Transformación bacteriana: El método por choque térmico

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

2.2: Gel Purification

736,988 Views

•

11:01 min

•

February 01, 2013

Overview

Transformación es el proceso que ocurre cuando una célula ingiere ADN extraño de sus alrededores. Transformación puede ocurrir en la naturaleza en ciertos tipos de bacterias. En biología molecular, transformación es reproducir artificialmente en el laboratorio mediante la creación de poros en las membranas celulares bacterianas. Las células bacterianas que son capaces de tomar ADN del ambiente se denominan células competentes. En el laboratorio, las células bacterianas pueden hacerse competentes y ADN introducida posteriormente por un procedimiento llamado el método de choque de calor.

Transformación de choque de calor utiliza un ambiente rico de calcio proporcionado por cloruro de calcio para contrarrestar la repulsión electrostática entre el ADN plásmido y la membrana celular bacteriana. Un aumento repentino en la temperatura crea poros en la membrana plasmática de las bacterias y ADN plásmido permite entrar en la célula bacteriana. Este video va a través de un procedimiento paso a paso sobre cómo crear bacteria químicamente competente, realizar transformación de choque de calor, placa de la bacteria transformada y calcular la eficiencia de transformación.

Procedure

Transformación bacteriana es un método ampliamente utilizado donde se introduce ADN extraño en una bacteria, que entonces puede amplificar o clonar el ADN. Las células que tienen la capacidad para fácilmente tomar este ADN se denominan células competentes. Aunque la transformación se produce naturalmente en muchos tipos de bacterias, los científicos han encontrado maneras de inducir artificialmente y mejorar la capacidad de una célula bacteriana. En este video vamos a hablar sobre una de estas maneras, transformación de choque de calor.

Antes de hablar de la técnica de choque de calor, vamos a discutir primero el tipo de ADN más comúnmente-utilizado en la transformación bacteriana: el plásmido. Un plásmido es un pequeño, circular, doble cadena de ADN que puede reducir su tamaño por superenrollamiento, por lo que puede pasar fácilmente a través de poros en la membrana de la célula.

Un plásmido contiene algunas regiones importantes digno de mencionar. Plásmidos disponibles comercialmente contienen un sitio de clonación múltiple o MCS. Esta región contiene secuencias específicas reconocidas por endonucleasas de restricción o enzimas de restricción, que hender la DNA. Fragmentos de ADN de interés para el investigador pueden introducirse en el sitio de clonación múltiple del plásmido y el fragmento de ADN se cortan con las endonucleasas mismo.

Plásmidos también contienen un origen de replicación, o ORI, que proporciona información a la celda donde debe comenzar la replicación del plásmido.

Además el origen de replicación y el sitio de clonación múltiple, la mayoría de plásmidos incluirá un gen de resistencia a los antibióticos. Este gen confiere resistencia a los antibióticos a todas las celdas que contienen el plásmido, permitiendo que esas células a sobrevivir en el antibiótico que contiene los medios de comunicación.

Ahora que hemos analizado plásmidos, vamos a hablar de las células en que se presentará: las células competentes. La más comúnmente utilizada tipo de bacterias en la investigación de la biología molecular y transformación es e. coli, que también habitan el intestino inferior. Las células típicamente se hacen competentes a través de la exposición a un ambiente rico de calcio.

Las cargas positivas de los iones de calcio neutralizan las cargas negativas de los plásmidos y la pared celular bacteriana disipando la repulsión electrostática y debilitamiento de la pared celular.

Al exponer las células a un aumento repentino en la temperatura o choque térmico, se crea una diferencia de presión entre el exterior y el interior de la célula, que induce la formación de poros, a través del cual se puede introducir DNA plasmídico superenrollado. Después de regresar a las células a una temperatura normal, la pared celular le self-heal.

Una vez que las células han tomado en el plásmido, serán capaces de crecer en placas de agar con antibióticos.

Antes de comenzar la transformación de choque de calor, limpiar área de trabajo y asegúrese de que todos los equipos son esterilizados.

