Introducción a la transfección

An Introduction to Transfection

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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

An Introduction to Transfection

2.2: Gel Purification

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07:28 min

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February 01, 2013

Overview

La transfección es el proceso de inserción de material genético, como el DNA y el RNA trenzado doble, en células de mamíferos. La inserción de ADN en una célula permite la expresión, o la producción de proteínas utilizando la maquinaria propia de células, mientras que la inserción de ARN en una célula se utiliza abajo-para regular la producción de una proteína específica deteniendo la traducción. Mientras que el sitio de acción transfected RNA es el citoplasma, ADN debe ser transportado al núcleo para transfección eficaz. Allí, el ADN puede expresarse transitoriamente por un período corto de tiempo, o ser incorporado en la DNA genomic, donde el cambio se pasa de célula a célula como divide.

Este video describe los conceptos básicos detrás de química mediadas transfecciones y presenta algunos de los reactivos más comúnmente utilizadas, como cargados lípidos, polímeros, fosfato de calcio. Se describe cada paso de la preparación de las células para la transfección a través del análisis de eficiencia de transfección. Además, la sección de aplicaciones de este artículo de video describe el uso de electroporación y una transfección biolística como métodos alternativos para introducir ácidos nucleicos en células de mamíferos. También describe un uso avanzado de la transfección donde co transfección de interferencia RNA y DNA se introduce como una forma abajo-para regular una proteína que ocurre naturalmente mientras que al mismo tiempo producir una variante mutante de la misma dentro de la misma célula.

Procedure

La transfección es el proceso de inserción de material genético, como el DNA y el RNA trenzado doble, en células de mamíferos. La inserción de DNA permite la expresión, o la producción de proteínas utilizando la maquinaria propia de las células. Considerando que la inserción de ARN de doble cadena se utiliza para cerrar la producción de una proteína específica deteniendo la traducción. Esta poderosa herramienta ha permitido a los investigadores estudian mejor función genética y expresión, función de la proteína y mutaciones genéticas.

No reactivo de transfección simple o método funciona para todos los tipos de la célula. Afortunadamente, muchos métodos y reactivos se han desarrollado en las últimas décadas para facilitar la transfección de una amplia variedad de células. Estos métodos se pueden dividir en dos grandes grupos: químicos y físicos transfecciones.

En este video, nos centraremos en los diferentes sistemas de administración química, como se han vuelto cada vez más común en los últimos años. Estos métodos incluyen enfoques basados en lípidos, fosfato de calcio mediada por transfección y el uso de polímeros catiónicos para nombrar unos pocos.

El principio subyacente de todos los métodos de transfección química son similares. Todos ellos hacen uso tan complejas de moléculas de portador de carga positiva con ácidos nucleicos para paquete para entrega celular. Estas moléculas de portador superan la carga negativa de la barrera de la membrana de la célula que les permite pasar a través de la membrana para ofrecer sus contenidos.

Transfección de lípidos, lípidos catiónicos forman un liposoma que luego combina con los ácidos nucleicos para formar una “complejo de transfección”. Mientras que el fosfato de calcio simplemente se condensa el ADN y le da una carga positiva neta. Además, polímeros catiónicos como polyetheleneimine condensan el ADN en partículas con carga positiva.

El siguiente paso en la química de la transfección mediada es accesorio de los complejos cargados positivamente a la membrana celular cargada negativamente por simple atracción electrostática.

Entonces, el complejo entra en la célula mediante endocitosis – un proceso por el cual moléculas de entrar en la célula a través de membrana-limite las vesículas llamadas endosomas.

Una vez dentro de la célula, los ácidos nucleicos debe escapar de la endosome por un proceso que aún se desconoce. Una vez fuera el endosome, los ácidos nucleicos se encuentran en el citoplasma de la célula y en última instancia el núcleo, donde maquinaria de la célula es capaz de hacer de mRNA y proteína de él. El citoplasma es el sitio de acción de la ARN interferente pequeño o siRNA donde se reduce la producción de proteínas por interferir con una parte de la maquinaria de producción de proteína de la célula.

