2.13: Reacciones de ligación de ADN

La ligadura se puede definir como el acto de unirse, y en biología el término se refiere a una reacción enzimática que une dos biomoléculas con un enlace covalente. Este video describe la aplicación de la ligadura de ADN en la investigación en biología molecular.

En la célula, las ligasas de ADN son enzimas que identifican y sellan roturas en el ADN catalizando la formación de enlaces fosfodiéster entre los grupos 3?-hidroxilo y 5?-fosfato de la columna vertebral del ADN. La ligadura se produce como parte de los procesos celulares normales, como la replicación del ADN, para reparar las roturas de ADN de cadena simple y doble.

En el laboratorio, las ligasas de ADN se utilizan de forma rutinaria en la clonación molecular, un proceso que une fragmentos de ADN digeridos por endonucleasa, o insertos, con un vector digerido por endonucleasa, como un plásmido, para que el fragmento pueda introducirse en las células huésped y luego replicarse.

Las digestiones de endonucleasas implican el uso de endonucleasas de restricción, o enzimas de restricción, que crean muescas en tramos específicos del ADN.

Estas muescas pueden parecerse a roturas de una sola hebra que producen 3? ¿Y 5? voladizos, llamados extremos pegajosos o roturas de doble hebra sin voladizos, llamados extremos romos. La ligadura de los extremos pegajosos es ventajosa, ya que los pares de bases que sobresalen complementarios estabilizan la reacción. Debido a que las ligaduras de extremo romo no tienen ningún emparejamiento de bases complementario, la ligadura es menos eficiente y más difícil para que la enzima se una a los extremos. Los extremos pegajosos y romos no pueden, en circunstancias normales, ligarse entre sí.

Sin embargo, el fragmento de Klenow, el producto de la ADN polimerasa 1, digerido con subtilisina puede convertir los extremos pegajosos en extremos romos. Klenow posee 3? a 5? actividad de la exonucleasa que mastica 3? voladizos y actividad de la polimerasa que atenua los voladizos 5?al extender los voladizos 3? fin del capítulo complementario.

Cuando el objetivo es insertar un gen en un plásmido, el resellado del ADN del vector, llamado autoligadura, es un resultado indeseable común para una reacción de ligadura. El tratamiento con fosfatasa alcalina del ADN vectorial después de la digestión elimina los 5'fosfatos en ambos extremos y evita este resultado indeseable.

Como mencionamos anteriormente, los ADN vectoriales y de inserción se digieren con endonucleasas antes de comenzar una ligadura. Después de la purificación en gel del vector digerido y el inserto, las concentraciones de ADN se miden con un espectrofotómetro para determinar la concentración del vector purificado y el inserto.

A partir de esta concentración, el número de moléculas de inserto o vector en 1 μl se puede determinar en función del peso molecular promedio de un par de bases de ADN y el número de pares de bases en cada fragmento. Sobre la base de la concentración molecular calculada del vector y el inserto, se calcula una relación de 3 a 1 entre el inserto y el vector, para determinar el volumen del vector y el inserto utilizados en la reacción. Esta proporción de 3 a 1 entre el inserto de ADN y el vector es deseable, ya que aumenta la probabilidad de que el inserto se lige en el vector frente al propio ligado vectorial.

Ahora que hemos determinado la cantidad de vector e inserto de ADN que se utilizará en la reacción, procedemos a configurar la reacción de ligadura en hielo. El orden de adición de los componentes de reacción que se deben agregar a su tubo de microfuga es el siguiente: agua estéril suficiente para hacer un volumen final de 10 μl, en nuestro caso usaremos 4 μl, 1 μl 10X de tampón de ligadura, 1 μl 10 mM de ATP, 1 μl de vector y 3 μl de ADN de inserción, según lo calculado, y finalmente 1 ?l ADN ligasa. La reacción se mezcla completamente, se centrifuga y se incuba a la temperatura adecuada.

Ya sea que esté haciendo una ligadura pegajosa o roma, el extremo afecta la temperatura y la duración de la reacción de ligadura. Por ejemplo, una ligadura de extremos pegajosos con un voladizo de seis pares de bases se puede llevar a cabo cerca de la temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora, porque los extremos complementarios estabilizan la unión de los fragmentos. Los voladizos cortos o las ligaduras de extremo romo deben realizarse entre 14 y 20? C durante la noche.

Ahora que hemos aprendido a configurar una reacción de ligadura, echemos un vistazo a algunas de las aplicaciones de este procedimiento.

Las ligaduras se pueden utilizar para insertar directamente fragmentos amplificados por PCR en plásmidos linealizados. Aquí se ve a un investigador tomando una muestra de cerebro de ratón congelado, aislando el ADN genómico de él y luego sometiéndolo a una PCR de bisulfito, que es un método basado en PCR para detectar ADN metilado. Luego, los productos de PCR se ligan directamente al plásmido para crear una biblioteca de genes que se metilan en esa región particular del cerebro.

Las ligaduras se pueden utilizar para unir enlazadores de oligonucleótidos, que contienen sitios de unión para los cebadores de PCR, para purificar fragmentos de ADN. Al trabajar con muestras de tumores, los científicos pueden utilizar este enfoque para secuenciar el ADN genómico del tumor, con la esperanza de identificar las mutaciones que causan tumores.

En este video, la ligadura se realiza en ADN aislado de células fijadas en formaldehído y posteriormente se trata con una enzima de restricción y klenow en presencia de biotina, que luego se usa para extraer el ADN ligado. A continuación, este ADN se amplifica mediante PCR y los productos se secuencian para identificar las interacciones de la cromatina a varias escalas, como se muestra.

Ahora ha aprendido sobre la ADN ligasa, varios principios involucrados en la configuración de la ligadura en el laboratorio, posibles problemas y soluciones y varias aplicaciones de la ligadura en la investigación en biología molecular. Gracias por mirar.