neuronale populaties voor onderzoek naar neurale ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door Merit Beoordeling subsidie ​​(NEUD-004-07F) van de Veterans Administration (SP).

1. Uitbreiding van Human NPCs (figuur 1) <ol><li> Herleven de bevroren voorraad menselijk NPCs uit foetale hersenen (Lonza, Walkersville, MD, USA) en cultuur ze in suspensie in de T-75 kolven als neurosferen (figuur 1A) in Neurobasal medium dat proliferatie supplementen, EGF (10 ng / ml) en FGF (10 ng / ml). </li><li> Na 3 dagen kweken dragen de neurosferen een 15 ml buis en centrifugeer bij 500 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant met achterlating van ~ 100 ul medium boven de cel pellet en zetten in een Eppendorf buis. Een 100 pl celpellet voldoende te splitsen in 2 T-75 kolven. Indien minder, vermindering van het aantal flessen als neuroprogenitor cellen niet te woekeren als splitsen dun. </li><li> Vermaal de pellet met 200 ul tip 50x terwijl de 200 ul tip tegen de bodem van de buis. Verdeel de celsuspensie even in twee delen en voeg ze toe aan 2 T-75 kolven (1-2 split), een voor voortgezetexpansie en andere voor differentiatie. </li><li> Ga door met de cultuur van de neuroprogenitor cellen voor uitbreiding (eerste fles) door het veranderen van het medium om de 4-5 dagen tot de neurosferen bereiken hun oorspronkelijke formaat van 300-500 micrometer. Verander medium door centrifugeren (500 tpm, 5 min), gooi de oude medium en voeg nieuwe medium. </li></ol> 2. Differentiatie van Human NPCs in een Neuron-rijke cultuur (figuur 2) <ol><li> Voor differentiatie van neuroprogenitor cellen in een neuron rijke cultuur, plaats een enkel dekglaasje in elk putje van een 24-wells plaat en jas met 100 ug / ml van poly-L-lysine door het toevoegen van 500 pi in elk putje. Incubeer de gerechten voor 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig het poly-L-lysine-oplossing en spoel de plaat met steriel water. </li><li> Vervolgens vacht de putjes van de plaat met 500 ui 5 ug / ml muis laminine en incubeer gedurende 30 minuten. Na incubatie was de putjes met PBS. </li><li> 4 dagen na splitting van de cellen (stap 1.4), breng de kleine neurosferen in de kolf de vermelding &quot;For differentiatie &#39;in de gecoate gerechten in een dichtheid van ~ 500 neurosferen per putje van een 24-wells plaat. </li><li> Na 6 uur, als de neurosferen hechten aan de schaal, verwijdert de proliferatie medium en voeg differentiatiemedium bestaande uit Neurobasal medium, B27 supplement, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), en retinoïnezuur (2 uM). </li></ol> 3. Immunofluorescentiekleuring van gedifferentieerde NPCs (figuur 3) <ol><li> Na kweek van neuroprogenitor cellen in neuronale differentiatie medium voor twee weken, is een neuron-rijke cultuur verkregen. Spoel de neuronen keer in PBS en vervolgens oplossen in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten. Eenmaal vastgesteld, spoel de cellen driemaal met PBS. </li><li> Incubeer de cellen met permeabilisatie buffer (5% BSA en 0,2% Triton X-100 in PBS) bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten. </li><li> Incubeer de gerechten O / N bij 4 ° C ina shaker met de volgende combinatie van polyklonale en monoklonale antilichamen in 3% BSA in PBS: NeuN (1:250) en synapsin (1:250); acetyl cholinesterase (1:500) en synaptofysine (1:250); BDNF (1 : 500) en GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) en GFAP (1:1000). </li><li> Was de dekglaasjes driemaal met PBS en vervolgens geïncubeerd ze met anti-konijnen-Cy3 en anti-muis-FITC secundaire antilichamen bij kamertemperatuur in het donker gedurende 90 minuten. Na incubatie was de dekglaasjes driemaal met PBS. </li><li> Plaats 10 ul van montage medium op een glasplaatje, neem de dekglaasje van de cultuur schotel met een tang, en plaats het ondersteboven op de montage medium. Zachtjes, veeg de overtollige montage medium en sluit de randen met nagellak. </li><li> Onderzoek de immunostained neuronen in een fluorescentiemicroscoop. </li></ol> 4. Lasermicrodissectie van neuronen (figuur 4) <ol><li> Differentiëren NPCs in een neuron-rijke cultuur op PEN membraan dias bekleed met poly-L-lysine en muis laminine volgens de methode beschreven bij figuur 2 procedures. </li><li> Voer alle daaropvolgende stappen onder RNAse-vrije omstandigheden. </li><li> Vlekken op de culturen met behulp HistoGene Stain (Arcturus) om de cellen te visualiseren. </li><li> Zoek het gebied van pure neuronale populaties verstoken van astrocyten met behulp van de routekaart beeld van de volledige dia met de Veritas LCM systeem. Markeer de neuronen met behulp van de tekengereedschappen. </li><li> Voer laser capture van deze gebieden met computergestuurde precisie en automatisering in twee stappen. Eerste, IR (infrarood) wordt afgevuurd op meerdere plekken met een laservermogen instelling van 70 mW en een puls van 2500 usee om het membraan hechten aan de dop. Vervolgens wordt het gemarkeerde gebied uitgesneden met UV snijgereedschap op een laag niveau-instelling van 10 mV. </li><li> Combinatie van deze processen selectief vangt de gemarkeerde gebieden van het PEN membraan op CapSure LCM macro caps. Wanneer de kap wordt opgetild, de membraan met de neurons houdt zich aan de dop. </li><li> Isoleer totaal RNA van LCM monsters met behulp van een PicoPure RNA isolatie kit (Arcturus) en behandelen met DNase. </li><li> Versterken de geïsoleerde RNA met behulp RiboAMP RNA amplificatie kit volgens de instructies van de kit. </li><li> Voer Real time RT-PCR-analyse met TaqMan probes menselijk neurofilament zware keten (hNFHc) detecteren. </li></ol> Afkortingen: AD, ziekte van Alzheimer, BDNF, brain-derived neurotrophic factor, CREB, cyclisch AMP respons element bindend eiwit, DBC, dibutyryl cyclisch AMP, EGF, epidermale groeifactor, FGF, fibroblast groeifactor, GFAP, glia fibrillair zuur eiwit, LCM, laser vangen microdissection, NGF, Zenuwgroeifactor, NPC, neuroprogenitor cel, PEN, polyethyleennaftalaat.