Asegúrese de que tiene suficientes medios y preparado, de agar que proporcionan la nutrición a las bacterias que competente. También asegúrese de esterilizar todas las soluciones mediante autoclave. Permite medio líquido a enfriar a temperatura ambiente antes de su uso y deje enfriar el agar a 50-55˚C, la temperatura a la que pueden añadirse antibióticos y vertieron de placas. Permita que las placas se enfríe a temperatura ambiente para solidificar.

Cuando se trabaja con bacterias, uno siempre debe utilizar técnica aséptica para mantener la esterilidad. Técnica aséptica implica típicamente el uso de un mechero de Bunsen para esterilizar instrumentos y reactivos y crear una convección actual – que mantiene contaminantes en el aire en el espacio de trabajo.

Inmediatamente antes de la reacción de choque de calor, caliente previamente sus medios a la temperatura ambiente y que contiene el antibiótico LB las placas de agar a 37 ° C. También asegúrese de que su baño esté a 42° C.

A continuación, descongelar células químicamente competentes en el hielo.

Agregar, 1-5uL de 1ng/μL frío plásmido a las células bacterianas, mezclar suavemente y devolver la mezcla celular y plásmido de hielo durante 30 minutos.

Cuando el tiempo está para arriba, calor descarga la mezcla de células y plásmido colocando en un baño de agua a 42˚C durante 30 segundos.

Inmediatamente después de tomar el tubo de la bañera de agua ponlo en hielo y añadir 450μL de medios de comunicación. Colóquelo en una agitación incubadora de 37° C durante 1 hora a más de 225 rpm para que las células pueden recuperar.

Utilizando una técnica aséptica adecuada, añadir bacterias 20-200uL a una placa de agar LB y difundir el medio alrededor con un esparcidor bacteriano. Incubar las placas durante la noche en 37˚C boca abajo para prevenir la exposición de las bacterias a condensación.

Al día siguiente, las bacterias que han tenido en el plásmido forman colonias.

A continuación, cuente las colonias para calcular la eficiencia de transformación, que es el número de transformantes éxito dividido por la cantidad total de ADN plateado.

Ahora, las colonias pueden seleccionarse para más experimentación.

Antes de hacerse competentes las bacterias utilizadas en la transformación se almacenan en el congelador. Debe ser descongelados en el hielo, extender sobre una placa de agar, sin antibióticos y permitió crecer durante la noche en 37˚C.

Utilizando una técnica aséptica, seleccionar una colonia de bacterias de la placa de agar y crecer en una cultura grande 500 ml durante la noche en 37˚C en un incubador de agitación – un instrumento, que evita la sedimentación de las bacterias y la dispersión uniforme de nutrientes en los medios de comunicación.

Mientras que las células están creciendo hacer 0.1 molar cloruro de calcio y 0,1 molar cloruro de calcio además de soluciones de glicerol al 15%, autoclave y deje enfriar.

Las mediciones de absorbancia se utilizan para determinar si es o no la bacteria en su fase de registro medio de crecimiento, lo cual significa que fácilmente se ocupan de ADN. Una vez que las células han alcanzado esta fase, coloque en hielo y mantenerlos allí durante todo el procedimiento.

A continuación, separar las células bacterianas en dos tubos de centrífuga grande y centrifugar a 4° C. Retirar el sobrenadante y resuspender en 100 ml 0.1 molar frío de cloruro de calcio. Luego, incubar las células en hielo durante 30 minutos. Este paso se repite al menos una vez más. Ciclos de spinning y resuspender las células se refieren a menudo como lavar las células.

Después del último lavado, resuspender las células en un frío 50mL 0.1 molar cloruro de calcio además de solución de glicerol 15%. Estas células son ahora químicamente competentes.

Distribuir 50μL de bacterias en varios tubos de microcentrífuga y conservarlo a – 80˚C hasta que esté listo para el choque del calor.

Existen muchas aplicaciones y variaciones de transformación bacteriana.

Además de golpes de calor, eletroporation es otra técnica común para la transformación. Como su nombre lo indica electroporación implica el uso de electricidad para hacer poros en la membrana celular bacteriana a través del cual el ADN puede pasar.

