Clonación molecular

Molecular Cloning

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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Molecular Cloning

2.2: Gel Purification

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09:55 min

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February 01, 2013

Overview

Clonación molecular es un conjunto de métodos que se utilizan para introducir ADN recombinante en un vector – un portador de las moléculas de ADN que se replican fragmentos de ADN recombinante en los organismos huésped. El fragmento de ADN, que puede ser un gen, puede ser aislado de un espécimen de procariota o eucariota. Tras aislamiento del fragmento de interés, o insertar, el vector y el inserto deben ser corte con enzimas de restricción y purificados. Las piezas purificadas se unen entre sí, aunque una técnica llamada ligadura. La enzima que cataliza la reacción de la ligadura es conocida como ligasa.

Este video explica los principales métodos que se combinan, en tándem, por el procedimiento de clonación molecular en general. Se discuten los aspectos críticos de la clonación molecular, como la necesidad de la estrategia de clonación molecular y cómo hacer un seguimiento de colonias de bacterias transformadas. También se mencionan los pasos de verificación, como comprobación de plásmido purificado para la presencia del inserto con resúmenes de la restricción y la secuenciación.

Procedure

Clonación molecular es un conjunto de técnicas utilizadas para introducir ADN recombinante de una fuente de procariota o eucariota en un vehículo de replicación como plásmidos o vectores virales. La clonación se refiere a hacer numerosas copias de un fragmento de ADN de interés, como un gen. En este video usted aprenderá sobre los diferentes pasos de la clonación molecular, cómo se establece el procedimiento, y diferentes aplicaciones de esta técnica.

Al menos dos importantes moléculas de ADN se requieren antes de que comience la clonación. En primer lugar y lo más importante, necesita el fragmento de ADN que vas a clonar, conocido como el relleno. Puede provenir de una célula procariota, eucariotas, un organismo extinto, o puede ser creado artificialmente en el laboratorio. Mediante el uso de clonación molecular podemos aprender más acerca de la función de un gen en particular.

En segundo lugar, usted necesita un vector. Un vector es la DNA del plasmid utilizado como herramienta en biología molecular para hacer más copias del o producir una proteína de un gen determinado. Plásmidos son un ejemplo de un vector y son circulares, extra cromosómico DNA que se replica por las bacterias.

Un plásmido tiene típicamente un sitio múltiple de clonación o MCS, esta zona contiene sitios de reconocimiento para diferentes endonucleasas de restricción también conocido como enzimas de restricción. Diversos partes movibles pueden ser incorporados en el plásmido por una técnica llamada ligadura. El vector plásmido también contiene un origen de replicación, que le permite replicarse en bacterias. Además, el plásmido tiene un gen de antibiótico. Si las bacterias incorporan el plásmido, sobrevivirá en los medios de comunicación que contiene el antibiótico. Esto permite la selección de bacterias que se han transformado con éxito.

El inserto y el vector son clonados en un organismo de la célula huésped, el más común utilizado en la clonación molecular es e. coli. E. coli crece rápidamente, es ampliamente disponible y tiene numerosos vectores de clonación diferentes producidos comercialmente. Eucariotas, como la levadura puede usarse como organismos de acogida para vectores.

El primer paso en el procedimiento de clonación molecular general es obtener la inserción deseada, que puede derivarse de DNA o mRNA de cualquier tipo de célula. El vector óptimo y su organismo de acogida están entonces elegido basado en tipo de relleno y, en definitiva, qué se hará con él. Una reacción en cadena de polimerasa, o PCR basado en método a menudo se utiliza para replicar el inserto.

Luego mediante el uso de una serie de reacciones enzimáticas, el insertar digest se unieron e introducida en el organismo del anfitrión para la replicación masiva. Vectores replicadas son purificados de bacterias y después de la digestión de la restricción, analizado en un gel. Fragmentos purificados de gel son enviados más tarde para que la secuencia comprobar que el margen es el fragmento de ADN deseado.

Vamos a haber un poco más detallado vistazo en clonación molecular cómo se lleva a cabo. Antes de empezar, tendrá que planificar su estrategia de clonación, antes de hacer cualquier clonación intento en el Banco. Por ejemplo, cualquier vector plásmido determinado, le proporcionará un número finito de sitios de restricción para incorporar el relleno a través del sitio de clonación múltiple. Usted necesitará elegir sitios de restricción que no se encuentran en su dispositivo para que usted no lo hiende. Usted podría dejarse con una situación que se ven obligados a unirse a un fragmento del extremo romo con uno que tiene un saliente. Caso, utilizando el fragmento klenow para configurar una ligadura del extremo romo podría ser su única opción para obtener el inserto en el vector deseado. Comprensión de la diversas molecular clonación herramientas a su disposición, así como dar con una estrategia cuidadosa antes de comenzar la clonación puede ser un ahorro de tiempo inmenso.

La fuente de ADN para clonación molecular puede ser aislada de casi cualquier tipo de célula o tejido muestra a través de técnicas de extracción simple. Una vez aislado, PCR puede utilizarse para amplificar la inserción.

