Purificación del gel

Gel Purification

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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Gel Purification

2.9: Plasmid Purification

2.11: The Western Blot

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06:30 min

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April 30, 2023

Overview

Purificación del gel se utiliza para recuperar los fragmentos de ADN después de la separación electroforética. Recuperación de ADN de un gel de agarosa incluye tres pasos básicos: encuadernación, lavado y liberador de una columna de sílice. ADN se cree que se unen a la sílice en presencia de sal alta a través de un puente de sal. Siguiendo el enlace, ADN es lavado de impurezas y eluyen condiciones bajo sal interrumpir esta interacción.

Este video va a través de un procedimiento generalizado, paso a paso de cortar una banda de gel, gel de solubilización, purificación mediante el enlace a una columna de sílice y la elución de DNA purificado. Además, la presentación discute varios consejos para asegurar la purificación del gel de éxito, incluyendo la importancia de correr un gel de agarosa con un marcador o una escalera que tiene ADN de tamaño conocido.

Procedure

Gel-purificación es un procedimiento estándar para recuperar deseados fragmentos de ADN de geles de agarosa después de la separación electroforética. Después de disolver el fragmento de gel y ejecutar a través de un filtro especializado, este procedimiento produce ADN liberado de impurezas tales como sales, nucleótidos libres y las enzimas, convenientes para los usos aguas abajo.

El principio básico detrás de recuperación de la DNA del gel de agarosa consiste en una secuencia de bind, lave y eluir pasos. Una vez que el gel es en tampón de solubilización, se aplica en una “columna de spin”, que, tras centrifugación, permite que las moléculas de ADN se unen selectivamente a un filtro de sílice mientras las impurezas fluyen a través de un tubo de recogida.

El ADN es capaz de enlazar a gracias a una alta concentración de sal en el tampón de solubilización de gel de sílice. Este buffer se cree que alteran la estructura de hidratación alrededor del filtro y crear un puente de sal de catión entre las fuertes cargas negativas en el filtro y cargas negativas en el DNA. Impurezas residuales se eliminan por lavado con etanol.

Agua tampón salino bajo se agrega a la columna y será “responsables” o libre, el ADN, probablemente interrumpiendo el puente de catión. Ahora se purifica el ADN del gel.

El primer paso en el procedimiento de purificación del gel supone echando el gel de agarosa y la realización de electroforesis de las muestras de ADN. Una vez finalizado el plazo de gel, fragmentos de ADN deseados se visualizaron contra la luz UV y fragmentos se seleccionan después de comparar contra un estándar de peso molecular.

Si el gel es sin mancha, la ubicación de la banda puede ser determinada aproximadamente basado en una comparación a la escalera de ADN. Mientras corta el gel con una cuchilla de afeitar, uno debe tener cuidado para recuperar tanto ADN como posible con agarosa poco como sea posible.

Cuando manejo de bromuro de etidio manchados geles y trabajo frente a la luz UV, deben usarse guantes y gafas protectoras. Después de cortar el ADN deseado del gel, eliminar el buffer gel y funcionando correctamente, en cumplimiento de protocolos de seguridad institucional.

Una vez aislado, el trozo de gel se coloca en un tubo de microcentrífuga y pesó en una balanza. Utilizando la aproximación que 100 mg de gel ocupa 100 l, un volumen de buffer de solublilization que es 4 X que el peso del gel se añade a la pieza de gel. Después de ser colocados en buffer, la pieza de gel se incuba en alrededor de 50 ° C para fundir la agarosa.

Una vez derretido, se añade el gel solubilizado en una columna de spin y la solución se centrifugó, que hará que todo el ADN y otras partículas para pegarse al filtro.

A continuación, se lava el ADN dependiente mediante la adición de etanol al 70%, seguido por centrifugación, que eliminará las impurezas residuales del filtro del filtro. Flujo a través es descartado, y este paso de lavado generalmente entonces se repite hasta tres veces. El filtro de vacío se hace girar otra vez para eliminar el etanol residual, y el filtro de sílice se deja secar a temperatura ambiente. Agua o elución de búfer se añade al filtro, y con otra ronda de centrifugación, el ADN purificado se recoge en la parte inferior del tubo.

El método que has visto sólo se aplica a gel de purificación con filtros de sílice spin columna. Existen otros métodos que hacen uso de los mismos principios básicos de unión del ADN a sílice seguido de pasos de lavado y elución. Por ejemplo, sílice se puede mezclar con ADN en suspensión llamada “glassmilk”, que puede ser peleteado y lavado y eluyen más adelante. También, puede utilizarse succión ADN a través de filtros de sílice y, posteriormente, procederá a la elución lo. Asegúrese de entender procesos de purificación de gel de su laboratorio.

Ahora que usted ha aprendido cómo recuperar ADN de geles de agarosa, examinemos algunas aplicaciones posteriores que utilizan DNA obtenida de la purificación del gel.

