2.5: Separación de proteínas en SDS-PAGE

SDS-PAGE es una técnica utilizada por muchos investigadores para separar mezclas de proteínas por tamaño. La finalización exitosa de esta técnica es un primer paso esencial para muchos métodos de análisis de proteínas, como el inmunotransferencia. Por sí mismo, es una herramienta útil para evaluar el tamaño y la pureza de las proteínas.

Para comprender la técnica SDS-PAGE, primero debe comprender sus componentes principales. SDS-PAGE son las siglas de Electroforesis en gel de poliacrilamida con sulfato de dodecilo de sodio. Sulfato de sodio-dodecilo, la primera parte de esto, o ? SDS?, es un detergente aniónico. Esto significa que está compuesto por un grupo hidrófilo con una carga negativa neta y una larga cadena hidrofóbica con carga neutra.

La cadena hidrofóbica cubre las proteínas en proporción a su masa a una tasa de 1,4 gramos de SDS por gramo de proteína. Esto proporciona a las proteínas la fuerza motriz necesaria para la separación por tamaño en un campo eléctrico.

La electroforesis en gel de poliacrilamida utiliza un hidrogel hecho de poliacrilamida. La poliacrilamida es un polímero que forma una matriz muy regular a través de la cual pueden moverse las proteínas. Cuanto más concentrado esté el gel, más lentamente atravesarán las proteínas cuando se expongan a un campo eléctrico. El proceso de utilizar un campo eléctrico espacialmente uniforme para influir en el movimiento de un objeto se conoce como electroforesis.

SDS-PAGE se realiza en proteínas aisladas de muchas fuentes diferentes, incluidas células en cultivo, tejidos, sangre, orina y levadura.

Las proteínas de estas diversas fuentes deben separarse primero de otros componentes celulares utilizando técnicas que incluyen la homogeneización y la centrifugación, a menudo seguidas del uso de tampones de lisis.

Una vez que se aísla la proteína, a menudo se mide su concentración, para garantizar una carga uniforme de las muestras, comparando la cantidad de proteína en la muestra con los estándares de albúmina en un ensayo colorimétrico de ácido bicinconínico o BCA.

Un paso importante a recordar es la adición del búfer de carga. El búfer de carga tiene 3 funciones principales. En primer lugar, gracias a la SDS y a los agentes reductores adicionales, desnaturaliza las proteínas, lo que básicamente significa que convierte las estructuras proteicas complejas en una cadena lineal de aminoácidos. En segundo lugar, contiene glicerina, lo que garantiza que la muestra no flote cuando se carga en los pocillos del gel. Y, por último, la mayoría de los tampones de carga comerciales incluyen un colorante, como el azul de bromofenol, que se puede rastrear para medir el progreso de la etapa de electroforesis.

Después de agregar el tampón de carga, las muestras deben mezclarse y luego hervirse durante 5 minutos. Esto permite que los fuertes enlaces de disulfuro en las proteínas se rompan con la ayuda de un agente reductor como el beta-mercaptoetanol. Una vez que se rompen todos los enlaces disulfuro, SDS puede recubrir las proteínas de manera más uniforme.

A continuación, las muestras se centrifugan rápidamente y están listas para ser cargadas en el sistema de gel para la electroforesis.

Antes de que se puedan cargar las muestras, primero se debe ensamblar el sistema de gel. Esto comienza con la compra o fabricación de un gel de poliacrilamida. Los geles prefabricados se están volviendo cada vez más populares porque la acrilimida es neurotóxica y puede causar daño cerebral. El casete de gel contiene pocillos que se utilizan para cargar las muestras.

Una vez que los geles están asegurados en su lugar, las cámaras interna y externa se llenan con un tampón que contiene la misma concentración de iones que se usa para hacer los geles. Esto crea un circuito eléctrico que pasa sin problemas desde el cátodo, a través del gel y hasta el ánodo.

A continuación, se suelen cargar en el gel escalas de peso molecular, seguidas de las muestras. A medida que el gel corre, la escalera se extenderá y creará bandas de proteínas visibles de tamaños conocidos. En los pasos finales, estas bandas se pueden usar para calcular el tamaño de cada proteína.

Una vez cargadas todas las muestras, los terminales positivo y negativo de la caja de gel se conectan a una fuente de alimentación capaz de mantener un voltaje constante durante un largo período de tiempo. Por lo general, los geles se inician alrededor de 60 V hasta que toda la muestra ha ingresado a la región de gel llamada "gel de apilamiento". Luego, el voltaje se incrementa a alrededor de 200 V durante 30 minutos a 1 hora, dependiendo del tamaño y la concentración del gel y el tamaño de la proteína de interés.

Una vez finalizada la electroforesis, se retira el casete y se abre para exponer el gel. A continuación, el gel se puede teñir con una tinción de proteína típica, como el azul de Coomassie o la tinción de plata, para visualizar las bandas de proteínas dentro del gel. La tinción de Coomassie puede detectar bandas con tan solo 50 nanogramos de proteína, mientras que la tinción de plata puede detectar bandas con tan solo 1 nanogramo de proteína.

En la electroforesis en gel bidimensional, las muestras se separan por dos propiedades separadas en los geles, una dimensión a la vez. En primer lugar, las muestras se cargan y se organizan según sus puntos isoeléctricos en tiras de gradiente de pH localizadas. A continuación, las proteínas de la tira se desnaturalizan y se colocan encima de un gel de poliacrilamida típico, donde se fijan en su lugar con una solución de gel fresca. A continuación, la separación de la segunda dimensión se realiza mediante SDS-PAGE.

Si bien el enfoque isoeléctrico no es la única opción para la electroforesis en gel 2D, es la más común. La electroforesis en gel bidimensional es una herramienta invaluable que proporciona información sobre los complejos de proteínas y la organización de suborgánulos.

Después de ejecutar el gel, el siguiente paso muy común es transferir las proteínas del gel a una membrana hecha de PVDF o nailon para su análisis. A continuación, puede utilizar anticuerpos específicos para sondear la membrana y buscar proteínas de interés. A continuación se muestran los resultados típicos de inmunotransferencia en los que el investigador utilizó 3 técnicas diferentes de amplificación de señal para determinar cuál muestra mejor la presencia de la proteína Pit-1 a lo largo de una serie de diluciones en serie.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la separación de proteínas mediante SDS-PAGE. Ahora debería comprender los pasos involucrados en la resolución de una proteína por tamaño utilizando esta poderosa técnica. Como siempre, ¡gracias por mirar!