Una vez que el inserto es amplificado junto con el vector son digeridos por enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas de restricción.

Una vez digerido, el inserto y el vector pueden correr en un gel y purificadas por un proceso llamado purificación del gel. Con respecto al vector, este paso le ayudará a purificar el plásmido linearizado de plásmido sin cortar, que tiende a aparecer como un borrón de transferencia de alto peso molecular en un gel.

Después de los resúmenes de la purificación del gel, el prospecto es ligado o unido a los plásmidos, mediante una enzima llamada ADN ligasa.

En términos generales, siempre es una buena idea configurar trompas, por lo que la proporción de insertar a vector es 3 a 1, que asegura que sólo una pequeña cantidad del vector de uno mismo-se liga. Una vez que la ligadura se ha establecido en el hielo, se incuba en cualquier lugar de 14-25 ° c de 1 hora hasta toda la noche.

A continuación, transformación se realiza para introducir el vector plásmido en el host que se replicarlo.

Siguientes bacterias de transformación son revestidas en placas de agar con antibióticos y se incubó durante la noche a 37° C. Porque el plasimid contiene un gen de resistencia a los antibióticos, transformación exitosa producirá colonias bacterianas cuando se cultivan en placas de agar en la presencia de antibióticos. Colonias individuales se pueden recoger la placa transformada, en medios de cultivo líquidos en los tubos numerados y poner en un incubador de agitación para la expansión. Un pequeño volumen de cultivo líquido se agrega a una placa de agar numeradas, mientras que el resto de la cultura pasa a purificación del plásmido. El esquema de numeración que indica la identidad de colonias bacterianas que los plásmidos eventualmente serán purificada se mantiene durante todo el proceso de purificación del plásmido.

Un ejemplo de plásmido purificado se corta con enzimas de restricción. El Resumen entonces se carga y ejecuta en el gel con el fin de comprobar la presencia del inserto, que verificará que la Colonia bacteriana fue transformada con un plásmido que contiene un inserto y plásmido no auto ligado. Las bacterias verificadas que han sido transformadas con un plásmido que contiene el inserto, se amplían para la posterior purificación del plásmido. La secuencia se utiliza como un paso de verificación final para confirmar que ha sido clonado el gen de interés.

Clonación molecular puede ser utilizada para un número casi ilimitado de aplicaciones. Por ejemplo, cuando una plantilla del mRNA es revés transcrito a cDNA de forma, o ADN complementario, por una enzima llamada transcriptasa reversa y PCR permite amplificar cDNA, clonación molecular puede utilizarse para crear una biblioteca del cDNA-una biblioteca de todos los genes expresada por un tipo celular determinado.

La clonación molecular se puede también emplear para tomar una serie de genes, o racimo del gene de una cepa bacteriana, reorganizar en plásmidos que se transforman en otra cepa, por lo que puede crearse un todo camino biosintético para producir una molécula compleja.

A través de la clonación molecular, puede generarse una biblioteca mutante expresando un plásmido de destino en una cepa bacteriana especial que utiliza una polimerasa propensa a error cuando se cultivan en ciertas temperaturas. Las mutaciones pueden caracterizarse por la secuencia. Las bacterias transformadas con genes mutantes se pueden probar entonces con diferentes drogas o productos químicos para ver que colonias de bacterias han evolucionado para tener resistencia a los medicamentos.

Gracias a la clonación molecular, genes reporteros pueden ser incorporados en plásmidos de ADN, un gen reportero común es proteína verde fluorescente o GFP, que emite una fluorescencia verde cuando se expone a la luz UV. Un gen reportero puede también insertarse en un alphavirus para demostrar infección en los mosquitos y transmisibilidad en las células.

Sólo ha visto video de JoVEs en la clonación molecular. Ahora debería entender cómo moleculares clonación obras y cómo se puede utilizar la técnica de biología molecular. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

Molecular cloning is a set of techniques used to insert recombinant DNA from a prokaryotic or eukaryotic source into a replicating vehicle such as plasmids or viral vectors. Cloning refers to making numerous copies of a DNA fragment of interest, such as a gene. In this video you will learn about the different steps of molecular cloning, how to set up the procedure, and different applications of this technique.

At least two important DNA molecules are required before cloning begins. First, and most importantly, you need the DNA fragment you are going to clone, otherwise known as the insert. It can come from a prokaryote, eukaryote, an extinct organism, or it can be created artificially in the laboratory. By using molecular cloning we can learn more about the function of a particular gene.

Second, you need a vector. A vector is plasmid DNA used as a tool in molecular biology to make more copies of or produce a protein from a certain gene. Plasmids are an example of a vector, and are circular, extra chromosomal, DNA that is replicated by bacteria.

A plasmid typically has a multiple cloning site or MCS, this area contains recognition sites for different restriction endonucleases also known as restriction enzymes. Different inserts can be incorporated into the plasmid by a technique called ligation. The plasmid vector also contains an origin of replication, which allows it to be replicated in bacteria. In addition, the plasmid has an antibiotic gene. If bacteria incorporate the plasmid, it will survive in media that contains the antibiotic. This allows for the selection of bacteria that have been successfully transformed.