<ol><li>Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+identity+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial identity of neural stem cells.</a> Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).</li>
<li>Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: an overview.</a> Circ. Res. 92, 598-608 (2003).</li>
<li>Kim, S. U., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+cell+therapy+in+neurological+diseases%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review.</a> J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).</li>
<li>Breier, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cells+as+models+for+high-throughput+screens+of+developmental+neurotoxicity%3A+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).</li>
<li>Christie, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+supplementation+of+differentiating+human+neural+progenitors+and+embryonic+stem+cells+leads+to+enhanced+neurogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro.</a> J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).</li>
<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li>
<li>Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuronal+gene+expression+with+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection.</a> J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).</li>
<li>Robles, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+gene+expression+profiling+in+spatial+discrimination+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning.</a> Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).</li>
<li>Su, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ethanol+versus+formalin+fixation+on+preservation+of+histology+and+RNA+in+laser+capture+microdissected+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues.</a> Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).</li>
<li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain%3A+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).</li>
<li>Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+CREB+expression+in+Alzheimer%27s+brain+and+in+Abeta-treated+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons.</a> Mol. Neurodegener. 6, 60(2011).</li>
<li>Dworkin, S., Mantamadiotis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CREB+signalling+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Ther.+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting CREB signalling in neurogenesis.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).</li>
<li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+perspectives+of+neural+stem+cell+differentiation%3A+from+neurotransmitters+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics.</a> Cytometry A. 75, 38-53 (2009).</li>
<li>Pugazhenthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Varicella-zoster+virus+infection+of+differentiated+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells.</a> J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).</li>
<li>Kamme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1%3A+demonstration+and+validation+of+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity.</a> J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten te verklaren.

Wij beschrijven in deze studie een neuron-rijke celcultuurmodel door differentiatie van zelf-vernieuwing neuroprogenitor menselijke cellen en een methode om een ​​zuivere populatie van neuronen isoleren laser capture microdissectie. We hebben een combinatie van NGF, BDNF, DBC en retinoïnezuur voor neuronale differentiatie van NPCs gebruikt. DBC wordt gebruikt om CREB een transcriptiefactor die neurogenese 12 verbetert activeren. Retinoïnezuur induceert celcyclus verlaten en vermindert de gliale bevolking <sup...

