2.8: El método de ELISA

El ELISA, o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas, es un método ampliamente utilizado para determinar la presencia o ausencia de una proteína diana específica.

A través de una serie de pasos de lavado y unión, un anticuerpo conjugado, o vinculado, a una enzima reconocerá una proteína objetivo en el fondo de una placa de 96 pocillos. Cuando se añade sustrato a la muestra, se producirá una reacción enzimática que provocará un cambio de color que permite la identificación y cuantificación de la proteína objetivo.

Antes de hablar de cómo realizar un ELISA, vamos a familiarizarnos con el equipo y los reactivos que necesitará.

La configuración para una reacción ELISA suele ser una placa de fondo plano de 96 pocillos. Los fondos planos de los pocillos ayudarán a facilitar una distribución uniforme de la muestra experimental, así como de los anticuerpos de captura y detección.

Los ELISA detectan la presencia de proteínas diana específicas en soluciones acuosas experimentales. La orina, los medios de cultivo celular y el suero son muestras experimentales comunes.

En un ELISA, el anticuerpo que se une directamente a la proteína diana es el anticuerpo primario. Tiene una alta afinidad, es decir, una alta capacidad de unirse fuertemente a un epítopo -una región específica- de la proteína diana. Por lo general, el anticuerpo primario no está marcado o no está conjugado.

Como se ha mencionado, los anticuerpos se unen principalmente a sus proteínas diana a través de la unión de alta afinidad a un epítopo específico. Sin embargo, la muestra experimental puede contener fragmentos de células que expresan sitios de unión inespecíficos, sitios que pueden unirse a la región constante, o no específica del epítopo, de los anticuerpos del detector.

Por lo tanto, la adición de un tampón de bloqueo es esencial en un ELISA para cubrir cualquier sitio de unión no específico en sus muestras experimentales. De lo contrario, es posible que se produzcan reacciones enzimáticas en pocillos que no contienen la proteína objetivo, lo que le dará datos falsos positivos.

El anticuerpo secundario en un ELISA es el anticuerpo utilizado para reconocer el anticuerpo primario. Este anticuerpo generalmente se conjuga con una enzima. A veces, el anticuerpo secundario tiene un nombre extraño. Por ejemplo, si el anticuerpo secundario se fabrica, o se cría, en un burro para reconocer un anticuerpo primario criado en una cabra, el anticuerpo secundario se llamaría anticuerpo anti-cabra de burro. Cuando se trata de nombrar anticuerpos secundarios, el primer nombre indica el organismo que produjo el anticuerpo secundario y el segundo nombre representa el organismo que produce el anticuerpo primario.

También se necesitará un sustrato que se una al sitio activo de la enzima unida al anticuerpo secundario. La reacción química que se produce durante esta reacción provoca un cambio de color en el sustrato, que de otro modo sería incoloro. Este ensayo denominado colorimétrico permite identificar y cuantificar la presencia de la proteína diana.

La reacción enzimática continuará mientras haya sustrato disponible. Por lo tanto, después de un breve período de incubación, se agrega a los pocillos una solución de parada, que provoca otro cambio de color para indicar que la reacción se ha detenido.

Se utilizará un lector de microplacas para cuantificar la concentración de la proteína de interés en cada pocillo mediante la lectura de la absorbancia, es decir, la cantidad de producto coloreado, en cada pocillo. La absorbancia es proporcional a la cantidad de proteína objetivo presente.

Ahora que tienes todo tu equipo listo, ¡vamos a ejecutar un ELISA!

Para realizar un ELISA estándar o directo, primero recubra los pocillos de la placa de 96 pocillos con la proteína objetivo de interés diluida en el tampón de recubrimiento. Coloque sus controles positivos y negativos en este momento también.

Después de incubar la placa recubierta el tiempo suficiente para que la proteína tenga tiempo de adsorberse por completo, o adherirse, al fondo de la placa, descargue el exceso de solución de recubrimiento con un rápido movimiento de muñeca.

A continuación, bloquee cualquier posible señal de enlace no específica o de fondo incubando cada pocillo en el tampón de bloqueo.

Ahora descargue el tampón de bloqueo y lave los pocillos con una breve incubación a temperatura ambiente en solución salina tamponada con fosfato, o PBS, y BSA al 1%.

Mientras se enjuagan los pocillos con PBS, prepare diluciones de una concentración conocida de la proteína objetivo para crear una curva estándar. La absorbancia de los pocillos de curva estándar, que contienen concentraciones conocidas de la proteína objetivo, se utilizará para calcular la concentración de la proteína objetivo en los pocillos de muestra experimentales sobre la base de una comparación de la absorbancia de los pocillos de muestra con la absorbancia de los pocillos de curva estándar.

