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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

El método de ELISA

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

The ELISA Method

2.7: Bacterial Transformation: Electroporation

2.9: Plasmid Purification

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10:06 min

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April 30, 2023

Overview

Un análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) se realiza generalmente para detectar la presencia o la cantidad de una proteína diana de interés dentro de una muestra experimental. Detección de la proteína Diana es hecha posible por los anticuerpos, que hacen el ELISA de un inmunoensayo. A través de una serie de incubación y de pasos de lavado, estos anticuerpos, que con frecuencia están vinculados, o conjugado, a una enzima, detecta proteína capa el fondo de un pozo en una placa de microtitulación. Cuando se expone a un sustrato, enzima anticuerpo causará un cambio de color, lo que indica la presencia de la proteína de interés en la muestra.

En este video, se explica la teoría detrás de cómo funcionan los ELISAs, incluyendo una discusión de tanto enlace con anticuerpos primarios y secundarios y la importancia de bloquear pasos. Teoría es seguida por la práctica, como el vídeo avanza a explicar el procedimiento paso a paso. Finalmente, las variaciones de la norma ELISA como el sándwich y Elisa competitiva son introducidas y reales aplicaciones de este método, tales como pruebas de embarazo de venta libre se explican.

Procedure

La ELISA o ensayo inmunoenzimático, es un método ampliamente utilizado para determinar la presencia o ausencia de una proteína objetivo específico.

Través de una serie de pasos vinculantes y lavado, un anticuerpo conjugado, o ligado, a una enzima reconoce una proteína de la blanco en la parte inferior de una placa de 96 pocillos. Cuando se añade a la muestra de sustrato, se produce una reacción enzimática, provocando un cambio de color permite la identificación y cuantificación de la proteína diana.

Antes de que discutimos cómo realizar un ELISA, vamos a familiarizarse con el equipo y reactivos que usted necesita.

El ajuste de una reacción de ELISA es típicamente un plato de fondo plano de 96 pozos. El fondo plano de los pozos ayudará a facilitar una distribución uniforme de la muestra experimental, así como sus captura y detección de los anticuerpos.

ELISA detecta la presencia de proteínas específicos en soluciones acuosas experimentales. Suero, orina y medios de cultivo celular son muestras experimentales comunes.

En un ELISA, el anticuerpo que se une directamente a la proteína Diana es el anticuerpo primario. Tiene alta afinidad, es decir, una alta capacidad para atar firmemente, para un epitopo – una región específica – de la proteína diana. El anticuerpo primario es generalmente sin etiqueta o no-conjugado.

Como se ha mencionado, sobre todo se unen a las proteínas de su destino a través de la alta afinidad de unión a un epitopo específico. Sin embargo, la muestra experimental puede contener trozos de células que expresan los sitios de Unión inespecíficos, sitios que se pueden unir a la región constante, o no-epitopo específica, de los anticuerpos de su detector.

Por lo tanto, la adición de un tampón de bloqueo es esencial en un ELISA para cubrir cualquier sitios de Unión inespecíficos en las muestras experimentales. De lo contrario puede tener reacciones enzimáticas que ocurren en pozos que no contienen proteína diana, dándole datos positivos falsos!

El anticuerpo secundario en un ELISA es el anticuerpo utilizado para reconocer el anticuerpo primario. Este anticuerpo es generalmente conjugado a una enzima. A veces el anticuerpo secundario tiene un nombre de funky. Por ejemplo, si el anticuerpo secundario, o levantado, en un burro para reconocer un anticuerpo primario en una cabra, el anticuerpo secundario se llamaría un anticuerpo de anti-cabra burro. Cuando se trata de anticuerpos secundarios de nombres, el nombre indica el organismo que produce el anticuerpo secundario, y el segundo nombre representa el organismo que produce el anticuerpo primario.

También será necesario un sustrato, que se une al sitio activo de la enzima ligada al anticuerpo secundario. La reacción química que ocurre durante esta reacción provoca un cambio de color en el sustrato lo contrario incoloro. Este supuesto ensayo colorimétrico permite la identificación y cuantificación de la presencia de la proteína diana.