Permanente neurogenese is gekend om in subventriculaire zone van de laterale ventrikels en de subgranulaire laag van de dentate gyrus van de volwassen zoogdierhersenen 1. Neuroprogenitor cellen (NPC&#39;s) die afkomstig zijn uit deze regio&#39;s zijn multipotente cellen die kunnen differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten 2. NPCs hebben gegenereerd belang omdat zij kunnen worden getransplanteerd in patiënten met diverse neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, amyotrofische laterale sclerose, beroerte en ziekte (AD) 3 Alzheimer. Onderzoeken met NPC het algemeen gericht op deze transplantatie hoek maar de mogelijkheden van NPC-afgeleide neuronen als celcultuurmodel het mechanisme van neurodegeneratie bepalen niet volledig benut. Eerdere studies hebben algemeen gebruikt na mitotische neuronen geïsoleerd uit inproefdierhersenen weefsels die moeten worden geïsoleerd voor elk experiment zij nietzelfvernieuwende. Hoewel humane neuroblastoma cellijnen zoals SH-SY5Y en SK-N-MC cellen kunnen worden geëxpandeerd, hebben zij niet de kenmerken van primaire neuronen. Menselijke NPCs, anderzijds, hebben zowel voordelen omdat ze kunnen worden uitgebreid voor meerdere doorgangen en kunnen worden gedifferentieerd om een celpopulatie genereren met de kenmerken van primaire neuronen 4,5. In de huidige studie, een nieuwe differentiatie protocol beschrijven we een consistente neuron-rijke bevolking te verkrijgen uit commercieel beschikbare NPC&#39;s geïsoleerd uit menselijke foetale hersenen. Omdat deze kweken bevatten een klein percentage van gliacellen, zijn ook andere methoden om een ​​zuivere populatie van neuronen voor moleculaire karakterisering te isoleren. Laser capture microdissectie (LCM) is een nieuwe techniek waarbij een homogene populatie van cellen van een weefselsectie selectief kan worden vastgelegd voor genexpressieanalyse 6. Het brein is een heterogeen weefsel dat bestaat uit neuronen, glia en andere mobiele types. LCM is gebruikt om neuron-specifieke genexpressie te bepalen analyses 7-10. We hebben eerder uitgevoerd LCM van hippocampale neuronen uit AD (Tg2576) muis hersenen secties om verminderde expressie van cyclisch AMP respons element binding protein (CREB) en BDNF blijkt specifiek in de hippocampus neuronen 11. In deze studie beschrijven we procedures voor de uitbreiding van menselijke NPCs, neuronale differentiatie, immunofluorescentie kleuring voor neuronale merkers en LCM voor het isoleren van neuronen gekweekt op objectglaasjes PEN membraan.

<table><tbody><tr><td>Neuroprogenitor cellen (NPC's) </td><td>Lonza</td><td>PT-2599</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A menselijk basaal medium</td><td>Stamcel technologie</td><td>5750</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A Proliferatiesupplement</td><td>Stamcel technologie</td><td>5753</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A Differentiatiesupplement</td><td>Stamcel technologie</td><td>5754</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x) </td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Humaan epidermale groeifactor</td><td>Stamcel technologie</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast groeifactor </td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Hersengebonden neurotrofe factor </td><td>Celsignalering</td><td>3897S</td><td></td></tr><tr><td>Nervgroeifactor </td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Dibutyryl cyclisch AMP</td><td>Sigma</td><td>D-0627</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine </td><td>Sigma</td><td>P-5899</td><td></td></tr><tr><td>Muis laminine </td><td>Sigma</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Retinoïnezuur</td><td>Sigma</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>STAT3 antilichaam</td><td>Celsignalering</td><td>9132</td><td></td></tr><tr><td>GFAP antilichaam</td><td>Celsignalering</td><td>3670</td><td></td></tr><tr><td>GAP43 antilichaam</td><td>Transductielaboratoria</td><td>612262</td><td></td></tr><tr><td>BDNF antilichaam</td><td>Millipore</td><td>AB1534SP</td><td></td></tr><tr><td>Acetylcholinesterase antilichaam </td><td>Santz cruz</td><td>Sc-11409</td><td></td></tr><tr><td>Synaptofysine antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab18008-50</td><td></td></tr><tr><td>NeuN antilichaam</td><td>Chemicon</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Synapsine antilichaam</td><td>Novus</td><td>NB300-104</td><td></td></tr><tr><td>Anti muis FITC</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-095-146</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Onderzoekslaboratoria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti konijn Cy3</td><td>Jackson Immuno</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Onderzoekslaboratoria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1653</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Acros</td><td>21568-2500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehye </td><td>Fisher</td><td>4042</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas (Grote cirkeldekglas)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-102</td><td></td></tr><tr><td>Montagemedium (Prolong Gold)</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Pen membraan</td><td>Applied biosystems</td><td>LCM0521</td><td></td></tr><tr><td>Histogene LCM bevroren sectiestainingkit</td><td>Applied biosystems</td><td>KIT0401</td><td></td></tr><tr><td>RiboAmp RNA Amplificatiekit</td><td>Applied biosystems</td><td>KIT0201</td><td></td></tr><tr><td>Picopure RNA Isolatiekit</td><td>Applied biosystems</td><td>KIT0202</td><td></td></tr><tr><td>CapsureMacro LCM caps</td><td>Applied biosystems</td><td>LCM0211</td><td></td></tr></tbody></table>

