Purificación de plásmidos

Plasmid Purification

JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Plasmid Purification

2.2: Gel Purification

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08:16 min

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February 01, 2013

Overview

Purificación del plásmido es una técnica utilizada para aislar y purificar ADN de plásmido de ADN genómico, las proteínas, los ribosomas y la pared celular bacteriana. Un plásmido es un pequeño, circular, doble cadena de ADN que se utiliza como transportador de moléculas de ADN específicas. Cuando se introduce en un organismo anfitrión a través de la transformación, un plásmido se replicarán, creando numerosas copias del fragmento de DNA en estudio.

En este video, se describe un procedimiento generalizado paso a paso de cómo realizar la purificación del plásmido. Purificación del plásmido incluye tres pasos básicos: crecimiento del cultivo bacteriano, cosecha y lisis de las bacterias y purificación del plásmido ADN. El video contiene una explicación donde puede encontrarse el plásmido en cada paso del protocolo y cuantitativamente y cualitativamente analizar ADN de plásmido con un espectrofotómetro o gel de electroforesis. Existen diferentes tipos de plásmido purificación los métodos disponibles, que están orientados a la producción deseada, número de copias del plásmido y volumen de cultivo bacteriano.

Procedure

Los plásmidos son moléculas de ADN extra cromosómicas, circular y en biología molecular que actúan como portadores o vectores, para un ADN específico del fragmento. Las bacterias se utilizan para replicar plásmidos, por lo que el ADN de interés es producido en masa. El proceso por el cual los investigadores obtención plásmidos de bacterias se denomina purificación del plásmido, que se explica en este video.

Obviamente, implica la purificación del plásmido purificación de plásmidos, pero ¿qué significa eso exactamente? Para purificar plásmidos, deben ser aislados desde el cromosoma bacteriano, las proteínas, la membrana bacteriana y los ribosomas bacterianos.

Aunque muchos kits diferentes existen para la purificación de plásmidos, el principio básico detrás de purificación del plásmido sigue siendo el mismo para todos. En primer lugar, la Colonia bacteriana seleccionada se cultiva en un medios de cultivo adecuados que contiene los antibióticos correctos. Gracias a un gen de resistencia a los antibióticos, codificado por el plásmido, solamente las bacterias que contienen el plásmido crecerán en este medio. Las bacterias son cosechadas y lisis bajo un pH alto. El pH es neutralizado, se agrega sal y luego la mezcla se hace girar hacia abajo para quitar escombros y ADN genómico.

Lisado de células neutralizados se agrega en una columna de sílice. DNA plasmídico se cree que se adhieren a la columna por medio de un mecanismo llamado intercambio de anión, donde el ADN, un anión fuerte, se une a la columna carga negativa por medio de un puente de sal de catión. Otro material de lisado, como las proteínas, se lavan a través de la columna con tampones sal alta. Por último, plásmido purificado se libera de la columna cuando se agrega un tampón salino bajo interrumpir el puente de sal.

Para este procedimiento, se deben usar una bata de laboratorio, guantes desechables y gafas de protección.

Las culturas bacterianas, que se transforman con el ADN de plásmido deseado, deben cultivarse durante la noche en medios de cultivo con antibiótico apropiado en una 37 º C agitando la incubadora.

Al día siguiente, la cultura de las bacterias es peleteada por centrifugación y el sobrenadante se elimina. Se resuspendió el sedimento restante en tampón de lisis.

Una vez suspendidas, las bacterias pueden transferirse a un tubo más pequeño donde se añade tampón de lisis. Tampón de lisis tiene un pH alto y contiene detergentes, tales como dodecil sulfato de sodio, que rompen las membranas bacterianas, así lisis de la bacteria. La solución girará con la adición del buffer de lisis y después de mezclar la solución se vuelve más claro. La mezcla no debe agitarse debido a la posibilidad de distorsionar o romper el ADN genómico, aparte, que luego podría contaminar la purificación de DNA plasmídico.