¡Ahora es el momento de agregar la detección o anticuerpo primario!

A continuación, la placa se incuba, normalmente a temperatura ambiente, para permitir que una cantidad suficiente de anticuerpo se una a la proteína diana para su posterior detección y cuantificación.

Después de esta incubación, se elimina el exceso de anticuerpos y los pocillos se lavan brevemente con PBS.

A continuación, se añade un anticuerpo secundario a la placa y la placa se incuba de nuevo. normalmente en una plataforma giratoria ? para permitir que el anticuerpo secundario se una. Los pasos de lavado se repiten como antes.

A continuación, agregue el sustrato a la placa para ver qué pocillos contienen su proteína objetivo. Cubra la placa para proteger la reacción de la luz y luego, después de una breve incubación, detenga la reacción con una solución de parada.

Finalmente, coloque su placa en el lector de microplacas para medir la absorbancia o la cantidad de solución coloreada, en cada pocillo. Deberá seleccionar los pozos que desea que el lector analice. Cuando el instrumento termine de leer la placa, se mostrará una lectura de la absorbancia de cada pocillo.

Es importante tener en cuenta que cada kit ELISA tiene un límite de detección. Es decir, solo se pueden determinar con precisión las concentraciones de proteínas por encima y por debajo de los límites específicos. Las concentraciones muy pequeñas de proteína suelen estar demasiado cerca de los niveles de fondo de tinción inespecífica, mientras que las concentraciones muy altas pueden indicar que el exceso de proteína o anticuerpo no se eliminó adecuadamente en ese pozo de muestra.

Entonces, ¿por qué debería realizar un ELISA? Echemos un vistazo a algunas aplicaciones comunes.

Probablemente el tipo más común de ELISA que se realiza es el ELISA sándwich.

En un ELISA sándwich, una placa de 96 pocillos se recubre primero con un anticuerpo primario que reconoce la proteína objetivo de interés.

En este experimento, los medios de cultivo celular recolectados de líneas celulares productoras de anticuerpos humanos fueron sembrados por un sistema automatizado en placas de 96 pocillos pre-recubiertas con un anticuerpo primario que reconoce los anticuerpos humanos.

Después de lavar el exceso de muestra con PBS, se añade un anticuerpo secundario ligado a una enzima, seguido de un sustrato colorimétrico.

A continuación, se mide la absorbancia de la misma manera que para un ELISA típico. Por ejemplo, en este experimento, estos datos de ELISA se utilizarán para determinar qué líneas celulares producen el anticuerpo humano con mayor afinidad por ? que es la mejor capacidad de vincular con precisión a ? su antígeno diana.

La prueba de embarazo de venta libre es un tipo de ELISA sándwich.

Cuando la orina de la mujer potencialmente embarazada se agrega a la prueba, los anticuerpos primarios ligados a enzimas unidos a la prueba se unirán a la hormona del embarazo hCG si está presente. Si la mujer está embarazada, se producirá una reacción sustrato-enzima cuando los anticuerpos primarios sean reconocidos por los anticuerpos secundarios unidos al sustrato en el sitio de prueba, y aparecerá una línea de color.

Otro tipo de ELISA es el ELISA competitivo, que se puede utilizar para detectar la presencia de anticuerpos.

Si los anticuerpos de interés están presentes en la muestra, se unirán a la proteína diana unida a la parte inferior de la placa. Más tarde, cuando se agregan anticuerpos de detección ligados a enzimas a la placa, los anticuerpos ligados a enzimas encontrarán pocas o ninguna proteína para unirse; ellos habrán sido ?superados en competencia? por los anticuerpos de interés en la muestra experimental.

Por lo tanto, en un ELISA competitivo, los pocillos coloreados indican las muestras que en realidad no contienen el anticuerpo de interés. Por lo general, las muestras de plasma de los pacientes se analizan en un ELISA competitivo para determinar si hay anticuerpos contra ciertos patógenos, como el virus del VIH, en la muestra.

Acabas de ver la introducción de JoVE a la realización de un ELISA. En este vídeo repasamos: qué es un ELISA y cómo funciona; qué equipo y reactivos necesitará realizar y ELISA; y algunas aplicaciones diferentes del ensayo. ¡Gracias por mirar, y recuerda no dejar que tu sustrato se desarrolle demasiado!