lasermicrodissectie van neuronen van gedifferentieerd human neuroprogenitor cellen in cultuur

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cellen (NPC) geïsoleerd uit de humane foetale hersenen werden onder proliferatieve aandoeningen uitgebreid in de aanwezigheid van epidermale groeifactor (EGF) en fibroblast groeifactor (FGF) een overvloedige toevoer van cellen. NPCs werden gedifferentieerd in de aanwezigheid van een nieuwe combinatie van zenuwgroeifactor (NGF), van hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) en retinoïnezuur op de vaat bekleed met poly-L-lysine en muis laminine te verkrijgen neuron -rijke culturen. NPCs werden gedifferentieerd in afwezigheid van neurotrofinen, DBC en retinoïnezuur en in aanwezigheid van ciliaire neurotrofe factor (CNTF) naar astrocyt-rijke culturen verkregen. Gedifferentieerde NPCs werden gekenmerkt door immunofluorescentiekleuring voor een panel van neuronale markers inclusief NeuN, synapsine, acetylcholinesterase, synaptofysine en GAP43. Gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) en STAT3, astrocyten markers, werden gedetecteerd in 10-15% van de gedifferentieerde NPCs. Ter vergemakkelijkingceltype specifieke moleculaire karakterisering, werd lasermicrodissectie uitgevoerd om neuronen gekweekt op polyethyleennaftalaat (PEN) membraan dia&#39;s te isoleren. De in deze studie beschreven methoden leveren waardevolle instrumenten om ons begrip van de moleculaire mechanismen van neurodegeneratie te bevorderen.

Uitbreiding van NPCs (figuur 1) Wanneer neurospheres worden afgebroken om een ​​enkele celsuspensie door trituratie, de pipetpunt moet de bodem van de buis raakt zodat er enige weerstand wanneer de suspensie op en neer gepipetteerd. Het aantal malen trituratie variëren tussen individuen en moet worden beslist proefondervindelijk door onderzoek van de resulterende celsuspensie onder een microscoop. Het is cruciaal om voldoende dichtheid celsuspensie verschaffen omdat de prolifer...

Menselijke neuroprogenitor cellen (NPC) werden uitgebreid onder uitdijende omstandigheden. NPCs werden gedifferentieerd in neuron-rijke culturen in aanwezigheid van een combinatie van neurotrofinen. Neuronale merkers werden gedetecteerd door immunofluorescentie kleuring. Om een ​​zuivere populatie van neuronen te isoleren, werden NPCs gedifferentieerd PEN membraan glijbanen en lasermicrodissectie werd uitgevoerd.

Lasermicrodissectie van neuronen van Gedifferentieerd Human Neuroprogenitor Cellen in Cultuur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het ontwikkelen van een menselijk neuronale cultuurmodel, het identificeren van neuronale markers en het isoleren van een zuivere populatie neuronen voor genexpressieanalyse. Dit wordt bereikt door eerst menselijke neuroprogenitorcellen te expanderen om een continue voorraad progenitorcellen te creëren. Als tweede stap worden de neuroprogenitorcellen gekweekt in de aanwezigheid van differentiatiesupplementen en neurotrofe groeifactoren in schaaltjes die zijn gecoat met hechtingsfactoren.Vervolgens wordt immunofluorescente kleuring voor neuronale markers uitgevoerd om het lot van de gedifferentieerde neurale progenitorcellen te bepalen. Ten slotte wordt laser capture microdissectie uitgevoerd op neuronen die zijn gekweekt op PEN-membraanplaatjes om neuron-specifieke genexpressieanalyse te faciliteren. De resultaten tonen aan dat de gedifferentieerde neurale progenitorcellen overwegend van neuronale aard zijn.Op basis van immunofluorescente kleuring en de vangst van neuronen. Middels laser-capture microdissectie kunnen menselijke neurale progenitorcellen worden uitgebreid en gedifferentieerd tot neuronrijke culturen. Voor in vitro stud

laser-capture-microdissection-neurons-from-differentiated-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video beschrijft de manipulatie van gekweekte neuronen met behulp van laser-pincet in vitro.