Por ejemplo, la purificación del gel es un paso intermedio en la inmunoprecipitación de cromatina, una técnica que pretende aislar las proteínas reguladoras que paquete de ADN genómico, con el fin de identificar que las secuencias están siendo reguladas. Los fragmentos aislados son gel purificado y secuenciado, con el fin de asignar a las regiones de cromosomas individuales.

Subcloning – el proceso de mover un gen en un vector a otro – puede implicar la purificación del gel. Por ejemplo, las secuencias del gene de un vector pueden ser digeridas de una construcción y montadas en secuencias quiméricas vía PCR, después de lo cual son gel purificado y en otras construcciones.

Quizás la aplicación más simple de purificación del gel es su uso después de almacenamiento a largo plazo en el ° c-80 de ADN suprimido las bandas después de electroforesis.

Ahora han aprendido a extraer ADN fragmentos de gel de agarosa, las variaciones de bind, lavar y eluir los procedimientos seguidos según la preferencia de usuario individual y finalmente algunas de las posibles aplicaciones posteriores de este método. Como siempre, gracias por ver.

Transcript

Gel-purification is a standard procedure performed to recover desired DNA fragments from agarose gels after electrophoretic separation. After dissolving the gel fragment and running it through a specialized filter, this procedure yields DNA freed from impurities such as salts, free nucleotides and enzymes, suitable for downstream applications.

The basic principle behind DNA recovery from agarose gel involves a sequence of bind, wash, and elute steps. Once the gel is in solubilizing buffer, it is applied onto a “spin column,” which, upon centrifugation, allows DNA molecules to selectively bind to a silica-filter while the impurities flow through into a collection tube.

DNA is able to bind to silica thanks to a high salt concentration in the gel solubilization buffer. This buffer is believed to disrupt the hydration structure around the filter and create a cation salt bridge between the strong negative charges on the filter and negative charges on the DNA. Residual impurities are removed by washing with ethanol.

Water or low salt buffer is added to the column and will “elute,” or free, the DNA from it, presumably by disrupting the cation bridge. The DNA is now purified from the gel.

The first step in the gel purification procedure involves casting the agarose gel and performing electrophoresis of the DNA samples. Once the gel-run is complete, desired DNA fragments are visualized against UV light and fragments are selected after comparing against a molecular weight standard.

If the gel is unstained, the band location can be approximately determined based on a comparison to the DNA ladder. While cutting the gel with a razor blade, one must take care to recover as much DNA as possible with as little agarose as possible.

When handling ethidium bromide stained gels and working in front of UV light, gloves and protective eyewear should be used. After cutting the desired DNA from the gel, dispose of the gel and running buffer properly, in compliance with institutional safety protocols.

Once isolated, the piece of gel is placed in a microfuge tube and weighed on a balance. Using the approximation that 100 mg of gel occupies 100 l, a volume of solublilization buffer that is 4X the gel weight is added to the gel piece. After being placed in buffer, the gel piece is incubated at around 50 C to melt the agarose.

Once melted, the solubilized gel is added onto a spin column and the solution is centrifuged, which will cause all of the DNA and other particulates to stick to the filter.

Next, the bound DNA is washed by adding 70% ethanol to the filter, followed by centrifugation, which will remove residual impurities from the filter. Flow through is discarded, and this washing step is then generally repeated up to three times. The empty filter is spun again to remove residual ethanol, and the silica filter is allowed to dry at room temperature. Water or elution buffer is added to the filter, and with another round of centrifugation, purified DNA is collected in the bottom of the tube.

The method you’ve just seen applies to gel purification with silica spin column filters. Other methods exist that make use of the same basic principles of DNA binding to silica followed by washing and elution steps. For example, silica can be mixed with DNA in a suspension called “glassmilk,” which can be pelleted and washed, and later eluted. Also, suction can be used to pull DNA through silica filters and, later, elute it. Be sure to understand your lab’s gel purification procedures.

Now that you have learned how to recover DNA from agarose gels, let us examine a few downstream applications that use DNA obtained from gel-purification.

For example, gel-purification is an intermediate step in Chromatin Immunoprecipitation, a technique that aims to isolate the regulatory proteins that bundle genomic DNA, in order to identify which sequences are being regulated. The isolated fragments are gel-purified and sequenced, in order to be mapped onto the individual chromosome regions.

Subcloning – the process of moving a gene in one vector to another – can involve gel purification. For example, gene sequences from one vector can be digested from one construct, and assembled into chimeric sequences via PCR, after which they are gel purified and put into other constructs.

Perhaps the simplest application of gel-purification is its use after long-term storage at -80 ˚C of excised DNA bands following electrophoresis.

You have now learned how to extract DNA fragments from agarose gel, the variations of bind, wash, and elute procedures followed as per individual user-preference, and finally some of the possible downstream applications of this method. As always, thank you for watching.