La reacción enzimática continuará como hay sustrato disponible. Por lo tanto, después de un período de incubación breve, una solución, que causa un cambio de color indicar que la reacción se ha detenido de hecho, se añade a los pocillos.

Un lector de microplacas se utilizará para cuantificar la concentración de la proteína de interés en cada pozo mediante la lectura de la absorbancia, es decir, la cantidad de producto coloreado, en cada pozo. La absorbancia es proporcional a la cantidad de proteína de objetivo presente.

Ahora que tienes todo tu equipo listo, vamos a ejecutar un ELISA!

Para llevar a cabo un estándar o directo, ELISA, primero cubrir los pocillos de la placa de 96 pocillos con su proteína diana de interés diluido en tampón de recubrimiento. Placa de los controles positivos y negativos en este momento también.

Después de incubar la placa revestida de largo suficiente para dar el tiempo de la proteína totalmente adsorber o fijar, en la parte inferior de la placa, descarga de la solución de recubrimiento sobrante con un rápido movimiento de su muñeca.

Entonces bloquear cualquier señal no específica posible de enlace o fondo, incubando cada uno en solución amortiguadora de bloqueo.

Ahora la descarga de la solución amortiguadora de bloqueo y lavar los pocillos con una incubación breve temperatura en tampón fosfato salino, o PBS y 1% de BSA.

Mientras que los pozos son se enjuagaron con PBS, preparar las diluciones de una concentración conocida de la proteína diana para crear una curva estándar. La absorbancia de los pocillos de la curva estándar, que contienen concentraciones conocidas de la proteína diana, se utilizará para calcular la concentración de la proteína diana en sus pozos de muestra experimental basado en una comparación de la absorbancia de los pocillos de la muestra a la absorbancia de los pocillos de la curva estándar.

Ahora es el momento para agregar la detección o el anticuerpo primario.

Luego se incuba la placa, generalmente a temperatura ambiente, para permitir una cantidad suficiente de anticuerpos se unen a la proteína diana para su posterior detección y cuantificación de la proteína.

Después de la incubación, se quita exceso anticuerpo y brevemente se lavan los pocillos con PBS.

Luego se añade el anticuerpo secundario a la placa y la placa se incuba una vez más – por lo general en una plataforma giratoria, para permitir que el anticuerpo secundario enlazar. Pasos de lavado se repiten como antes.

A continuación, añadir el sustrato a la placa para ver que pozos contienen la proteína diana. Cubrir la placa para proteger a la reacción de la luz y entonces después de una breve incubación, detener la reacción con la solución de parada.

Por último, coloque el plato en el lector de microplacas para medir la absorbancia o la cantidad de solución coloreada, en cada pozo. Tendrá que seleccionar qué pozos al lector a analizar. Cuando se termina el instrumento de lectura de la placa, una lectura de la absorbancia para cada bien se mostrará.

Es importante tener en cuenta que cada kit de ELISA tiene un límite de detección. Es decir, se pueden determinar con precisión sólo concentraciones de proteínas por encima y por debajo de límites específicos. Concentraciones muy pequeñas de proteína son generalmente demasiado cerca de los niveles de fondo de tinción inespecífica, mientras que concentraciones muy altas pueden indicar que exceso proteínas o anticuerpos no fue correctamente arrastrados en esa muestra bien.

Así que ¿por qué podría realizar un ELISA? Echemos un vistazo a algunas aplicaciones comunes.

Probablemente el tipo más común de ELISA realizado es el ELISA.

En un sandwich ELISA, una placa de 96 pocillos está cubierta primero con un anticuerpo primario que reconoce la proteína diana de interés.

En este experimento, medios de cultivo de células de líneas celulares productoras de anticuerpos humanos, fueron plateadas por un sistema automatizado en placas de 96 pocillos recubiertos con un anticuerpo primario que reconoce anticuerpos humanos previamente.

Después de lavar lejos el exceso muestra con PBS, se añade un anticuerpo enzima-ligado del secundario, seguido por un sustrato colorimétrico.

