Introducción a la transfección
La transfección es el proceso de inserción de material genético, como el DNA y el RNA trenzado doble, en células de mamíferos. La inserción de ADN en…
La transfección es el proceso de inserción de material genético, como el DNA y el RNA trenzado doble, en células de mamíferos. La inserción de DNA permite la expresión, o la producción de proteínas utilizando la maquinaria propia de las células. Considerando que la inserción de ARN de doble cadena se utiliza para cerrar la producción de una proteína específica deteniendo la traducción. Esta poderosa herramienta ha permitido a los investigadores estudian mejor función genética y expresión, función de la proteína y mutaciones genéticas.
No reactivo de transfección simple o método funciona para todos los tipos de la célula. Afortunadamente, muchos métodos y reactivos se han desarrollado en las últimas décadas para facilitar la transfección de una amplia variedad de células. Estos métodos se pueden dividir en dos grandes grupos: químicos y físicos transfecciones.
En este video, nos centraremos en los diferentes sistemas de administración química, como se han vuelto cada vez más común en los últimos años. Estos métodos incluyen enfoques basados en lípidos, fosfato de calcio mediada por transfección y el uso de polímeros catiónicos para nombrar unos pocos.
El principio subyacente de todos los métodos de transfección química son similares. Todos ellos hacen uso tan complejas de moléculas de portador de carga positiva con ácidos nucleicos para paquete para entrega celular. Estas moléculas de portador superan la carga negativa de la barrera de la membrana de la célula que les permite pasar a través de la membrana para ofrecer sus contenidos.
Transfección de lípidos, lípidos catiónicos forman un liposoma que luego combina con los ácidos nucleicos para formar una "complejo de transfección". Mientras que el fosfato de calcio simplemente se condensa el ADN y le da una carga positiva neta. Además, polímeros catiónicos como polyetheleneimine condensan el ADN en partículas con carga positiva.
El siguiente paso en la química de la transfección mediada es accesorio de los complejos cargados positivamente a la membrana celular cargada negativamente por simple atracción electrostática.
Entonces, el complejo entra en la célula mediante endocitosis - un proceso por el cual moléculas de entrar en la célula a través de membrana-limite las vesículas llamadas endosomas.
Una vez dentro de la célula, los ácidos nucleicos debe escapar de la endosome por un proceso que aún se desconoce. Una vez fuera el endosome, los ácidos nucleicos se encuentran en el citoplasma de la célula y en última instancia el núcleo, donde maquinaria de la célula es capaz de hacer de mRNA y proteína de él. El citoplasma es el sitio de acción de la ARN interferente pequeño o siRNA donde se reduce la producción de proteínas por interferir con una parte de la maquinaria de producción de proteína de la célula.
Puede existir DNA transfected estable o transitorio. Transfecciones estables ocurren cuando transfected ADN se introduce en el genoma y por lo tanto persiste como la célula se divide. Transfecciones transitorias ocurren donde el ADN no se incorpora en el genoma y la expresión de la proteína codificada se pierde durante un lapso de 24-96 horas.
La eficiencia de la transfección de ADN generalmente se mide a través de sistemas de reportero que están atados al gen insertado. Son sistemas que pueden ser fácilmente detectados por observar directamente la proteína reportera, como en el caso de la proteína verde fluorescente, o mediante la medición de su actividad enzimática mediante un ensayo colorimétrico, como en el caso de una enzima luciferase reportero. Transfección de ADN estable se mide mejor por análisis genómico como RT-PCR.
Para medir el éxito de siRNA silenciamiento, los niveles de proteínas específicas en cada muestra pueden determinarse por el Immunoblot. SiRNA exitosa transfección debería disminuir la expresión de la proteína diana dentro de las células mientras que los niveles del gen housekeeping, GAPDH, permanecen estables.
Para maximizar la eficiencia de transfección, las células deben mantenerse en crecimiento de la fase de registro y estar entre 40 y 80% confluente, en el momento de la transfección. Para lograr esto, las células en cultivo deben ser cosechadas el día antes... contado... y las semillas en una placa de varios pocillos en una concentración que producirá el nivel correcto de confluencey en el momento de la transfección.
A continuación, los reactivos químicos y los ácidos nucleicos se mezclan y dados tiempo para formar los complejos de ácido nucleico-reactivo. Para cada sistema químico las concentraciones específicas de cada componente deben ser optimizadas.
Los complejos de ácido nucleico-reactivo entonces se agregan a las células plateadas e incubados a menudo durante la noche para dar suficiente tiempo para los complejos unir a las células y el mediato de la transfección. Después de 24 horas, los medios de comunicación deben ser eliminado y reemplazado con medio de cultivo fresco.
Existen muchas variaciones y aplicaciones de la transfección. La transfección puede permitir que un investigador estudiar el efecto de las mutaciones sin sentido en la función de proteínas celulares. Aquí, ARNi fue transfected en las células HeLa para abajo-regulan la proteína BRCA1 endógena, que causa una reducción en el número de células positivas de GFP. Al mismo tiempo una proteína mutante de BRCA1 también era transfectada y producida por la célula. Si la proteína mutada fue completamente funcional causó una recuperación en el número de células positivas de GFP, pero si la mutación afecta negativamente la función, entonces el número de células positivas de GFP se quedó baja.