Puede existir DNA transfected estable o transitorio. Transfecciones estables ocurren cuando transfected ADN se introduce en el genoma y por lo tanto persiste como la célula se divide. Transfecciones transitorias ocurren donde el ADN no se incorpora en el genoma y la expresión de la proteína codificada se pierde durante un lapso de 24-96 horas.

La eficiencia de la transfección de ADN generalmente se mide a través de sistemas de reportero que están atados al gen insertado. Son sistemas que pueden ser fácilmente detectados por observar directamente la proteína reportera, como en el caso de la proteína verde fluorescente, o mediante la medición de su actividad enzimática mediante un ensayo colorimétrico, como en el caso de una enzima luciferase reportero. Transfección de ADN estable se mide mejor por análisis genómico como RT-PCR.

Para medir el éxito de siRNA silenciamiento, los niveles de proteínas específicas en cada muestra pueden determinarse por el Immunoblot. SiRNA exitosa transfección debería disminuir la expresión de la proteína diana dentro de las células mientras que los niveles del gen housekeeping, GAPDH, permanecen estables.

Para maximizar la eficiencia de transfección, las células deben mantenerse en crecimiento de la fase de registro y estar entre 40 y 80% confluente, en el momento de la transfección. Para lograr esto, las células en cultivo deben ser cosechadas el día antes… contado… y las semillas en una placa de varios pocillos en una concentración que producirá el nivel correcto de confluencey en el momento de la transfección.

A continuación, los reactivos químicos y los ácidos nucleicos se mezclan y dados tiempo para formar los complejos de ácido nucleico-reactivo. Para cada sistema químico las concentraciones específicas de cada componente deben ser optimizadas.

Los complejos de ácido nucleico-reactivo entonces se agregan a las células plateadas e incubados a menudo durante la noche para dar suficiente tiempo para los complejos unir a las células y el mediato de la transfección. Después de 24 horas, los medios de comunicación deben ser eliminado y reemplazado con medio de cultivo fresco.

Existen muchas variaciones y aplicaciones de la transfección. La transfección puede permitir que un investigador estudiar el efecto de las mutaciones sin sentido en la función de proteínas celulares. Aquí, ARNi fue transfected en las células HeLa para abajo-regulan la proteína BRCA1 endógena, que causa una reducción en el número de células positivas de GFP. Al mismo tiempo una proteína mutante de BRCA1 también era transfectada y producida por la célula. Si la proteína mutada fue completamente funcional causó una recuperación en el número de células positivas de GFP, pero si la mutación afecta negativamente la función, entonces el número de células positivas de GFP se quedó baja.

Como alternativa a los métodos de transfección química, investigador, que se muestra a continuación, utiliza una pistola de genes para disparar partículas de oro con ADN en células en cultivo. Las células que terminan con las pequeñas balas recubierta de ADN dentro de su citoplasma tienen una buena oportunidad para ser transfectadas.

Otro método alternativo para la transfección es electroporación. La electroporación es el uso de corriente eléctrica para dañar la membrana celular permitiendo que la DNA o del RNA entrar en la célula por un corto tiempo antes de que las células tengan tiempo de reparación. Aquí, se colocan electrodos de pinza alrededor de un cerebro de ratón y pulsos cortos de electricidad pasan a través del cerebro para iniciar ex-vivo de la transfección de las moléculas de ARNi inyectadas dentro de la solución azul. Los efectos de silenciamiento en la estructura de la corteza en desarrollo del gen se observa a continuación.

Sólo ha visto video de Zeus de transfección. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA enables the expression, or production, of proteins using the cells own machinery. Whereas insertion of double-stranded RNA is used to shut down the production of a specific protein by stopping translation. This powerful tool has allowed researchers better study gene function and expression, protein function, and genetic mutations.

No single transfection reagent or method works for all cell types. Fortunately, many methods and reagents have been developed in the past few decades to facilitate transfection of a wide variety of cells. These methods can be separated into two main groups: chemical and physical transfections.

