2.12: Introducción a la transfección

La transfección es el proceso de insertar material genético, como ADN y ARN bicatenario, en células de mamíferos. La inserción de ADN permite la expresión, o producción, de proteínas utilizando la propia maquinaria de las células. Mientras que la inserción de ARN bicatenario se utiliza para detener la producción de una proteína específica al detener la traducción. Esta poderosa herramienta ha permitido a los investigadores estudiar mejor la función y la expresión de los genes, la función de las proteínas y las mutaciones genéticas.

No hay un solo reactivo o método de transfección que funcione para todos los tipos de células. Afortunadamente, en las últimas décadas se han desarrollado muchos métodos y reactivos para facilitar la transfección de una amplia variedad de células. Estos métodos se pueden separar en dos grupos principales: transfecciones químicas y físicas.

En este vídeo, nos centraremos en los diferentes sistemas de administración de productos químicos, ya que se han vuelto cada vez más comunes en los últimos años. Estos métodos incluyen enfoques basados en lípidos, transfección mediada por fosfato de calcio y el uso de polímeros catiónicos, por nombrar algunos.

El principio subyacente de todos los métodos de transfección química es similar. Todos ellos utilizan moléculas portadoras cargadas positivamente que se acomplejan con los ácidos nucleicos para empaquetarlos para su entrega celular. Estas moléculas portadoras superan la carga negativa de la barrera de la membrana celular, lo que les permite pasar a través de la membrana para entregar su contenido.

En la transfección de lípidos, los lípidos catiónicos forman un liposoma que luego se combina con los ácidos nucleicos para formar un "complejo de transfección". Mientras que el fosfato de calcio simplemente condensa el ADN y le da una carga neta positiva. Además, los polímeros catiónicos como la politeleneimina condensan el ADN en partículas cargadas positivamente.

El siguiente paso en la transfección mediada por productos químicos es la unión de los complejos cargados positivamente a la membrana celular cargada negativamente a través de una simple atracción electrostática.

Luego, el complejo ingresa a la célula a través de endocitosis, un proceso por el cual las moléculas ingresan a la célula a través de vesículas unidas a la membrana llamadas endosomas.

Una vez dentro de la célula, los ácidos nucleicos deben escapar del endosoma por un proceso que aún se desconoce. Una vez fuera del endosoma, los ácidos nucleicos se encontrarán en el citoplasma de la célula y, finalmente, en el núcleo, donde la maquinaria de la célula es capaz de producir ARNm y luego proteínas a partir de él. El citoplasma es el sitio de acción del pequeño ARN interferente, o siRNA, donde reduce la producción de proteínas al interferir con una parte de la maquinaria productora de proteínas de la célula.

El ADN transfectado puede existir de forma estable o transitoria. Las transfecciones estables ocurren cuando el ADN transfectado se introduce en el genoma y, por lo tanto, persiste a medida que la célula se divide. Las transfecciones transitorias ocurren cuando el ADN no se incorpora al genoma y la expresión de la proteína codificada se pierde durante un lapso de aproximadamente 24 a 96 horas.

La eficiencia de la transfección de ADN se mide típicamente a través de sistemas reporteros que están atados al gen insertado. Se trata de sistemas que pueden detectarse fácilmente mediante la observación directa de la propia proteína reportera, como en el caso de la proteína fluorescente verde, o mediante la medición de su actividad enzimática mediante un ensayo colorimétrico, como en el caso de una enzima reportera de luciferasa. La transfección estable de ADN se mide mejor mediante análisis genómicos como la RT-PCR.

Para medir el éxito del silenciamiento de siRNA, los niveles de proteínas objetivo en cada muestra se pueden determinar mediante Immunoblot. La transfección exitosa de siRNA debería disminuir la expresión de la proteína objetivo dentro de las células, mientras que los niveles del gen de limpieza, GAPDH, permanecen estables.

Para maximizar la eficiencia de la transfección, las células deben mantenerse en crecimiento en fase logarítmica y estar entre un 40 y un 80% confluentes en el momento de la transfección. Para lograr esto, las células en cultivo deben recolectarse el día anterior. ¿contado? y se siembra en una placa de múltiples pocillos a una concentración que producirá el nivel correcto de confluencia en el momento de la transfección.

A continuación, los reactivos químicos y los ácidos nucleicos se mezclan y se les da tiempo para formar los complejos de ácido nucleico y reactivo. Para cada sistema de suministro de productos químicos, se deben optimizar las concentraciones específicas de cada componente.

A continuación, los complejos de ácido nucleico y reactivos se añaden a las células en placa y se incuban a menudo durante la noche para dar tiempo suficiente a los complejos para que se adhieran a las células y medien en la transfección. Después de 24 horas, el medio debe retirarse y reemplazarse con un medio de cultivo nuevo.

Existen muchas variaciones y aplicaciones de la transfección. La co-transfección puede permitir a un investigador estudiar el efecto de las mutaciones de cambio de sentido en la función de las proteínas celulares. Aquí, el ARNi se transfectó en células HeLa con el fin de regular a la baja la proteína BRCA1 endógena, lo que provoca una reducción en el número de células GFP positivas. Al mismo tiempo, una proteína BRCA1 mutante también fue transfectada y producida por la célula. Si la proteína mutada era completamente funcional, causaba una recuperación en el número de células GFP positivas, pero si la mutación afectaba negativamente a la función, entonces el número de células GFP positivas se mantenía bajo.

Como alternativa a los métodos de transfección química, un investigador, que se muestra aquí, utiliza una pistola genética para disparar partículas de oro mezcladas con ADN a las células en cultivo. Las células que terminan con las pequeñas balas recubiertas de ADN dentro de su citoplasma tienen una buena oportunidad de ser transfectadas.

Otro método alternativo para la transfección es la electroporación. La electroporación es el uso de corriente eléctrica para dañar la membrana de la célula, permitiendo que el ADN o el ARN ingresen a la célula por un corto tiempo antes de que las células tengan tiempo de repararse. Aquí, se colocan electrodos de pinza alrededor del cerebro de un ratón y se pasan pulsos cortos de electricidad a través del cerebro para iniciar la transfección ex vivo de las moléculas de ARNi inyectadas dentro de la solución azul. A continuación, se observan los efectos del silenciamiento génico en la estructura de la corteza en desarrollo.

Acabas de ver el video de JoVE sobre la transfección. Como siempre, ¡gracias por mirar!