La absorbancia se mide en la misma forma que un típico ELISA. Por ejemplo, en este experimento, este datos de ELISA se utiliza para determinar que líneas celulares de producen el anticuerpo humano con la afinidad más alta para – es la mejor capacidad con precisión a – su antígeno blanco.

La prueba de embarazo de venta libre es un tipo de sándwich ELISA.

Cuando la orina de la mujer potencialmente embarazada se agrega a la prueba, anticuerpos primarios enzima-ligado a la prueba unirá la hormona del embarazo hCG si está presente. Si la mujer está embarazada, se producirá una reacción sustrato-enyzme cuando los anticuerpos primarios son reconocidos por anticuerpos secundarios enlazados a sustrato en el sitio de prueba, y una línea de color aparecerá.

Otro tipo de ELISA es la prueba de ELISA competitivo, que puede utilizarse para detectar la presencia de anticuerpos.

Si los anticuerpos de interés están presentes en la muestra, se atan a la proteína diana en la parte inferior de la placa. Más tarde, cuando se agregan anticuerpos de detección de enzima-ligado a la placa, los anticuerpos enzima-ligados encontrará pocas a ninguna proteína atar; habrá sido “hacia fuera-compitieron” por los anticuerpos de interés en la muestra experimental.

En un ELISA competitivo, entonces, los pozos de color indican las muestras que realmente no contienen el anticuerpo de interés! Muestras de plasma paciente normalmente se ejecutan en un ELISA competitivo con el fin de determinar si para ciertos patógenos como el virus del VIH, los anticuerpos están presentes en la muestra.

Sólo ha visto la introducción de JoVE a realizar un ELISA. En este video repasamos: Qué es un ELISA y cómo funciona; Qué equipos y reactivos necesita realizar y ELISA; y algunas aplicaciones diferentes del análisis. Gracias por mirar y no olvide dejar su sustrato sobreexponer!

Transcript

The ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, is a widely used method for determining the presence or absence of a specific target protein.

Via a series of washing and binding steps, an antibody conjugated, or linked, to an enzyme will recognize a target protein at the bottom of a 96-well plate. When substrate is added to the sample, an enzymatic reaction will occur, causing a color change that allows the identification and quantification of the target protein.

Before we discuss how to perform an ELISA, let’s get familiar with the equipment and reagents that you will need.

The setting for an ELISA reaction is typically a 96-well flat bottom plate. The flat bottoms of the wells will help facilitate an even distribution of your experimental sample, as well as your capture and detection antibodies.

ELISAs detect the presence of specific target proteins in experimental aqueous solutions. Urine, cell culture media, and serum are common experimental samples.

In an ELISA, the antibody that directly binds to the target protein is the primary antibody. It has high affinity, that is, a high ability to bind tightly, for an epitope – a specific region – of the target protein. The primary antibody is usually unlabeled, or un-conjugated.

As mentioned, antibodies mostly bind to their target proteins through high affinity binding to a specific epitope. However, the experimental sample may contain pieces of cells that express nonspecific binding sites, sites that can bind the constant, or non-epitope specific, region of your detector antibodies.

Therefore, addition of a blocking buffer is essential in an ELISA to cover any nonspecific binding sites in your experimental samples. Otherwise you may have enzymatic reactions occurring in wells that do not contain target protein, giving you false positive data!

The secondary antibody in an ELISA is the antibody used to recognize the primary antibody. This antibody is usually conjugated to an enzyme. Sometimes the secondary antibody has a funky name. For example, if the secondary antibody made, or raised, in a donkey to recognize a primary antibody raised in a goat, the secondary antibody would be called a donkey anti-goat antibody. When it comes to naming secondary antibodies, the first name indicates the organism that produced the secondary antibody, and the second name represents the organism that produces the primary antibody.

A substrate, which binds to the active site of the enzyme linked to the secondary antibody, will also be needed. The chemical reaction that occurs during this reaction causes a color change in the otherwise-colorless substrate. This so-called colorimetric assay allows the identification and quantification of the presence of the target protein.

The enzymatic reaction will continue as long as there is available substrate. Therefore, after a brief incubation period, a stop solution, which causes yet another color change to indicate the reaction has in fact been halted, is added to the wells.