In this video, we will focus on the different chemical delivery systems, as they have become increasingly common in recent years. These methods include lipid-based approaches, calcium phosphate mediated transfection, and the use of cationic polymers to name a few.

The underlying principle of all the chemical transfection methods are similar. They all make use positively charged carrier molecules that complex with nucleic acids to package them for cellular delivery. These carrier molecules overcome the negative charge of the cell-membrane barrier which allows them to pass through the membrane to deliver their contents.

In lipid transfection, cationic lipids form a liposome which then combines with nucleic acids to form a “transfection complex”. Whereas calcium phosphate simply condenses the DNA and gives it a net positive charge. Additionally, cationic polymers such as polyetheleneimine condense the DNA into positively charged particles.

The next step in chemical mediated transfection is attachment of the positively charged complexes to the negatively charged cell membrane through simple electrostatic attraction.

Then, the complex enters the cell via endocytosis – a process by which molecules enter the cell via membrane-bound vesicles called endosomes.

Once inside the cell, the nucleic acids must escape from the endosome by a process that is still unknown. Once outside the endosome, the nucleic acids will find themselves in the cell’s cytoplasm and then ultimately the nucleus, where the cell’s machinery is able to make mRNA and then protein from it. The cytoplasm is the site of action for the small interfering RNA, or siRNA where it reduces the production of protein by interfering with a part of the cell’s protein producing machinery.

Transfected DNA can exist either stably or transiently. Stable transfections occur when transfected DNA is introduced into the genome and therefore persists as the cell divides. Transient transfections occur where the DNA is not incorporated into the genome and expression of the coded protein is lost during a span of about 24-96 hours.

The efficiency of DNA transfection is typically measured through reporter systems that are tethered to the inserted gene. These are systems that can be easily detected either by directly observing the reporter protein itself, such as in the case of green fluorescent protein, or by its measuring its enzymatic activity using a colorimetric assay, as in the case of a luciferase enzyme reporter. Stable DNA transfection is best measured by genomic analysis such as RT-PCR.

To measure the success of siRNA silencing, the targeted protein levels in each sample can be determined by Immunoblot. Successful siRNA transfection should decrease the expression of the target protein within the cells while levels of the housekeeping gene, GAPDH, remain stable.

To maximize transfection efficiency, cells should be maintained in log phase growth and be between 40 and 80% confluent, at the time of transfection. In order to accomplish this, cells in culture should be harvested the day before… counted… and seeded into a multi-well plate at a concentration that will yield the correct level of confluencey at the time of transfection.

Next, the chemical reagents and nucleic acids are mixed and given time to form the nucleic acid-reagent complexes. For each chemical delivery system the specific concentrations of each component must be optimized.

The nucleic acid-reagent complexes are then added to the plated cells and incubated often overnight to give plenty of time for the complexes to attach to the cells and mediate transfection. After 24 hours, the media should be removed and replaced with fresh culture media.

Many variations and applications of transfection exist. Co-transfection can allow a researcher to study the effect of missense mutations on the function of cellular proteins. Here, RNAi was transfected into HeLa cells in order to down-regulate the endogenous BRCA1 protein, which causes a reduction in the number of GFP positive cells. At the same time a mutant BRCA1 protein was also transfected and produced by the cell. If the mutated protein was fully functional it caused a recovery in the number of GFP positive cells, but if the mutation negatively affected function, then the number of GFP positive cells stayed low.

As an alternative to chemical transfection methods, a researcher, shown here, uses a gene gun to fire gold particles laced with DNA at cells in culture. Cells that end up with the small DNA coated bullets within their cytoplasm have a good chance for becoming transfected.

Another alternative method for transfection is electroporation. Electroporation is the use of electrical current to damage the cell’s membrane allowing DNA or RNA to enter the cell for a short time before the cells have time to repair. Here, tweezer electrodes are placed around a mouse brain and short pulses of electricity are passed through the brain to initiate ex-vivo transfection of the injected RNAi molecules within the blue solution. The effects of gene silencing on the structure of the developing cortex is then observed.

You’ve just watched JoVE’s video on transfection. As always, thanks for watching!