Con respecto a la detección de bacterias transformadas, plásmidos a menudo contienen un gen que codifica la enzima beta-galactosidasa para ayudar con la investigación. Cuando el sustrato para esta enzima está incluido en las placas de agar, las bacterias que han sido transformadas con plásmidos que contienen un relleno producen colonias blancas, mientras que los que no lo hacen, la producción de colonias azules. Este método se conoce como proyección azul y blanco.

En experimentos de transformación de la mayoría el objetivo es obtener rápidamente dividiendo las bacterias para hacer grandes cantidades de su plásmido, que incluye el gene de la blanco. Después de la transformación bacteriana, el siguiente paso es crecer grandes cantidades de bacterias en medio líquido que contiene antibiótico y purificación del plásmido, que, como su nombre lo indica, consiste en la purificación de la plásmidos de las bacterias. Muchos kits comerciales están disponibles para este propósito.

A veces el objetivo de transformación es que las bacterias generan grandes cantidades de la proteína codificada por el plásmido. Aquí puede ver las células bacterianas se homogeneizó y lisis antes de una técnica llamada purificación de afinidad puede realizarse para aislar la proteína diana. Después de purificar grandes cantidades de la proteína puede ser cristalizado luego y estructura de la proteína particular de interés puede ser identificado.

Sólo ha visto JoVE Introducción a las transformaciones de choque de calor. En este video repasamos: Qué transformación de choque de calor es y cómo funciona, el director detrás de él y cómo éxito transformar bacterias. ¡Gracias por ver!

Transcript

Bacterial transformation is a widely used method where foreign DNA is introduced into a bacterium, which can then amplify, or clone the DNA. Cells that have the ability to readily take up this DNA are called competent cells. Although transformation is naturally occurring in many types of bacteria, scientists have found ways to artificially induce and enhance a bacterial cell’s competency. In this video we will talk about one of these ways, heat shock transformation.

Before we talk about the heat shock technique, let’s first discuss the type of DNA most-commonly-used in bacterial transformation: the plasmid. A plasmid is a small, circular, double-stranded DNA that can reduce its size by supercoiling, so that it can easily pass through pores in a cell membrane.

A plasmid contains a few important regions worth mentioning. Commercially available plasmids contain a multiple cloning site or MCS. This region contains specific sequences recognized by restriction endonucleases or restriction enzymes, which cleave DNA. DNA fragments of interest to the researcher can be inserted into the multiple cloning site when the plasmid and DNA fragment are cut with the same endonucleases.

Plasmids also contain an Origin of Replication, or ORI, that provides information to the cell as to where replication of the plasmid should begin.

In addition to the origin of replication and the multiple cloning site, most plasmids will include an antibiotic resistance gene. This gene confers antibiotic resistance to all cells that contain the plasmid, allowing those cells to survive in antibiotic-containing media.

Now that we’ve discussed plasmids, let’s talk about the cells into which they will be introduced: the competent cells. The most commonly used type of bacteria in molecular biology research, and transformation is E. coli, which happens to also inhabit your lower intestine. Cells are typically made competent via exposure to a calcium rich environment.

The positive charges of the calcium ions neutralize the negative charges of both the plasmid and the bacterial cell wall dissipating electrostatic repulsion and weakening the cell wall.

By exposing cells to a sudden increase in temperature, or heat shock, a pressure difference between the outside and the inside of the cell is created, that induces the formation of pores, through which supercoiled plasmid DNA can enter. After returning the cells to a more normal temperature, the cell wall will self-heal.

Once cells have taken up the plasmid, they will be able to grow on agar plates laced with antibiotic.

Before starting heat shock transformation, clean the work area and make sure all equipment is sterilized.

Ensure that you have enough media and agar prepared, which provide the nutrition to the bacteria you will make competent. Also be sure to sterilize all solutions via autoclaving. Allow liquid media to cool to room temperature before use and let the agar cool to 50-55˚C, the temperature at which antibiotic can be added and plates poured. Allow plates to cool to room temperature to solidify.

When working with bacteria, one should always use aseptic technique to maintain sterility. Aseptic technique typically involves the use of a Bunsen burner to sterilize instruments and reagents and create a convection current – which keeps airborne contaminants out of the workspace.