Met behulp van Laser pincet voor het manipuleren van geïsoleerde neuronen in vitro

In deze video-artikel stellen we een methode voor het isoleren van een of...

Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen

Source: Palma-Tortosa, S., et.al. Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the transplantation of stem cell-derived neuronal progenitor cells into human cortical tissue slices. The procedure involves isolating and resuspending progenitor cells in a basement membrane matrix, followed by their injection into a cortical slice placed on a transwell assembly. After incubation to allow...

Transplantation of Stem Cell-Derived Neuronal Progenitors into Human Cortical Slices

This video demonstrates a method to differentiate human neural progenitor cells (NPCs) into neurons. The NPCs are introduced onto an established mouse astrocyte-rat cortical neuron co-culture, promoting NPC differentiation into neurons. The differentiation is confirmed by visualizing the cells under a confocal microscope.

A Co-culture Technique for Differentiating Human Neural Progenitor Cells into Neurons

We beschrijven hoe laser capture microdissectie (LCM) om verrijkte populaties van hippocampale neuronen of afzonderlijke neuronen vastgezette gewonden rattenhersenen voor daaropvolgende analyse van genexpressie met kwantitatieve real time PCR en / of hele genoom microarrays verkrijgen.

Laser Capture Microdissection van Verrijkt populaties van neuronen of Single Neuronen voor de analyse van genexpressie na traumatisch hersenletsel

In deze studie, een roman platform om intraneuronaal moleculaire handtekeningen van respons op de behandeling in een bipolaire stoornis (BD) te onderzoeken werd ontwikkeld en gevalideerd. Reukepitheel van BD-patiënten werd verkregen door middel van nasale biopsieën. Vervolgens werd laser-capture microdissection gecombineerd met Real Time RT PCR om de moleculaire signatuur van lithium reactie in BD onderzoeken.

Reukneuronen Verkregen door Neus Biopsie Gecombineerd met Laser-Capture Microdissection: Een benadering die voor Studie respons op de behandeling in Mental Disorders

De isolatie van individuele dopamine neuronen of het ventrale tegmentale met directe of indirecte immunohistochemie wordt aangetoond met behulp van lasermicrodissectie. Parameters voor isolatie van weefsel uit een glasplaatje met een infrarood laser en van membraansystemen dia met de combinatie van infrarood en ultraviolet laser besproken.

Lasermicrodissectie - Een demonstratie van de Isolatie van individuele dopamineneuronen en de Gehele Ventral tegmentum

Dendritische stekels van piramidale neuronen zijn de sites van de meest prikkelende synapsen in de hersenen van zoogdieren cortex. Deze methode beschrijft een 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie in menselijke corticale piramidale glutamaat neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Neurale stam/voorlopercellen vertonen verschillende expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten die leiden tot verschillende uitkomsten van cellulaire gebeurtenissen. Een dergelijke dynamische uitdrukking kan worden onthuld door real-time monitoring, niet door statische analyse, met behulp van een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem dat visualisatie van snelle veranderingen in genexpressies mogelijk maakt.

Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese

Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van een eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen en hun daaropvolgende differentiatie in neurale voorlopercellen. Het protocol is eenvoudig, robuust, schaalbaar en geschikt voor geneesmiddelen screening en toepassingen voor regeneratieve geneeskunde.

Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

We beschrijven een methode voor het differentiëren van door het ruggenmerg geïnduceerde pluripotent-afgeleide astrocyten en neuronen en hun co-cultuur voor elektrofysiologische registratie.

Oprichting van een elektrofysiologisch platform voor het modelleren van ALS met regionaal specifieke menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten en neuronen

Leer lasermicrodissectie van neuronen uit gedifferentieerde humane neuroprogenitorcellen voor genexpressieanalyse. Deze methode isoleert zuivere neuronale populaties voor onderzoek naar neurale ontwikkeling.

Lasermicrodissectie van neuronen van Gedifferentieerd Human Neuroprogenitor Cellen in Cultuur

Meer video's verkennen