Luego, se añade tampón de neutralización para neutralizar las condiciones alcalinas y bajar el pH. Con suave mezcla de ADN genómico así como cualquier proteínas atadas precipita, mientras plásmido que ADN permanece en solución. Una vez más evitar Vortex, así como sus plásmidos están libres de contaminación de ADN genómica.

Luego se centrifuga la mezcla y el precipitado de ADN/proteínas genomic es peleteado. El sobrenadante contiene el DNA del plasmid como proteínas solubles.

Este sobrenadante se coloca sobre la columna por decantación, un nombre de fantasia para verter apagado o pipeteando. Los pellets pueden ser desechados.

Siguiente, alto sal tampón de lavado pasa a través de la columna mientras que el ADN permanece ligado a la sílice. Repetir pasos con tampón salino alto elimina enzimas, RNA, proteínas, colorantes y las impurezas de bajo peso molecular que se lava. El flujo a través de los pasos de lavado deben ser desechado. Después de que el paso de lavado final Asegúrese de que el filtro esté completamente seco sin cualquier buffer restante. El DNA de plásmido se encuentra todavía en el filtro.

El ADN plásmido es eluted con agua estéril o con un tampón de elución. El ADN está disponible para su uso inmediato en una amplia gama de aplicaciones.

Hay un número de maneras para verificar la pureza de plásmidos después de la purificación. Un espectrómetro puede ser usado para comparar absorbancia a diferentes longitudes de onda para determinar la concentración de ADN plásmido. Un análisis de gel de agarosa del plásmido purificado puede determinar si el plásmido es el tamaño correcto y no hay contaminantes. Este paso asegura que no hay ninguna contaminación de DNA genómica y el plásmido no se modificó en las bacterias.

El procedimiento de purificación del plásmido puede ser modificado para acomodar tamaños de diferentes plásmidos, número de copias, volumen de la cultura y puede incluir diferentes equipos para los pasos vinculantes, lavado y elución. Rendimiento pasa a ser una de las distinciones más importantes entre las preparaciones de plásmidos y se dividen a menudo en el minipreparation, o miniprep el midiprep, un maxiprep y megaprep según el rendimiento deseado.

En términos de aplicaciones posteriores, un procedimiento que comúnmente sigue la purificación del plásmido es la transfección, que consiste en la introducción de ADN plásmido en las células eucariotas. A menudo el objetivo de un experimento de transfección es visualizar la estructura de las células y tejidos con proteínas de reportero, tales como etiquetado de las neuronas en las imágenes que ves aquí.

A veces múltiples plásmidos purificados por varias preparaciones de purificación pueden introducirse en la misma bacteria, reproduciendo así un camino biosintético del todo a través de la producción de una serie de enzimas codificadas por la plásmidos. El resultado final es la producción de un compuesto complejo, como el antibiótico que ver aquí, por la célula.

Plásmidos purificados pueden ser reintroducidos en las bacterias, en orden de generar grandes cantidades de la proteína codificada por el plásmido. Aquí puede ver las células bacterianas se homogeneizó y lisis antes de una técnica llamada purificación de afinidad puede realizarse para aislar la proteína diana. Proteico purificado se cristaliza y luego identifica su estructura.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a la purificación del plásmido. En este video hablamos de los principios básicos detrás de este método, la descripción paso a paso y un puñado de aplicaciones de su preparación de plásmido. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

Plasmids are circular, extra chromosomal, DNA molecules and in molecular biology they act as carriers, or vectors, for a specific DNA fragment. Bacteria are used to replicate plasmids, so that your DNA of interest is mass-produced. The process by which researchers obtain plasmids from bacteria is called plasmid purification, which will be explained in this video.

Obviously, plasmid purification involves purifying plasmids, but what does that mean exactly? To purify plasmids, they must be isolated from the bacterial chromosome, proteins, the bacterial membrane, and bacterial ribosomes.

Though many different kits exist for purifying plasmids, the basic principle behind plasmid purification remains the same for all. First, the selected bacterial colony is grown in an appropriate culture media that contains the correct antibiotics. Thanks to an antibiotic resistance gene, encoded by the plasmid, only bacteria containing the plasmid will grow in this media. The bacteria are harvested and lysed under a high pH. The pH is neutralized, salt is added, and then the mixture is spun down to remove debris and genomic DNA.