A microplate reader will be used to quantify the concentration of the protein of interest in each well by reading the absorbance, that is, the amount of colored product, in each well. The absorbance is proportional to the amount of target protein present.

Now that you have all your equipment ready, let’s run an ELISA!

To perform a standard, or direct, ELISA, first coat the wells of the 96-well plate with your target protein of interest diluted in coating buffer. Plate your positive and negative controls at this time as well.

After incubating the coated plate long enough to give the protein time to completely adsorb, or attach, to the bottom of the plate, dump off the excess coating solution with a quick flick of your wrist.

Then block any possible non-specific binding or background signal by incubating each well in blocking buffer.

Now dump off the blocking buffer and wash the wells with a brief room temperature incubation in phosphate buffered saline, or PBS, and 1% BSA.

While the wells are being rinsed with PBS, prepare dilutions of a known concentration of the target protein to create a standard curve. The absorbance of the standard curve wells, which contain known concentrations of the target protein, will be used to calculate the concentration of target protein in your experimental sample wells based on a comparison of the absorbance of the sample wells to the absorbance of the standard curve wells.

Now it’s time to add the detection or primary antibody!

The plate is then incubated, usually at room temperature, to allow a sufficient amount of antibody to bind to the target protein for later detection and quantification of the protein.

After this incubation, excess antibody is removed and the wells are briefly washed with PBS.

Secondary antibody is then added to the plate, and the plate is once again incubated – typically on a rotating platform – to allow secondary antibody to bind. Washing steps are repeated as before.

Next, add the substrate to the plate to see which wells contain your target protein. Cover the plate to protect the reaction from light, and then after a brief incubation, halt the reaction with stop solution.

Finally, place your plate in the microplate reader to measure the absorbance or amount of colored solution, in each well. You will need to select which wells you want the reader to analyze. When the instrument is finished reading the plate, a readout of the absorbance for each well will be displayed.

It is important to note that each ELISA kit has a detection limit. That is, only protein concentrations above and below specific limits can be accurately determined. Very small concentrations of protein are usually too close to the background levels of non-specific staining, while very high concentrations may indicate that excess protein or antibody was not properly washed away in that sample well.

So why might you perform an ELISA? Let’s take a look at a few common applications.

Probably the most common type of ELISA performed is the sandwich ELISA.

In a sandwich ELISA, a 96-well plate is coated first with a primary antibody that recognizes the target protein of interest.

In this experiment, cell culture media harvested from human antibody-producing cell lines, were plated by an automated system onto 96-well plates pre-coated with a primary antibody that recognizes human antibodies.

After washing away the excess sample with PBS, an enzyme-linked secondary antibody is added, followed by a colorimetric substrate.

The absorbance is then measured in the same way as for a typical ELISA. For example, in this experiment, this ELISA data will be used to determine which cell lines produce the human antibody with the highest affinity for – that is best ability to bind accurately to – its target antigen.

The over-the-counter pregnancy test is one type of sandwich ELISA.

When the potentially pregnant woman’s urine is added to the test, enzyme-linked primary antibodies attached to the test will bind the pregnancy hormone hCG if it is present. If the woman is pregnant, a substrate-enyzme reaction will occur when the primary antibodies are recognized by substrate-bound secondary antibodies at the test site, and a colored line will appear.

Another type of ELISA is the competitive ELISA, which can be used to detect the presence of antibodies.

If the antibodies of interest are present in the sample, they will bind to the target protein attached to the bottom of the plate. Later, when enzyme-linked detection antibodies are added to the plate, the enzyme-linked antibodies will find few to no proteins to bind; they will have been “out-competed” by the antibodies of interest in the experimental sample.

In a competitive ELISA, then, the colored wells indicate the samples that actually do not contain the antibody of interest! Patient plasma samples are typically run in a competitive ELISA in order to determine if antibodies for certain pathogens, like the HIV virus, are present in the sample.

You’ve just watched JoVE introduction to performing an ELISA. In this video we reviewed: what an ELISA is and how it works; what equipment and reagents you will need to perform and ELISA; and some different applications of the assay. Thanks for watching, and remember not to let your substrate overdevelop!