Como alternativa a los métodos de transfección química, investigador, que se muestra a continuación, utiliza una pistola de genes para disparar partículas de oro con ADN en células en cultivo. Las células que terminan con las pequeñas balas recubierta de ADN dentro de su citoplasma tienen una buena oportunidad para ser transfectadas.
Otro método alternativo para la transfección es electroporación. La electroporación es el uso de corriente eléctrica para dañar la membrana celular permitiendo que la DNA o del RNA entrar en la célula por un corto tiempo antes de que las células tengan tiempo de reparación. Aquí, se colocan electrodos de pinza alrededor de un cerebro de ratón y pulsos cortos de electricidad pasan a través del cerebro para iniciar ex-vivo de la transfección de las moléculas de ARNi inyectadas dentro de la solución azul. Los efectos de silenciamiento en la estructura de la corteza en desarrollo del gen se observa a continuación.
Sólo ha visto video de Zeus de transfección. ¡Como siempre, gracias por ver!
Iniciar sesión o para acceder al contenido completo. Obtenga más información sobre el acceso de su institución al contenido de JoVE aquí
La transfección es el proceso de inserción de material genético, como el DNA y el RNA trenzado doble, en células de mamíferos. La inserción de DNA permite la expresión, o la producción de proteínas utilizando la maquinaria propia de las células. Considerando que la inserción de ARN de doble cadena se utiliza para cerrar la producción de una proteína específica deteniendo la traducción. Esta poderosa herramienta ha permitido a los investigadores estudian mejor función genética y expresión, función de la proteína y mutaciones genéticas.
No reactivo de transfección simple o método funciona para todos los tipos de la célula. Afortunadamente, muchos métodos y reactivos se han desarrollado en las últimas décadas para facilitar la transfección de una amplia variedad de células. Estos métodos se pueden dividir en dos grandes grupos: químicos y físicos transfecciones.
En este video, nos centraremos en los diferentes sistemas de administración química, como se han vuelto cada vez más común en los últimos años. Estos métodos incluyen enfoques basados en lípidos, fosfato de calcio mediada por transfección y el uso de polímeros catiónicos para nombrar unos pocos.
El principio subyacente de todos los métodos de transfección química son similares. Todos ellos hacen uso tan complejas de moléculas de portador de carga positiva con ácidos nucleicos para paquete para entrega celular. Estas moléculas de portador superan la carga negativa de la barrera de la membrana de la célula que les permite pasar a través de la membrana para ofrecer sus contenidos.
Transfección de lípidos, lípidos catiónicos forman un liposoma que luego combina con los ácidos nucleicos para formar una "complejo de transfección". Mientras que el fosfato de calcio simplemente se condensa el ADN y le da una carga positiva neta. Además, polímeros catiónicos como polyetheleneimine condensan el ADN en partículas con carga positiva.
El siguiente paso en la química de la transfección mediada es accesorio de los complejos cargados positivamente a la membrana celular cargada negativamente por simple atracción electrostática.
Entonces, el complejo entra en la célula mediante endocitosis - un proceso por el cual moléculas de entrar en la célula a través de membrana-limite las vesículas llamadas endosomas.
Una vez dentro de la célula, los ácidos nucleicos debe escapar de la endosome por un proceso que aún se desconoce. Una vez fuera el endosome, los ácidos nucleicos se encuentran en el citoplasma de la célula y en última instancia el núcleo, donde maquinaria de la célula es capaz de hacer de mRNA y proteína de él. El citoplasma es el sitio de acción de la ARN interferente pequeño o siRNA donde se reduce la producción de proteínas por interferir con una parte de la maquinaria de producción de proteína de la célula.
Puede existir DNA transfected estable o transitorio. Transfecciones estables ocurren cuando transfected ADN se introduce en el genoma y por lo tanto persiste como la célula se divide. Transfecciones transitorias ocurren donde el ADN no se incorpora en el genoma y la expresión de la proteína codificada se pierde durante un lapso de 24-96 horas.
La eficiencia de la transfección de ADN generalmente se mide a través de sistemas de reportero que están atados al gen insertado. Son sistemas que pueden ser fácilmente detectados por observar directamente la proteína reportera, como en el caso de la proteína verde fluorescente, o mediante la medición de su actividad enzimática mediante un ensayo colorimétrico, como en el caso de una enzima luciferase reportero. Transfección de ADN estable se mide mejor por análisis genómico como RT-PCR.
Para medir el éxito de siRNA silenciamiento, los niveles de proteínas específicas en cada muestra pueden determinarse por el Immunoblot. SiRNA exitosa transfección debería disminuir la expresión de la proteína diana dentro de las células mientras que los niveles del gen housekeeping, GAPDH, permanecen estables.