Neutralized cell lysate is added onto a silica column. Plasmid DNA is believed to adhere to the column via a mechanism called anion exchange, where DNA, a strong anion, binds to the negatively charged column via a cation salt bridge. Other material from the lysate, such as proteins, are washed through the column with high salt buffers. Finally, purified plasmid is released from the column when a low salt buffer is added disrupting the salt bridge.

For this procedure a lab coat, disposable gloves and protective goggles should be worn.

The bacterial cultures, which are transformed with the desired plasmid DNA, should be grown overnight in growth media with appropriate antibiotic in a 37°C shaking incubator.

The next day, the bacteria culture is pelleted by centrifugation and the supernatant is removed. The remaining pellet is resuspended in lysis buffer.

Once resuspended, bacteria can be transferred to a smaller tube where lysis buffer is added. Lysis buffer has a high pH and contains detergents, such as sodium dodecyl sulfate, which disrupt the bacterial membranes, thereby lysing the bacteria. The solution will turn cloudy with the addition of the lysis buffer and after mixing the solution becomes more clear. The mixture should not be vortexed due to the possibility of shearing, or breaking apart, genomic DNA, which could then contaminate plasmid DNA purification.

Then, neutralization buffer is added to neutralize the alkaline conditions and lower the pH. With gentle mixing genomic DNA as well as any proteins bound to it will precipitate, while plasmid DNA will stay in solution. Once again avoid vortexing, so as your plasmids are free of genomic DNA contamination.

The mixture is then centrifuged and the genomic DNA/protein precipitate is pelleted. The supernatant contains the plasmid DNA as well as soluble proteins.

This supernatant is placed onto the column by decanting, a fancy name for pouring it off, or pipetting. The pellet can be discarded.

Next, high salt washing buffer passes through the column while the DNA remains bound to the silica. Repeated washing steps with high salt buffer removes endonucleases, RNA, proteins, dyes, and low-molecular weight impurities. The flow-through of the wash steps should be discarded. After the final washing step make sure the filter is completely dry without any buffer remaining. The plasmid DNA is still located on the filter.

The plasmid DNA is eluted with sterile water or an elution buffer. The DNA is readily available for immediate use in a wide range of applications.

There are a number of ways to verify the purity of plasmids after purification. A spectrometer can be used to compare absorbance at different wavelengths to determine the concentration of plasmid DNA. An agarose gel analysis of the purified plasmid can determine if the plasmid is the correct size and there are no contaminants. This step ensures there is no genomic DNA contamination and the plasmid was not modified in bacteria.

The plasmid purification procedure can be modified to accommodate different plasmid sizes, copy number, culture volume, and can include different equipment for the binding, washing, and elution steps. Yield happens to be one of the most prominent distinctions between plasmid preparations and they are often divided into the minipreparation, or miniprep, the midiprep, a maxiprep, and a megaprep depending on the yield desired.

In terms of downstream applications, one procedure that commonly follows plasmid purification is transfection, which involves the introduction of plasmid DNA into eukaryotic cells. Often the goal of a transfection experiment is to visualize the structure of cells and tissues with reporter proteins, such as those labeling the neurons in the images you see here.

Sometimes multiple plasmids purified by several purification preps can be introduced into the same bacteria, thereby reproducing an entire biosynthetic pathway through the production of a number of enzymes encoded by the plasmids. The end result is the manufacturing of a complex compound, like the antibiotic you see here, by the cell.

Purified plasmids may be reintroduced into bacteria, in order generate large amounts of protein encoded by the plasmid. Here you see bacterial cells being homogenized and lysed before a technique called affinity purification can be performed to isolate the target protein. Purified protein is crystallized and its structure then identified.

You’ve just watched JoVE’s introduction to plasmid purification. In this video we discussed the basic principles behind this method, its step by step description, and a handful of applications of your plasmid prep. As always, thanks for watching!