The insert and vector are cloned into a host cell organism, the most common used in molecular cloning is E. coli. E. coli grows rapidly, is widely available and has numerous different cloning vectors commercially produced. Eukaryotes, like, yeast can also be used as host organisms for vectors.

The first step of the general molecular cloning procedure is to obtain the desired insert, which can be derived from DNA or mRNA from any cell type. The optimal vector and its host organism are then chosen based they type of insert and what will ultimately be done with it. A polymerase chain reaction, or PCR based method is often used to replicate the insert.

Then by using a series of enzymatic reactions, the insert and digest are joined together and introduced into the host organism for mass replication. Replicated vectors are purified from bacteria, and following restriction digestion, analyzed on a gel. Gel-purified fragments are later sent for sequencing to verify that the inset is the desired DNA fragment.

Let’s have a little more detailed look at how molecular cloning is conducted. Before beginning, you will want to plan out your cloning strategy, prior to making any cloning attempt at the bench. For example, any given plasmid vector, will provide you with a finite number of restriction sites to incorporate the insert via the multiple cloning site. You’ll need to choose restriction sites that are not found in your insert so that you do not cleave it. You might be left with a situation where you are forced to join a blunt end fragment with one that has an overhang. If so, then using the klenow fragment to set up a blunt end ligation might be your only option to get the insert into your desired vector. Understanding the various molecular cloning tools at your disposal, as well as coming up with a careful strategy before you begin cloning can be an immense time saver.

The source of DNA for molecular cloning can be isolated from almost any type of cell or tissue sample through simple extraction techniques. Once isolated, PCR can be used to amplify the insert.

Once the insert is amplified both it and the vector are digested by restriction enzymes, also known as restriction endonucleases.

Once digested, the insert and vector can be run on a gel and purified by a process called gel purification. With respect to the vector, this step will help to purify linearized plasmid from uncut plasmid, which tends to appear as a high molecular weight smear on a gel.

After gel purifying the digests, the insert is ligated or joined to the plasmid, via an enzyme called DNA ligase.

Generally speaking, it is always a good idea to set up ligations, so that the ratio of insert to vector is 3 to 1, which ensures that only a small amount of vector will self-ligate. Once the ligation has been set up on ice, it is incubated anywhere from 14-25˚C from 1 hr to overnight.

Next, transformation is performed to introduce the plasmid vector into the host that will replicate it.

Following transformation bacteria are plated on agar plates with antibiotic and incubated overnight at 37°C. Because the plasimid contains an antibiotic resistance gene, successful transformation will produce bacterial colonies when grown on agar plates in presence of antibiotics. Individual colonies can then be picked from the transformed plate, placed into liquid growth media in numbered tubes, and put into a shaking incubator for expansion. A small volume of liquid culture is added to a numbered agar plate, while the rest of the culture moves on to plasmid purification. The numbering scheme that denotes the identity of bacterial colonies from which the plasmids will eventually be purified is maintained throughout the plasmid purification process.

A sample of purified plasmid is then cut with restriction enzymes. The digest is then loaded and run on the gel in order to check for the presence of insert, which will verify that the bacterial colony was transformed with a plasmid containing an insert and not self-ligated plasmid. Bacteria verified to have been transformed with an insert-containing plasmid, are expanded for further plasmid purification. Sequencing is used performed as a final verification step to confirm that your gene of interest has been cloned.

Molecular cloning can be used for a near limitless number of applications. For instance, when an mRNA template is reverse transcribed to form cDNA, or complementary DNA, by an enzyme called reverse transcriptase and then PCR is used to amplify the cDNA, molecular cloning can be used to create a cDNA library – a library of all of the genes expressed by a given cell type.

Molecular cloning can also be employed to take a series of genes, or gene cluster from one bacterial strain, reorganize them into plasmids that are transformed in another strain, so an entire biosynthetic pathway can be recreated to produce a complex molecule.

Through molecular cloning, a mutant library can be generated by expressing a target plasmid in a special bacterial strain that uses an error prone polymerase when cultured at certain temperatures. The mutations can be characterized by sequencing. Bacteria transformed with mutant genes can then be tested with different drug or chemicals to see which bacterial colonies have evolved to have drug resistance.

Thanks to molecular cloning, reporter genes can be incorporated into DNA plasmids, a common reporter gene is green fluorescent protein or GFP, which emits a green fluorescence when exposed to UV light. A reporter gene can also be inserted into an alphavirus to show infection in mosquitoes and transmissibility in cells.

You’ve just watched JoVEs video on molecular cloning. You should now understand how molecular cloning works and how the technique can be used in molecular biology. As always, thanks for watching!

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Molecular Cloning Recombinant DNA Prokaryotic Eukaryotic Replicating Vehicle Plasmids Viral Vectors Gene Cloning DNA Fragment Insert Function Of A Gene Vector Multiple Cloning Site Restriction Endonucleases Ligation Origin Of Replication Antibiotic Gene