Immediately before the heat shock reaction, pre-warm your media to room temperature and antibiotic-containing LB agar plates to 37°C. Also make sure that your water bath is at 42°C.

Next, thaw chemically competent cells on ice.

Add, 1-5uL of 1ng/μL cold plasmid to the bacterial cells, mix gently, and return the cell and plasmid mixture to ice for 30 minutes.

When time is up, heat shock the cell and plasmid mixture by placing it in a water bath at 42˚C for 30 seconds.

Immediately after taking the tube out of the water bath put it on ice and add 450μL of media. Place it in a shaking incubator for 37°C for 1 hour at over 225 rpm so that the cells can recover.

Using proper aseptic technique, add 20-200uL bacteria to an LB agar plate and spread the medium around with a bacterial spreader. Incubate the plates overnight at 37˚C upside down to prevent exposure of bacteria to condensation.

The next day, the bacteria that have taken in the plasmid form colonies.

Next, count the colonies to calculate the transformation efficiency, which is the number of successful transformants divided by the total amount of DNA plated.

Now, colonies can be selected for further experimentation.

Prior to being made competent the bacteria used in transformation are stored in the freezer. They must be thawed on ice, spread on an agar plate – without antibiotics, and allowed grow overnight at 37˚C.

Using aseptic technique, select a bacterial colony from the agar plate and grow it up in a large 500 ml culture overnight at 37˚C in a shaking incubator – an instrument, which prevents sedimentation of the bacteria and even dispersal of nutrients in the media.

While the cells are growing make 0.1 molar calcium chloride and 0.1 molar calcium chloride plus 15% glycerol solutions, autoclave, and let cool.

Absorbance measurements are used to determine whether or not the bacteria are in their mid-log phase of growth, which means they will readily take up DNA. Once cells have reached this phase, place them on ice and keep them there throughout the procedure.

Next, separate the bacterial cells into two large centrifuge tubes and spin at 4°C. Pour off supernatant and resuspend in about 100 ml 0.1 molar of cold calcium chloride. Then, incubate cells on ice for 30 minutes. This step is repeated at least once more. Cycles of spinning and resuspending cells are often referred to as washing your cells.

After the final wash, resuspend cells in a cold 50mL 0.1 molar calcium chloride plus 15% glycerol solution. These cells are now chemically competent.

Distribute 50μL of bacteria into multiple microfuge tubes and store at -80˚C until ready for heat shock.

Many applications and variations of bacterial transformation exist.

In addition to heat shock, eletroporation is another common technique for transformation. As it’s name implies electroporation involves using electricity to make pores in the bacterial cell membrane through which DNA can pass.

With respect to screening for transformed bacteria, plasmids often contain a gene encoding the enzyme beta-galactosidase to aid with screening. When the substrate for this enzyme is included in agar plates, bacteria that have been transformed with plasmids containing an insert yield white colonies, while those that do not, yield blue colonies. This method is referred to as blue and white screening.

In most transformation experiments the goal is to get rapidly dividing bacteria to make large quantities of your plasmid, which includes your target gene. Following bacterial transformation, the next step is to grow up large quantities of the bacteria in antibiotic-containing liquid medium and perform plasmid purification, which, as it’s name suggests, involves purifying the plasmids from bacteria. Many commercial kits are available for this purpose.

Sometimes the goal of transformation is to have bacteria generate large amounts of protein encoded by the plasmid. Here you see bacterial cells being homogenized and lysed before a technique called affinity purification can be performed to isolate the target protein. After purifying large amounts of the protein it can then be crystallized and structure of the particular protein of interest can be identified.

You’ve just watched JoVE Introduction to Heat Shock Transformations. In this video we reviewed: what heat shock transformation is and how it works, the principal behind it and how to successful transform bacteria. Thanks for watching!

Tags

Bacterial Transformation Heat Shock Method Foreign DNA Amplify DNA Clone DNA Competent Cells Artificial Induction Enhance Competency Heat Shock Technique Plasmid Circular DNA Supercoiling Cell Membrane Multiple Cloning Site (MCS)Restriction Endonucleases Restriction Enzymes DNA Fragments Origin Of Replication (ORI)Antibiotic Resistance