Para maximizar la eficiencia de transfección, las células deben mantenerse en crecimiento de la fase de registro y estar entre 40 y 80% confluente, en el momento de la transfección. Para lograr esto, las células en cultivo deben ser cosechadas el día antes... contado... y las semillas en una placa de varios pocillos en una concentración que producirá el nivel correcto de confluencey en el momento de la transfección.
A continuación, los reactivos químicos y los ácidos nucleicos se mezclan y dados tiempo para formar los complejos de ácido nucleico-reactivo. Para cada sistema químico las concentraciones específicas de cada componente deben ser optimizadas.
Los complejos de ácido nucleico-reactivo entonces se agregan a las células plateadas e incubados a menudo durante la noche para dar suficiente tiempo para los complejos unir a las células y el mediato de la transfección. Después de 24 horas, los medios de comunicación deben ser eliminado y reemplazado con medio de cultivo fresco.
Existen muchas variaciones y aplicaciones de la transfección. La transfección puede permitir que un investigador estudiar el efecto de las mutaciones sin sentido en la función de proteínas celulares. Aquí, ARNi fue transfected en las células HeLa para abajo-regulan la proteína BRCA1 endógena, que causa una reducción en el número de células positivas de GFP. Al mismo tiempo una proteína mutante de BRCA1 también era transfectada y producida por la célula. Si la proteína mutada fue completamente funcional causó una recuperación en el número de células positivas de GFP, pero si la mutación afecta negativamente la función, entonces el número de células positivas de GFP se quedó baja.
Como alternativa a los métodos de transfección química, investigador, que se muestra a continuación, utiliza una pistola de genes para disparar partículas de oro con ADN en células en cultivo. Las células que terminan con las pequeñas balas recubierta de ADN dentro de su citoplasma tienen una buena oportunidad para ser transfectadas.
Otro método alternativo para la transfección es electroporación. La electroporación es el uso de corriente eléctrica para dañar la membrana celular permitiendo que la DNA o del RNA entrar en la célula por un corto tiempo antes de que las células tengan tiempo de reparación. Aquí, se colocan electrodos de pinza alrededor de un cerebro de ratón y pulsos cortos de electricidad pasan a través del cerebro para iniciar ex-vivo de la transfección de las moléculas de ARNi inyectadas dentro de la solución azul. Los efectos de silenciamiento en la estructura de la corteza en desarrollo del gen se observa a continuación.
Sólo ha visto video de Zeus de transfección. ¡Como siempre, gracias por ver!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between transfecting DNA and RNA into cells?
DNA transfection enables protein expression using the cell's machinery, while RNA transfection, particularly double-stranded RNA or siRNA, shuts down specific protein production by stopping translation. DNA must reach the nucleus for effective expression, whereas RNA acts in the cytoplasm. DNA can be stably incorporated into the genome or transiently expressed, while RNA effects are temporary.
Q2: How do chemical transfection methods deliver genetic material into cells?
Chemical transfection uses positively charged carrier molecules—such as cationic lipids, calcium phosphate, or polymers—that complex with negatively charged nucleic acids. These complexes attach to the negatively charged cell membrane through electrostatic attraction, then enter via endocytosis in membrane-bound vesicles called endosomes. The nucleic acids escape the endosome and reach their destination in the cytoplasm or nucleus.
Q3: What cell conditions optimize transfection efficiency?
Cells should be in log phase growth and between 40 and 80% confluent at transfection time. Prepare cells by harvesting them the day before, counting them, and seeding at appropriate concentration. After adding nucleic acid-reagent complexes, incubate overnight to allow attachment and transfection. Replace media with fresh culture after 24 hours to support cell recovery and gene expression.
Q4: How is transfection efficiency measured in cells?
Reporter systems tethered to inserted genes measure DNA transfection efficiency. Green fluorescent protein can be directly observed, while luciferase enzyme activity is measured using colorimetric assays. Stable transfection is verified by genomic analysis such as RT-PCR. For siRNA silencing success, immunoblot analysis determines target protein levels; successful transfection decreases target protein while housekeeping genes like GAPDH remain stable.
Q5: What is the difference between stable and transient transfection?
Stable transfection occurs when transfected DNA integrates into the genome and persists through cell division, creating permanent genetic changes. Transient transfection involves DNA that remains outside the genome, resulting in temporary protein expression lasting 24 to 96 hours before being lost. Stable transfection is measured by genomic analysis, while transient effects are detected through reporter systems.
Q6: What are alternative physical methods for transfecting cells?
Electroporation uses electrical current to temporarily damage the cell membrane, allowing DNA or RNA entry before cells repair. A gene gun fires gold particles coated with DNA directly into cells; particles reaching the cytoplasm enable transfection. These physical methods complement chemical approaches and are useful for cell types resistant to chemical reagents or for in vivo applications like brain tissue transfection.
Q7: How can co-transfection be used to study protein mutations?
Co-transfection simultaneously introduces interfering RNA and mutant DNA into the same cell. RNAi down-regulates the endogenous protein while the transfected mutant version is produced. Comparing functional outcomes—such as recovery of fluorescent reporter signals—reveals whether the mutation preserves or impairs protein function. This approach enables direct assessment of mutation effects on cellular processes.